放射免疫检测技术ppt课件

1、放射免疫检测技术1基本内容基本内容一、一、放射免疫检测技术的基本原理放射免疫检测技术的基本原理二、二、放射免疫分析（放射免疫分析（RIA）三、三、免疫放射分析（免疫放射分析（IRMA）四、四、RIA与与IRMA的比较的比较五、放射免疫分析中造成测量误差的因素五、放射免疫分析中造成测量误差的因素六、核废物的处理六、核废物的处理七、应用七、应用八、课堂小结八、课堂小结九、作业九、作业2一、放射免疫检测技术的基本原理一、放射免疫检测技术的基本原理1、7个基本概念个基本概念2、常用的放射性核素、常用的放射性核素3、放射性核素的选择原则、放射性核素的选择原则4、放射性标记的抗原或抗体的要求、放射性标记的

2、抗原或抗体的要求5、制备放射性核素标记物、制备放射性核素标记物6、放射性标记物的纯化、放射性标记物的纯化7、理想的分离技术、理想的分离技术8、免疫复合物分离常用方法、免疫复合物分离常用方法9、核射线探测仪器的探测原理、核射线探测仪器的探测原理31、7个基本概念个基本概念放射性核素：放射性核素：是指原子核能自发地产生成分或是指原子核能自发地产生成分或能级的变化，在变化时伴有射线的发射（放射能级的变化，在变化时伴有射线的发射（放射性），然后变成另一种元素的核素。性），然后变成另一种元素的核素。 一、放射免疫检测技术的基本原理一、放射免疫检测技术的基本原理放射量单位有放射量单位有: 放射性活度放射性

3、活度 放射性比活度放射性比活度 放射性浓度放射性浓度41、7个基本概念个基本概念放射性活度：放射性活度：一定量的放射性核素在一定量的放射性核素在单位时间内的核衰变数，即每秒核衰变单位时间内的核衰变数，即每秒核衰变次数。次数。单位：单位：贝可勒尔贝可勒尔(Becquerel，Bq) 1Ci=3.71010Bq 一、放射免疫检测技术的基本原理一、放射免疫检测技术的基本原理51、7个基本概念个基本概念放射性比活度：放射性比活度：是指是指固体样品固体样品的放射的放射性活度，即单位质量样品中所含放射性性活度，即单位质量样品中所含放射性活度，以活度，以Bq/g或或Bq/mmol表示表示 。放射性浓度：放射

4、性浓度：是指是指液体样品液体样品的放射性的放射性活度，即单位体积溶液中所含放射性活活度，即单位体积溶液中所含放射性活度，以度，以Bq/ml表示。表示。一、放射免疫检测技术的基本原理一、放射免疫检测技术的基本原理61、7个基本概念个基本概念比活度：比活度：是是单位质量单位质量标记物的放射强度，标记物的放射强度，单位为单位为Bq/ g。 标记抗原的比放射性越高，所需标记标记抗原的比放射性越高，所需标记抗原量越少，实验系统的敏感度越高。抗原量越少，实验系统的敏感度越高。 但过高的比放射性可能会损伤抗原的但过高的比放射性可能会损伤抗原的免疫活性。如碘标记化合物以单碘标记为免疫活性。如碘标记化合物以单碘

5、标记为宜。宜。 一、放射免疫检测技术的基本原理一、放射免疫检测技术的基本原理71、7个基本概念个基本概念放射化学纯度：放射化学纯度：是指结合于抗原上的放是指结合于抗原上的放射强度占总放射强度的百分率。射强度占总放射强度的百分率。 影响因素影响因素: :被标记物不纯，杂质也被放射性核素标被标记物不纯，杂质也被放射性核素标记；记；标记后的分离纯化不完全；标记后的分离纯化不完全；标记化合物贮存过程中的碘脱落。标记化合物贮存过程中的碘脱落。一、放射免疫检测技术的基本原理一、放射免疫检测技术的基本原理81、7个基本概念个基本概念免疫活性：免疫活性：指标记抗原结合于抗体的指标记抗原结合于抗体的放射强度占总

