叶绿体DNA的提取

1、叶 绿 体 DNA 的 提 取 -微藻精品文档叶绿体DNA勺提取（参考杜氏盐藻）1、材料：扁藻2、培养基配方：3、仪器：超速离心机 细胞破碎仪4、用于细胞破碎和叶绿体分离的缓冲液：溶液 1: 0.33 mol/L 山梨糖醇 Sorbitol ，50m mol/L Hepes, 2m mol/LEDTA, 1m mol/L MnCI 2, 2m mol/L DTT,体积分数 0.5%BSA Leupeptin 1mg/L溶液 2（ 45%糖加离心缓冲液）：45g/L 蔗糖，0.33mol/L Sorbitol ，50m mol/L Hepes溶液 3（ 60%糖加离心缓冲液）：60g/L 蔗糖，

2、0.33mol/L Sorbitol ，50m mol/L Hepes溶液 4 （叶绿体洗涤缓冲液）：0.33mol/L Sorbitol ，25m mol/L Hepes以上缓冲液均用KOH调pH至7.5溶液5：50m mol/L Tris-HCl ，100 m mol/L EDTA，pH8.05、完整叶绿体的分离（所有操作均在 4 °C进行）1）将培养10d左右达对数生长后期的250ml藻液，离心收集藻体，液氮充分研 磨后，将上述藻体细胞用20ml冰预冷的溶液1充分缓慢的悬浮于50ml离心 管，制成（粗体液）。3）将粗体液于1000g离心30s，弃上清。4）再次用10ml冰预冷的

3、溶液1充分缓慢悬浮，悬浮液平均铺满于 6个10 mLHITACHI CPIO0专用离心管上层，每个离心管最下层铺有冰预冷的3 mL溶液3,其上铺有冰预冷的3 mL溶液2形成梯度。5） 4C,40 000 g离心3h,完整的叶绿体集中在梯度之间，将此层小心吸至10mL离心管（约2 mL）6）加入4倍体积的冰预冷的溶液4, 3 000 g离心5min以除去多余的蔗糖，重 复此步骤1次。7）将沉淀悬浮于3 mL溶液4作为完整叶绿体制品，置于4 C备用。& cpDNA勺提取及鉴定l ）在得到的新鲜完整叶绿体制品中，加入终浓度分别为150卩g/l和13mmol/l的DNase I和MgCI2,并

4、于冰上静置2h以去除来自核DNA勺潜在污染2）4C,1 000 g离心1 min，收集叶绿体沉淀3） 将叶绿体沉淀悬浮于500卩l溶液5,加入终浓度为2%勺SDS （初始浓度为20%勺SDS加55卩1）和终浓度为100卩g/ml的蛋白酶K （初始浓度为20mg/ml，加 2.7 卩1），55C水浴 3h;4）、加入等体积的饱和酚（pH8.0），轻轻混合均匀，于4C, 12000rpm离心10-15mi n5）小心移取上清于新的灭菌 EP管，后加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24: 1）,混匀，于 4C, 12000rpm 离心 10-15min ;6） 小心移取上清于另一离心管，加入等体积氯仿：异戊醇（24: 1）,上下颠 倒混合均匀，于4C, 12000rpm离心10-15min ;7）移取上清，加1/10体积的3M NaACffi二倍体积预冷的无水乙醇（-20 C）, 于-20 C冰箱中沉淀过夜或-80 C沉淀1h;8）4C, 10000rpm离心 15min,弃上清；9）加入70%酉精，10000rpm离心10分钟，洗涤沉淀