荧光定量PCR专题报告

1、植物荧光定量植物荧光定量PCRPCR技术技术Real Time Quantitative PCR on Plants主要内容常规常规PCR技术简单回顾技术简单回顾实时荧光定量实时荧光定量PCR技术的发展技术的发展实时荧光定量实时荧光定量PCR技术的原理技术的原理实时荧光定量实时荧光定量PCR技术常用方法技术常用方法实时荧光定量实时荧光定量PCR技术在植物上的应用技术在植物上的应用常规常规PCR技术简单回顾技术简单回顾1983 Cetus 公司的 K. Mullis在这年底（12月16日第一次成功实验）发明了PCR（Polymerase Chain Reaction，PCR） 。1953-DNA

2、 双螺旋结构1958-DNA半保留复制1971-体外扩增设想1976-taq DNA聚合酶1988-1989-“分子年”1993-诺贝尔奖PCR? PCRPCR只是一个简单的不起眼玩艺只是一个简单的不起眼玩艺 凯利穆利斯（Kary Mullis) PCRPCR只是一个概念，所发生的奇迹是：只是一个概念，所发生的奇迹是：PCRPCR概概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为新的概念。熟的技术，后者又上升成为新的概念。 它最大的特点就是能不断推出新形式它最大的特点就是能不断推出新形式。 摘自Making PCR: A Story of

3、Biotechnology by Paul Rabinow 对对PCR扩增反应的扩增反应的终点产物终点产物可进行定量可进行定量 和定性分析但无法对起始模板准确定量，无和定性分析但无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测法对扩增反应实时检测（传统定量）（传统定量）几种传统定量几种传统定量PCR 1 内参照法内参照法 2 竞争法竞争法 3 PCRELISA法法由于由于传统定量方法都是终点检测传统定量方法都是终点检测，即，即PCR到达平台期后进行检测，而到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在

4、96孔孔PCR仪仪上做上做96次重复实验，所得结果有很大差异，因此无法直接从终点产物量推算次重复实验，所得结果有很大差异，因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。实时荧光定量实时荧光定量PCR仪于仪于1996年年由美国由美国Applied Biosystems公司公司推出推出 实时荧光定量实时荧光定量PCR技术应运而生技术应运而生 在实时荧光定量在实时荧光定

5、量PCR技术的发展过程中，技术的发展过程中，两个重要的发现起着关键的作用两个重要的发现起着关键的作用: 1.在在90年代早期，年代早期，Taq DNA多聚酶的多聚酶的5核酸外核酸外切酶活性的发现，它能降解特异性荧光记探针，切酶活性的发现，它能降解特异性荧光记探针，因此使得间接的检测因此使得间接的检测PCR产物成为可能。产物成为可能。 2. 此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。应管中能实时地监测反应全过程。这两个发现的结合以及相应的仪器和这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化发展导致试剂的商品化发展导致real-time

6、 FQ-PCR方法在研究工作中的运用。方法在研究工作中的运用。Real-time instruments Applied Biosystems: Bio-Rad/MJ Research: Cepheid: Corbett Research: Eppendorf: Roche: LightCycler 1.5/480(罗氏罗氏) Stratagene:实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的特点的特点 特异性更强 灵敏度高 可直接对产物进行定量 解决PCR污染问题 自动化程度高、操作简单实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术技术(real-time FQ-PCR ) ： 在在PCR反应体系中加入

7、反应体系中加入荧光基团荧光基团,利用利用荧光信荧光信号的变化实时检测号的变化实时检测PCRPCR扩增反应中扩增反应中每一个循环扩每一个循环扩增产物量的变化增产物量的变化，最后通过最后通过CtCt值值和和标准曲线标准曲线的分的分析对未知析对未知起始模板起始模板进行进行定量分析。定量分析。实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理介绍四个概念：介绍四个概念： 扩增曲线扩增曲线、荧光阈值荧光阈值、CtCt值值、标准曲线标准曲线如何对起始模板定量？如何对起始模板定量？通过通过Ct值和标准曲线对值和标准曲线对起始模板起始模板进行定量分析进行定量分析扩增曲线扩增曲线扩增曲线图：扩增曲线图： 横坐标：横坐