6、放射强度的百分率。放射强度占总放射强度的百分率。 以以检查标记后免疫活性损失检查标记后免疫活性损失情况。情况。一、放射免疫检测技术的基本原理一、放射免疫检测技术的基本原理92、常用的放射性核素：、常用的放射性核素： 放射性核素依据衰变方式分放射性核素依据衰变方式分、三三种，用于放射性标记的有种，用于放射性标记的有和和两类两类;分别分别用用液体闪烁计数器液体闪烁计数器及及计数器计数器测定。测定。 型：型：3 3H H（最常用）、（最常用）、1414C C和和3232P P。 型：型：125125I I（最常用）、（最常用）、131131I I、5151CrCr和和6060CoCo。一、放射免疫检

7、测技术的基本原理一、放射免疫检测技术的基本原理10125I和和3H标记物特点比较标记物特点比较 125125I I标记物标记物3 3H H标记物标记物标记方法标记方法方法简便，易获得高方法简便，易获得高比放射性标记物比放射性标记物方法较难，不易获得方法较难，不易获得高比放射性标记物高比放射性标记物对标记化合对标记化合物影响物影响标记时以标记时以I I代替代替H1H1改变改变物质结构，可影响抗物质结构，可影响抗原免疫学活性原免疫学活性不改变抗原结构，一不改变抗原结构，一般不影响抗原免疫活般不影响抗原免疫活性性测量方法测量方法方法简便、效率高方法简便、效率高方法复杂，效率低方法复杂，效率低测量仪器

8、测量仪器计数器计数器液体闪烁计数器液体闪烁计数器半衰期半衰期60.260.2天天约约1111年年废弃物废弃物处理容易处理容易较难较难113、放射性核素选择原则放射性核素选择原则 高比活度、适宜半衰期、对抗原或抗高比活度、适宜半衰期、对抗原或抗体没损害、容易标记。体没损害、容易标记。4、放射性标记的抗原或抗体的要求放射性标记的抗原或抗体的要求 纯度高、灵敏、有足够或完整的免疫纯度高、灵敏、有足够或完整的免疫活性、高亲和常数、特异性强、交叉反应活性、高亲和常数、特异性强、交叉反应率低。率低。一、放射免疫检测技术的基本原理一、放射免疫检测技术的基本原理125、制备放射性核素标记物、制备放射性核素标记

9、物直接标记法直接标记法 将将125I直接结合在蛋白质侧链的直接结合在蛋白质侧链的酪氨酸残酪氨酸残基苯环基苯环上，形成单碘酪氨酸或双碘酪氨酸。上，形成单碘酪氨酸或双碘酪氨酸。 操作简便，结合效率高，但只能标记含酪氨操作简便，结合效率高，但只能标记含酪氨酸的化合物，有时可能会损害蛋白质的活性酸的化合物，有时可能会损害蛋白质的活性。间接标记法间接标记法 先将放射性碘连接到一个先将放射性碘连接到一个小分子载体小分子载体上上，再将这个小分子载体与蛋白质结合。，再将这个小分子载体与蛋白质结合。一、放射免疫检测技术的基本原理一、放射免疫检测技术的基本原理13 6、放射性标记物的纯化、放射性标记物的纯化 可用

10、可用葡聚糖凝胶过滤法葡聚糖凝胶过滤法或或薄层层析法薄层层析法、纸层析法纸层析法、电泳法电泳法、高效液相层析法高效液相层析法等。等。 理想的放射性标记物：理想的放射性标记物： 高放射化学纯度高放射化学纯度 适当的比放射性适当的比放射性 高的免疫活性。高的免疫活性。 一、放射免疫检测技术的基本原理一、放射免疫检测技术的基本原理147、理想的分离技术、理想的分离技术简便易行，适于大批量样品分析简便易行，适于大批量样品分析;分离效果完全、快速，非特异结合低分离效果完全、快速，非特异结合低;试剂来源容易、价格低廉、稳定性好、可长试剂来源容易、价格低廉、稳定性好、可长期保存期保存; 不受外界因素和样品中其

