SDS-PAGE电泳过程中常见问题以及解决方法

1、SDS-PAGE 电泳过程中常见问题以及解决方法几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所有条件总要确保 蛋白质解离单个多肽 亚基并 进 可能减 少 其相互间的聚集 ，最常用的就是SDS-PAGE电泳技术。1 . SDS PAGE电泳的基本原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS （十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合 SDS的量几 乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS 多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与 1.4g 去污剂结合。当分子量在15KD 到 2

2、00KD 之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX ，式中： MW 为分子量，X 为迁移率，k、 b 均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图， 可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。2 . 配胶缓冲液系统对电泳的影响在SDS PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是 TrisHCL缓冲系统， 浓缩胶是pH6.7,分离胶pH8.9;而电泳缓冲液使用的Tris 甘氨酸缓冲系统。 在浓缩胶中，其pH 环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL 离子却很高

3、，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度， 压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH 的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以， pH 对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况下，应首考虑该因素。3 . 样品如何处理根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原 SDS处理、非还原SDS 处理、带有烷基化作用的还原 SDS

4、处理。1）、还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT （或Beta琉基乙醇）后，蛋白质构像被解离，电荷被中和，形成SDS 与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer,离心，沸水煮5min,再离心加样。2）、带有烷基化作用的还原SDS 处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的 DTT,而防 止银染时的纹理现象。100仙l样品缓冲液中10仙l 20%的碘乙酸胺，并在室温保 温 30min。3）、非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%S

5、DS沸水中煮3min,未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。4 . SDS-PAGE电泳凝胶中主要各分的作用聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7,分离胶选择pH8.9,选择trisHCL系统TEMED与AP:促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；十二烷基硫酸钠（SDS） ：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。5 .提高DS-PAGE 电泳分辨率的途经1）聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室

6、温凝固后， 可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4 度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS 结晶。一般凝胶可在室温下保存4 天， SDS 可水解聚丙烯酰胺。2）一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具可参照郭尧君编著的蛋白质电泳技术手册P82-103。6 .“微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。处理办法：待其充分凝固再作后续实验。7 .“皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气

7、泡。8 .为什么带出现拖尾现象主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。9 .为什么带出现纹理现象主要是样品不溶性颗粒引起的。处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。10 .什么是“鬼带”，如何处理“鬼带” 就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却与目

8、标条带有相同的免疫学活性，在WB 反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的 DTT或Beta琉基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA 来阻止还原剂的氧化。11 .为什么溴酚蓝不能起到指示作用我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的情况。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。12 .为什么电泳的条带很粗？电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH 正确（ 6.7） ；适当降低电压；13 .为什么电泳电压很高而电流却很低这种一

9、般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是 由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括： a.内外槽装反；b.外槽液过 少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。处理办法：电泳槽正确装配即可。14 .浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子 用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进 入引起的。人生就像一部书，每个人都在书写着自己的故事，书写着生命中曾承载的苦辣酸甜和正在经历的风霜雪雨。不管这部书的情节精彩也好，简约也罢，我们都必须字斟句酌，用心构思。只有

10、 这样，认真写好人生的每一个章节，才能把握生命的主旋律。人生也像一条河，有谁不是在风里行舟，雨中穿梭。昨天还在逆浪而行，今朝依然奔奔波波。尽管如此，我们也不应气馁，更不敢稍有停歇。只有这样，才能穿越人生的风浪，踏平生命 的坎坷，从而抵达理想的彼岸，收获人生累累硕果。人生还像一盘棋，我们每个人俨如上帝手中的一枚棋子，贫富贵贱难预料，生老病死不由己。楚河汉界今犹在，谁见君王卷土来？是啊！人生苦短，岁月蹉鸵。在不老的时光里，我们每 个人充其量不过是一个匆匆的过客。当你走过半生，蓦然首，你会发觉：转眼间，我们便告别了葱茏的年华，跨过了中年的门槛，走进了枫红菊艳的时节。有道是，流光容易把人抛，红了樱桃，

11、绿了芭蕉。岁月如梭，不经意间便穿越半生沧桑。回首往事，多少情怀已经更改，多少青春早已不再，多少梦想恍如云烟，多少足迹已湮入尘埃。实乃，人生得失如萍散，雪落花开辞红颜。三毛说：“我来不及认真地年轻，待明白过来时，只能选择认真地老去。”昨天已经落幕，明天无法彩排，唯有今天才是人生的最好舞台。轻捻指尖流年，细数过往云烟。曾经的莽撞少年，总以为伸手就能够着天，凡理都要辩出个曲和直，凡事都要弄出个里和面。人过中年，我们才恍然顿悟：不和别人比，好好活自己，这 才是后半场人生棋盘最好的布局。好好活自己，就要力求“身心两安逸”,老了不可怕，就怕放不下。人过中年，身体机能不断下降，就像一部半新不旧的机器，各个零

12、部件都已濒临保养期，如果不及时加以检修，等到停止工作那一天，悔之晚矣。凡事不攀比，保命是正理，浮云随风去，任尔东与西。身体健康是前提，心情快乐才安逸。服老不并非消及，而是保护自己。山有山的伟岸，水有水的柔情，每个人的生活模式千差万别，就像世界上没有一模一样的两片叶子，你有你的脉络，我有我的纹理。寸有所长，尺有所短，每个人都不是完美无缺的个体， 你有你的色彩，我有我的艳丽；你羡慕别人的同时，别人也许正在羡慕你。就像卞之琳所说的那样，你站在桥上看风景，看风景的人在楼上看你。明月装饰了你的窗子，你装饰了别人的梦。 我们每个人何尝不是一道独一无二的风景线，只是缺乏一双欣赏的眼光而已。好好活自己，就要力