8、标：扩增循环数（扩增循环数（CycleCycle）；）；纵坐标：纵坐标：荧光荧光强度强度 每个循环进行一次荧光信号的收集每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光基团荧光检测元件荧光检测元件荧光阈值荧光阈值荧光信号的域值荧光信号的域值 （threshold threshold ）：q 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值q 荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍q 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99q 真正的信号:荧光信号超过域

9、值CtCt值（值（CqCq）CtCt值的定义值的定义： PCRPCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增的阈值时所经过的扩增循环次数循环次数, , 起始拷贝数越多，起始拷贝数越多，CtCt值越小值越小.-Cq.-CqC(t) value CtCt值的重现性值的重现性横轴：横轴：PCR反映循环数反映循环数纵轴：荧光信号量纵轴：荧光信号量CtCt值的特点值的特点： 相同模板进行相同模板进行9696次扩增，终点处产物量不恒定；次扩增，终点处产物量不恒定； CtCt值则极具重现性值则极具重现性理想的PCR反应： X=X0*2n非理想的PCR反

10、应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率定量反应原理的数学依据定量反应原理的数学依据在扩增产物达到阈值线时在扩增产物达到阈值线时: : X XCtCt=X=X0 0 (1+Ex)(1+Ex)CtCt =M (1) =M (1) X XCtCt: :荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. . 在阈值线设定以后在阈值线设定以后, ,它是一个常数它是一个常数, ,我们设为我们设为MM方程式方程式(1)(1)两边同时取对数得两边同时取对数得: : log M=log X log M=log

11、 X0 0 (1+Ex)(1+Ex)CtCt (2) (2)整理方程式整理方程式(2)(2)得得: : log X log X0 0= - log(1+Ex) = - log(1+Ex) * *Ct+ log M (3)Ct+ log M (3) LogLog浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量就可计算出样品中所含的模板量- - 标准曲线标准曲线q 模板模板DNADNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即量越多，荧光达到域值的循环数越少，即CtCt值越小值越小q LogLog浓度与循环数呈线性关系，通过

12、已知起始拷贝数的浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品标准品可作出标准曲线，根据样品CtCt值，就可以计算出样值，就可以计算出样品中所含的模板量品中所含的模板量非特异性荧光标记：非特异性荧光标记： 1、 SYBR Green Green 特异性荧光标记特异性荧光标记： 2 2、TaqManTaqMan（间接法）（间接法） 3 3、Molecular BeaconMolecular Beacon（直接法）（直接法） 实时荧光定量PCR的几种常用方法实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 方法方法 1 -SYBR Green 1 -SYBR Green 法法SY

13、BR Green SYBR GreenSYBR Green法工作机理法工作机理q SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位q SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光q 变性时，DNA双链分开，无荧光q 复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。SYBR Green 5353SGNo EmissionSGSGSGExcitationExcitationSYBR Green法 工作机理SGSGSGSGSGSGSG5353EmissionExcitationExcitationSYBR Green ISYBR Green I熔解曲线分

14、析熔解曲线分析温度温度荧光强度荧光强度TmSYBR Green I SYBR Green I 熔解曲线分析熔解曲线分析-dIdTTmSYBR Green SYBR Green 法法 熔解曲线分析熔解曲线分析熔解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确熔解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确非特异性产非特异性产物物SYBR Green SYBR Green 法法 应用范围应用范围q 起始模板的测定q 基因型的分析q 熔解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。SYBR Green S

15、YBR Green 法法 优缺点优缺点 q 对DNA模板没有选择性 -适用于任何DNAq 使用方便 -不必设计复杂探针q 非常灵敏q 便宜优 点q 容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性 但可以通过熔解曲线的分析，优化反应条件q 对引物特异性要求较高缺 点与目标序列互补实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 方法方法2 -TaqMan2 -TaqMan探针法探针法TaqMan-水解型杂交探针v 5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 v 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)v 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光v

16、 Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针每扩增一条每扩增一条DNADNA分子，释放一个分子，释放一个荧光信号，可以荧光信号，可以在循环过程中任在循环过程中任一点检测荧光一点检测荧光TaqManTaqMan探针法探针法 工作原理工作原理实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 方法方法 3 3Molecular beacon Molecular beacon 法法( (分子信标分子信标) )标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补茎由互补配对序列组成环茎荧光素 淬灭剂Molecular beacon (Molecular beacon (分子信标分子信标) ) 工作原理工作原理FRET RQ RQ