11、他组分的干扰，对不受外界因素和样品中其他组分的干扰，对标准品和待测抗原分离效果相同标准品和待测抗原分离效果相同;适合自动化分析的要求。适合自动化分析的要求。 一、放射免疫检测技术的基本原理一、放射免疫检测技术的基本原理158、免疫复合物分离常用方法、免疫复合物分离常用方法.吸附法吸附法 用吸附剂用吸附剂 (如活性炭如活性炭)吸附小分子的游离。吸附小分子的游离。.化学沉淀法化学沉淀法 RIA反应条件接近抗体的等电点，加入聚乙二醇反应条件接近抗体的等电点，加入聚乙二醇(PEG)等蛋白质沉淀等蛋白质沉淀剂可破坏蛋白分子表面的水化层而使蛋白沉淀，从而分离剂可破坏蛋白分子表面的水化层而使蛋白沉淀，从而分

12、离B与与F。.双抗体法双抗体法 利用抗抗体和利用抗抗体和Ag-Ab复合物中的抗体结合，形成更大免疫复合物，复合物中的抗体结合，形成更大免疫复合物，离心沉淀即可分离离心沉淀即可分离B与与F。.PR试剂试剂 将双抗体法和将双抗体法和PEG结合起来的沉淀法，可弥补各自的不足，分离效果结合起来的沉淀法，可弥补各自的不足，分离效果好，适用范围广。好，适用范围广。.固相分离法固相分离法 将抗体或抗原结合在固相载体（如磁颗粒、聚苯烯管子或珠等）上，将抗体或抗原结合在固相载体（如磁颗粒、聚苯烯管子或珠等）上，利用固相抗体或抗原分离利用固相抗体或抗原分离B和和F，具有简便、快速、适合于自动化分析等，具有简便、快

13、速、适合于自动化分析等特点，已逐步取代传统的液相分离方法。特点，已逐步取代传统的液相分离方法。一、放射免疫检测技术的基本原理一、放射免疫检测技术的基本原理169、核射线探测仪器的探测原理、核射线探测仪器的探测原理 核射线探测器是个能量转化器，其检测原理是当射线作用于闪烁体，闪烁体吸收了射线的能量而引起闪烁体中的原子或分子激发，当受激的原子或分子退激时，则发出光子进入光电倍增管光阴极，转换为光电子，光电子在光电倍增管电场作用下到达阳极，形成电脉冲。 转换模式：放射能转换模式：放射能光能光能电电能能脉冲。脉冲。一、放射免疫检测技术的基本原理一、放射免疫检测技术的基本原理17二、放射免疫分析（二、放

14、射免疫分析（RIA）1、基本原理、基本原理 抗原抗体竞争性结合反应，即待测抗原抗原抗体竞争性结合反应，即待测抗原(Ag)和定量的标记抗原和定量的标记抗原(Ag)与限量的抗体与限量的抗体(Ab)进行特异性反应，其中进行特异性反应，其中Ab的结合位点数的结合位点数小于小于AgAg的结合位点总数，则的结合位点总数，则Ag和和Ag与与Ab发生竞争性结合。如待测发生竞争性结合。如待测Ag含量多，则含量多，则Ag-Ab复合物形成得多，复合物形成得多，Ag-Ab复合物复合物 (B)形成少，游离的形成少，游离的Ag（F）多，反之亦然。）多，反之亦然。 18二、放射免疫分析（二、放射免疫分析（RIA）192、分

15、类、分类 根据加样顺序不同，根据加样顺序不同，RIA可分为可分为2个类型：个类型： 平衡法平衡法 将将Ag和和Ag同时与同时与Ab反应，达到平衡后反应，达到平衡后分离分离Ag-Ab和和Ag，方法稳定，但敏感度，方法稳定，但敏感度稍差；稍差； 顺序饱和法顺序饱和法 先将待测先将待测Ag与与Ab充分反应，达平衡后再加充分反应，达平衡后再加入入Ag，敏感度提高，稳定性不如平衡法。，敏感度提高，稳定性不如平衡法。二、放射免疫分析（二、放射免疫分析（RIA）203、数据处理、数据处理根据放射性核素的类型分别选用液体闪烁计数仪（根据放射性核素的类型分别选用液体闪烁计数仪（型）和型）和计数仪（计数仪（型），