13、求“退而求其次”,后半生，我们没有多余的精力去开拓一个未知的领域。所谓的“大不了从头再来”，那只不过是年轻人的豪言壮语。人生后半场，上帝给予我们的时间和精力是有限的，适时地放手才是最好的选择。退而求其次，看似是一种“无奈”，却也是一种豁达的智慧。它并非真正意义上的“退化”，而是为生命“留白”，为自己留下一点周旋的余地。老子曾言，“虚而不屈动而愈出，多言数穷不如守中。”事多必乱，言多必失，只有保留一定的“空”，才能其用无穷。正所谓，月满则亏，水满则溢。有时退一步海阔天空，进一步山重水复。留白，也是一种取舍，只有 “丢卒保车”，才能满盘皆活。古人说：“路漫漫其修远兮，吾将上下而求索。”可见，“求索

14、”原本就分“上” “下”,当你的“上策”无法策马扬鞭时，你必须要退避三舍求“下策”，谋定而后动，知止而有得。叶公好龙，玩假把式；夜郎自大，唯我独尊，只能是自讨苦吃。好好活自己，就要力求营造一个“小天地”,人生需自渡，这个世界上从来就没有救世主。自己的人生，黯淡与精彩完全由自己去书写，去掌舵，去布局。红尘如梦，亦真亦幻；人生如戏，亦悲亦喜。当曲终人散时，不过是乐者自乐，歌者自歌；伤者自伤，痛者自痛。人生就像一部书，每个人都在书写着自己的故事，书写着生命中曾承载的苦辣酸甜和正在经历的风霜雪雨。不管这部书的情节精彩也好，简约也罢，我们都必须字斟句酌，用心构思。只有这样，认真写好人生的每一个章节，才能

15、把握生命的主旋律。人生也像一条河，有谁不是在风里行舟，雨中穿梭。昨天还在逆浪而行，今朝依然奔奔波波。尽管如此，我们也不应气馁，更不敢稍有停歇。只有这样，才能穿越人生的风浪，踏平生命 的坎坷，从而抵达理想的彼岸，收获人生累累硕果。人生还像一盘棋，我们每个人俨如上帝手中的一枚棋子，贫富贵贱难预料，生老病死不由己。楚河汉界今犹在，谁见君王卷土来？是啊！人生苦短，岁月蹉鸵。在不老的时光里，我们每 个人充其量不过是一个匆匆的过客。当你走过半生，蓦然首，你会发觉：转眼间，我们便告别了葱茏的年华，跨过了中年的门槛，走进了枫红菊艳的时节。有道是，流光容易把人抛，红了樱桃，绿了芭蕉。岁月如梭，不经意间便穿越半生

16、沧桑。回首往事，多少情怀已经更改，多少青春早已不再，多少梦想恍如云烟，多少足迹已湮入尘埃。 实乃，人生得失如萍散，雪落花开辞红颜。三毛说：“我来不及认真地年轻，待明白过来时，只能选择认真地老去。”昨天已经落幕，明天无法彩排，唯有今天才是人生的最好舞台。轻捻指尖流年，细数过往云烟。曾经的莽撞少年，总以为伸手就能够着天，凡理都要辩出个曲和直，凡事都要弄出个里和面。人过中年，我们才恍然顿悟：不和别人比，好好活自己，这 才是后半场人生棋盘最好的布局。好好活自己，就要力求“身心两安逸”,老了不可怕，就怕放不下。人过中年，身体机能不断下降，就像一部半新不旧的机器，各个零部件都已濒临保养期，如果不及时加以检

17、修，等到停止工作那一天，悔之晚矣。凡事不攀比，保命是正理，浮云随风去，任尔东与西。身体健康是前提，心情快乐才安逸。服老不并非消及，而是保护自己。山有山的伟岸，水有水的柔情，每个人的生活模式千差万别，就像世界上没有一模一样的两片叶子，你有你的脉络，我有我的纹理。寸有所长，尺有所短，每个人都不是完美无缺的个体， 你有你的色彩，我有我的艳丽；你羡慕别人的同时，别人也许正在羡慕你。就像卞之琳所说的那样，你站在桥上看风景，看风景的人在楼上看你。明月装饰了你的窗子，你装饰了别人的梦。 我们每个人何尝不是一道独一无二的风景线，只是缺乏一双欣赏的眼光而已。好好活自己，就要力求“退而求其次”,后半生，我们没有多余的精力去开拓一个未知的领域。所谓的“大不了从头再来”，那只不过是年轻人的豪言壮语。人生后半场，上帝给予我们的时间和精力是有限的，适时地放手才是最好的选择。退而求其次，看似是一种“无奈”，却也是一种豁达的智慧。它并非真正意义上的“退化”，而是为生命“留白”，为自己留下一点周旋的余地。老子曾言，“虚而不屈动而愈出，多言数穷不如守中。”事多必乱，言多必失，只有保留一定的“空”，才能其用无穷。正所谓，月满则亏，