17、DNA模板模板分子信标探针分子信标探针 荧光共振能量转移（荧光共振能量转移（FRETFRET） 探针与探针与DNADNA杂交时产生荧光杂交时产生荧光 -变性过程：产生非特异性荧光变性过程：产生非特异性荧光 -延伸过程：不产生荧光延伸过程：不产生荧光 -退火过程：产生特异性荧光，退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号检测荧光信号Molecular beacon (Molecular beacon (分子信标分子信标) ) 应用范围应用范围 q 起始模板的定量q 基因型分析q 产物鉴定q SNP（单核苷酸多态性）分析Molecular beacon (Molecular beacon (分子信标分

18、子信标) ) 优缺点优缺点q高特异性：高特异性：对目标序列 检测SNP最灵敏的试剂之一q荧光背景低荧光背景低优 点q 只能用于一个特定目标q 设计困难q 价格比较高缺 点实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 方法比较方法比较方法优点缺点适用范围SYBR Green I 法适用性广灵敏方便便宜引物要求高易出现非特异性带适合科研中对各种目的基因定量分析，基因表达量的研究，转基因重组动植物的研究TaqMan 法特异性高重复性好价格高只适合特定目标病原体检测，疾病耐药基因研究,药物疗效考核遗传疾病的诊断Molecular Beacon法(分子信标)高特异性荧光背景低只适合特定目标设计困难价格高特定

19、基因分析SNP分析Sample实时荧光定量PCR模板定量策略1绝对定量25实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR中的标准曲线标准品中的标准曲线标准品 化学合成目的基因化学合成目的基因 将将PCRPCR扩增产物直接梯度稀扩增产物直接梯度稀释释 已知拷贝数的质粒已知拷贝数的质粒DNA和看和看家基因家基因的的RNA 纯度高，定量准确受化学合成工艺限制，只能合成120bp以下长度方便、简单，不准确、不稳定；稳定，准确,可以校准目的基因表达水平 获得含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒或获得含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒或cDNAcDNA 紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度紫外分光光度计或荧光酶标测定

20、浓度 根据质粒或根据质粒或cDNAcDNA分子量换算成拷贝数，做系列稀释分子量换算成拷贝数，做系列稀释 通常外标由通常外标由45个点组成，模板的浓度分别为个点组成，模板的浓度分别为107/ml、106/ml、105/ml、104/ml、103/ml。DNADNA质量质量（g）拷贝数拷贝数DNADNA摩尔质量摩尔质量6.021023标准品的设定标准品的设定实时荧光定量PCR模板定量策略2相对定量 标准曲线相对定量法 可在比较不同样品之间的RNA相对表达丰度时可采用 比较CT相对定量法（Comparative Delta-delta Ct ） 该方法与标准曲线相对定量法的不同之处于在于其运用了数学

21、公式来计算相对量。根据的是在PCR反应的指数期得到CT值来计算起始模板的量。 如何设计植物实时荧光定量如何设计植物实时荧光定量PCRPCR实验方案？实验方案？查找植物基因查找植物基因序列序列设计引物探针设计引物探针选择荧光定量方法选择荧光定量方法引物探针合成标记引物探针合成标记制备标准品制备标准品配制反应液配制反应液设定反应条件设定反应条件设定基线，数据分析设定基线，数据分析Quantification and detection of relative gene expression at different developmental stages during longan SETech

22、nology: Real-Time PCR, SYBR GREENApparatus：ROCHE lightcycler 1.5Materials： Friable EC, incomplete tight EC, tight EC, globular embryo, cotyledonary embryoLongan FECGlobular Embryos Longan FEC(1) 龙眼体胚发生过程中内参基因的筛选龙眼体胚发生过程中内参基因的筛选Amplification efficiency of MSD Slope= -3.350 Intercept= 36.97 r= -1.00 M

23、n-SOD and Cu-Zn/SOD play a key role in promoting embryogenic callus differentiation and early somatic embryo development in longan, but not Fe-SOD, and this result was first time to proposed that which kind of SOD s play an important role in plant embroys from mRNA level. -This will provide a theoretical basis for the regulation and control of longan early somatic embryogenesis. with the differentiation of embryogenic cultures, during the succes