16、测定型），测定各待测标本和备抗原标准品的各待测标本和备抗原标准品的Ag-Ab放射性强度放射性强度 (B)或游离或游离Ag放射性强度放射性强度 (F)。制作标准曲线制作标准曲线时，纵坐标为放射性反应参数，有各种表示方时，纵坐标为放射性反应参数，有各种表示方式，可选用式，可选用B/F、B/（BF）、）、F/B、B/B0（零标准管）（零标准管）等比值等比值或或B或或F的的cpm（脉冲）值，常选用（脉冲）值，常选用B/B0比值作为参数。横比值作为参数。横坐标为已知测定物标准品的浓度，以算术数或对数表示。放坐标为已知测定物标准品的浓度，以算术数或对数表示。放射免疫分析的标准曲线为双曲线。射免疫分析的标准

17、曲线为双曲线。根据待测抗原管的放射性强度计算相应反应参数值，再根据待测抗原管的放射性强度计算相应反应参数值，再从标从标准曲线图上查得待测抗原相应含量准曲线图上查得待测抗原相应含量。二、放射免疫分析（二、放射免疫分析（RIA）21RIA标准曲线的类型标准曲线的类型 （1）以测定物标准品浓度为横坐标，）以测定物标准品浓度为横坐标，B%或或B/F、B/B0、计数（、计数（cpm） 为纵坐标，呈双曲函数；为纵坐标，呈双曲函数；（2）以测定物标准品浓度的对数为横坐标，）以测定物标准品浓度的对数为横坐标，B%或或B/F、B/B0、cpm为为 纵坐标，曲线呈反纵坐标，曲线呈反S型；型； (3）以标准品浓度的

18、算术数（或对数）为横坐标，）以标准品浓度的算术数（或对数）为横坐标，F/B（或（或B0/B） 为纵坐标，呈双曲函数；为纵坐标，呈双曲函数；（4）以标准品浓度的对数为横坐标，）以标准品浓度的对数为横坐标， logitB/B0为纵坐标，为纵坐标， 标准曲线为从左到右的渐降直线。标准曲线为从左到右的渐降直线。224 4、方法学评价、方法学评价优点优点敏感度高，能测到敏感度高，能测到g/Lg/L，甚至可测到，甚至可测到ng/Lng/L或或pg/pg/水平；水平；特异性强，与结构类似物质间的交叉反应少；特异性强，与结构类似物质间的交叉反应少；准确性好，重复性好，批间批内误差低；准确性好，重复性好，批间批

19、内误差低；用血量少。用血量少。缺点缺点有放射性核素对环境和实验室污染；有放射性核素对环境和实验室污染；放射性核素易衰变以及放射性标记物不稳定，放射性核素易衰变以及放射性标记物不稳定，导致试剂有效期短。导致试剂有效期短。二、放射免疫分析（二、放射免疫分析（RIA）23三、免疫放射分析（三、免疫放射分析（IRMA）1、原理、原理 属于非竞争性免疫结合反应。是将放属于非竞争性免疫结合反应。是将放射性同位素标记在抗体上，用过量的标记射性同位素标记在抗体上，用过量的标记抗体抗体(Ab)与待测抗原反应，反应式为与待测抗原反应，反应式为Ag+Ab=Ag-Ab+ Ab。待充分反应后。待充分反应后，除去游离的标

20、记抗体，除去游离的标记抗体，Ag-Ab结合物的结合物的放射性强度与待测抗原量呈正比关系，即放射性强度与待测抗原量呈正比关系，即待测抗原含量越多，则复合物的计数率就待测抗原含量越多，则复合物的计数率就越高，反之则越低。越高，反之则越低。242、技术路线、技术路线 抗体包被反应管抗体包被反应管待测抗原待测抗原过量过量的的标记抗体标记抗体抗原抗体反应（温育）抗原抗体反应（温育）平衡平衡分离分离Ag-Ab+ Ab放射性强度放射性强度测定测定绘制标准曲线绘制标准曲线计算计算待测抗原量待测抗原量三、免疫放射分析（三、免疫放射分析（IRMA）253 3、方法学评价、方法学评价优点优点 敏感性高敏感性高 特异

21、性高特异性高 标记物稳定，标记容易。标记物稳定，标记容易。 结果稳定结果稳定缺点缺点 IRMAIRMA抗体用量偏多抗体用量偏多 抗体的特异性纯化较难抗体的特异性纯化较难（如用单克隆抗体可克服这些缺点）（如用单克隆抗体可克服这些缺点） 。三、免疫放射分析（三、免疫放射分析（IRMA）26四、四、RIA与与IRMA的比较的比较 放射免疫分析（放射免疫分析（RIA）是放射免疫技术是放射免疫技术最经典最经典的模式。它是以放射性的模式。它是以放射性核素标记抗原与反应系核素标记抗原与反应系统中未标记抗原统中未标记抗原竞争性竞争性结结合特异性抗体为基本合特异性抗体为基本原理来测定待检样品中原理来测定待检样品

22、中抗原量的一种分析方法抗原量的一种分析方法。 免疫放射分析（免疫放射分析（IRMA）是用放射性核素标记是用放射性核素标记的过量抗体与待检测抗的过量抗体与待检测抗原直接结合，采用固相原直接结合，采用固相免疫吸附载体分离结合免疫吸附载体分离结合与游离标记抗体的与游离标记抗体的非竞非竞争性争性放射免疫分析。放射免疫分析。27二者的异同点如下：二者的异同点如下： 标记物标记物 RIA 以放射性核素标记抗原；以放射性核素标记抗原；IRMA 则是标记则是标记抗体。抗体。 反应速率反应速率 IRMA 反应速度比反应速度比RIA 快。快。 反应原理反应原理 RIA 为竞争抑制性结合，反应参数与待检抗为竞争抑制

23、性结合，反应参数与待检抗原量成反相关；原量成反相关；IRMA为非竞争结合，反应参数与待为非竞争结合，反应参数与待检抗原成正相关。检抗原成正相关。 特异性特异性 IRMA 特异性较特异性较RIA高。高。 灵敏度和检测范围灵敏度和检测范围 IRMA测定的灵敏度明显高于测定的灵敏度明显高于RIA， IRMA标准曲线工作范围较标准曲线工作范围较RIA宽宽12个数量级。个数量级。 其他其他 RIA 所用抗体为多克隆抗体，对亲和力和特异性所用抗体为多克隆抗体，对亲和力和特异性要求较高，但用量很少；要求较高，但用量很少；IRMA 为试剂过量的反应，为试剂过量的反应，对抗体亲和力的要求不及对抗体亲和力的要求不

24、及 RIA，但用量大。此外，但用量大。此外，RIA 可以测量半抗原，但可以测量半抗原，但IRMA只能测定至少有两个只能测定至少有两个以上表位的抗原。以上表位的抗原。四、四、RIA与与IRMA的比较的比较28五、放射免疫分析中造成测量误差的因五、放射免疫分析中造成测量误差的因素素 误差包括误差包括系统误差系统误差和和随机误差随机误差。系统误差发生在测量过程中由于仪器不准。系统误差发生在测量过程中由于仪器不准、试剂不纯、标准品不稳定等原因，使测定结果呈倾向性偏大或偏小，这种误、试剂不纯、标准品不稳定等原因，使测定结果呈倾向性偏大或偏小，这种误差应力求避免。随机误差是测量过程中各种偶然因素造成的，没

25、有固定的倾向差应力求避免。随机误差是测量过程中各种偶然因素造成的，没有固定的倾向性，这类误差是不可避免的，必要时做统计学处理。性，这类误差是不可避免的，必要时做统计学处理。造成误差的可能来源有以下几个方面：造成误差的可能来源有以下几个方面：1 1各种仪器：各种仪器：设备的准确性、稳定性、效率以及被污染等情况带来的误差设备的准确性、稳定性、效率以及被污染等情况带来的误差。如：由于放射性测量仪器的稳定性、效率、样品试管的材料和均匀性及被。如：由于放射性测量仪器的稳定性、效率、样品试管的材料和均匀性及被测物的放射性强度等原因。由于样品的自吸收，本底校正，测定时间，可能测物的放射性强度等原因。由于样品

26、的自吸收，本底校正，测定时间，可能的污染等原因。在试验室中所有的移液管、微量取样器以及天平的刻度、校的污染等原因。在试验室中所有的移液管、微量取样器以及天平的刻度、校准和使用方法等原因。由于反应试管、移液管以及测定用试管等表面清洁度准和使用方法等原因。由于反应试管、移液管以及测定用试管等表面清洁度和所引起的不同吸附等原因都可以对测定结果带来误差。和所引起的不同吸附等原因都可以对测定结果带来误差。2 2试剂的纯度、质量和稳定性试剂的纯度、质量和稳定性的影响也是造成误差的重要因素。如标记抗的影响也是造成误差的重要因素。如标记抗原的比度、纯度，辐射自分解，抗体的稳定性，分离剂、阻断剂及缓冲液等试原的

27、比度、纯度，辐射自分解，抗体的稳定性，分离剂、阻断剂及缓冲液等试剂的纯度等。剂的纯度等。29 3在放射免疫分析中一些基本操作在放射免疫分析中一些基本操作，如取样、提取、沉，如取样、提取、沉淀、分离以及保温条件不适当等造成的误差。由于工作人淀、分离以及保温条件不适当等造成的误差。由于工作人员熟练程度不同也常常带来误差，如操作移液管垂直程度员熟练程度不同也常常带来误差，如操作移液管垂直程度、下流速度、吹气与不吹气等。工作人员草率、不按规程、下流速度、吹气与不吹气等。工作人员草率、不按规程操作等也都可以造成误差。操作等也都可以造成误差。 4样品误差。样品误差。样品的收集方法、贮存温度、放置条件，样品

28、的收集方法、贮存温度、放置条件，微量样品取样的准确度，样品可能造成的污染以及样品的微量样品取样的准确度，样品可能造成的污染以及样品的变性（如免疫反应活性的降低、蛋白质的变性等）也都能变性（如免疫反应活性的降低、蛋白质的变性等）也都能造成测量的误差。造成测量的误差。 5提取及层析分离过程中的丢失。提取及层析分离过程中的丢失。五、放射免疫分析中造成测量误差的因五、放射免疫分析中造成测量误差的因素素30六、核废物的处理六、核废物的处理 放射性废物中的放射性物质，采用一般放射性废物中的放射性物质，采用一般的的物理、化学及生物学的方法物理、化学及生物学的方法都不能将都不能将其消灭或破坏，只有通过其消灭或

29、破坏，只有通过放射性核素的放射性核素的自身衰变自身衰变才能使放射性衰减到一定的水才能使放射性衰减到一定的水平。而许多放射性元素的平。而许多放射性元素的半衰期十分长半衰期十分长，并且衰变的产物又是新的放射性元素，并且衰变的产物又是新的放射性元素，所以放射性废物与其它废物相比在处，所以放射性废物与其它废物相比在处理和处置上有许多不同之处。理和处置上有许多不同之处。 31 1、放射性废水的处理、放射性废水的处理 放射性废水的处理方法主要有稀释排放法、放置衰变法、混放射性废水的处理方法主要有稀释排放法、放置衰变法、混凝沉降法、离子变换法、蒸发法、沥青固化法、水泥固化法凝沉降法、离子变换法、蒸发法、沥青

30、固化法、水泥固化法、塑料固化法以及玻璃固化法等。、塑料固化法以及玻璃固化法等。 2、放射性废气的处理、放射性废气的处理 (1)铀矿开采过程中所产生废气、粉尘，一般可通过改善操作铀矿开采过程中所产生废气、粉尘，一般可通过改善操作条件和通风系统得到解决。条件和通风系统得到解决。 (2)实验室废气，通常是进行预过滤，然后通过高效过滤后再实验室废气，通常是进行预过滤，然后通过高效过滤后再排出。排出。 (3)燃料后处理过程的废气，大部分是放射性碘和一些惰性气燃料后处理过程的废气，大部分是放射性碘和一些惰性气体。体。 3、放射性固体废物的处理和处置、放射性固体废物的处理和处置 放射性固体废物主要是被放射性物质污染而不能再用的各种放射性固体废物主要是被放射性物质污染而不能再用的各种物体物体 (1)焚烧焚烧 (2)压缩压缩 (3)去污去污 (4)包装包装六、核废物的处理六、核废物的处理32七、在医学检验中应用七、在医学检验中应用1.激素的测定激素的测定 RIA可用于大多数激素的测定，对相关疾可用于大多数激素的测定，对相关疾病的诊断和治疗提供重要的实验依