第七章发酵过程控制3

1、发酵工程发酵工程精品课程精品课程http:/ http:/ 微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测 在线检测必须用专门的传感器（也叫电极或探头）在线检测必须用专门的传感器（也叫电极或探头）放入发酵系统，将发酵的一些信息传递出来，为发酵控放入发酵系统，将发酵的一些信息传递出来，为发酵控制提供依据制提供依据。黑箱黑箱 灰箱灰箱 参数检测检测仪器：气相色谱、高效液相、离子色谱、检测仪器：气相色谱、高效液相、离子色谱、双向电泳、毛细管电泳、红外光谱、基因测序仪等双向电泳、毛细管电泳、红外光谱、基因测序仪等检测代谢中间物，分析代谢流向、检测代谢中间物，分析代谢流向、RNARNA检测检测一一 参

2、数在线检测参数在线检测v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 插入罐内的传感器必须能经受高压蒸汽灭菌插入罐内的传感器必须能经受高压蒸汽灭菌（材料、数据）（材料、数据）l 传感器结构不能存在灭菌不透的死角，以防染传感器结构不能存在灭菌不透的死角，以防染菌（密封性好）菌（密封性好）l 传感器对测量参数要敏感，且能转换成电信号。传感器对测量参数要敏感，且能转换成电信号。（响应快、灵敏）（响应快、灵敏）l 传感器性能要稳定，受气泡影响小。传感器性能要稳定，受气泡影响小。v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 电信号电信号 放大放大 记录显示仪记录显示仪

3、控制器（与设定参数比较）控制器（与设定参数比较） 发出调节信号发出调节信号 控制器动作控制器动作v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ lpHpH电极电极l溶氧电极溶氧电极它们是基础电极，以它们为基础可以制作各它们是基础电极，以它们为基础可以制作各种离子电极和酶电极种离子电极和酶电极v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ pHpH测量测量pHpH值的测量在生物反应中普遍进行，对于生物过值的测量在生物反应中普遍进行，对于生物过程控制是一个非常重要的参数。程控制是一个非常重要的参数。1 1、pHpH的定义的定义影响化学平衡的往往是活度，而不是浓度，但

4、对影响化学平衡的往往是活度，而不是浓度，但对于稀溶液为了避免在氢离子活度很小时表达方式于稀溶液为了避免在氢离子活度很小时表达方式上的麻烦上的麻烦引进引进pH=-lgHpH=-lgH+ + H+=0.00001H+=0.00001时时 用用pH5pH5表示表示v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 2、pHpH测量方法测量方法 pHpH试纸曾经是一种广泛采用的方法试纸曾经是一种广泛采用的方法优点：方便，易操作优点：方便，易操作缺点：它主观性较强缺点：它主观性较强 质量差异，不同厂家不同批号的质量差异，不同厂家不同批号的pHpH试纸测试纸测出的出的pHpH值会有较大的差别，

5、有时甚至达值会有较大的差别，有时甚至达0.510.51。对于一些要求较高的场合就适用对于一些要求较高的场合就适用pHpH试纸试纸pHpH电极电极v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 溶液溶液X 指示电极指示电极该电池的参比电极的输出电位恒定，该电池的参比电极的输出电位恒定，指示电极的输出电位随被测体系中指示电极的输出电位随被测体系中氢离子活度而变化。因此整个自发氢离子活度而变化。因此整个自发电池的电动势就是被测体系中氢离电池的电动势就是被测体系中氢离子活度的函数。子活度的函数。 E=E0- ln1/ =E0-2.303 pHFRTaHFRT式中式中E0对某一给定电极为

6、常数，是温度的函数，因此从对某一给定电极为常数，是温度的函数，因此从电位差计的电位差计的E值可测出值可测出pH值。值。v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 甘汞电极（甘汞电极（a）232型（型（b）217型型1导线；导线；2加液口；加液口；3-KCl溶液；溶液；4素烧瓷芯；素烧瓷芯；5铂丝；铂丝；6Hg；7Hg2Cl2一般的参比电极是甘汞电极。电极的外壳是玻璃管，里面套一根小一般的参比电极是甘汞电极。电极的外壳是玻璃管，里面套一根小玻璃管，其顶部伸出电极引线，引线的下端浸没在汞中，汞的下端玻璃管，其顶部伸出电极引线，引线的下端浸没在汞中，汞的下端有糊状甘汞，汞和甘汞用

7、棉花堵住，只有离子才能通过，而汞和甘有糊状甘汞，汞和甘汞用棉花堵住，只有离子才能通过，而汞和甘汞不会漏失，小管和大管之间充满汞不会漏失，小管和大管之间充满KCl溶液，末端用多孔陶瓷渗入溶液，末端用多孔陶瓷渗入到溶液中，实现电极引线与溶液间的电导通。到溶液中，实现电极引线与溶液间的电导通。u参比电极参比电极v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 由此可见，甘汞电极是由金属汞及其难溶盐由此可见，甘汞电极是由金属汞及其难溶盐氯氯化亚汞以及含氯离子的电解质溶液组成。这种半电化亚汞以及含氯离子的电解质溶液组成。这种半电池可表示为池可表示为Hg(L) Hg2Cl2(S) Cl-(L

8、) 电极电位产生电极电位产生于汞和甘汞的界面，其电极反应为：于汞和甘汞的界面，其电极反应为： 2Cl-+2Hg Hg2Cl2+2e-其电极电位为其电极电位为Cl/HgCl,Hg= + ln1/0,/HgHgClClFRTCl 由此可见甘汞电极的电极电位只与氯化钾的活由此可见甘汞电极的电极电位只与氯化钾的活度有关而不受被测溶液的酸碱度影响度有关而不受被测溶液的酸碱度影响v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ l离子选择性电极的结构离子选择性电极的结构离子选择性电极的结构离子选择性电极的结构其中敏感性膜部分随组成其中敏感性膜部分随组成材料的不同而各有特色。材料的不同而各有特

9、色。测定测定pH值的玻璃电极的值的玻璃电极的敏感膜是厚度为敏感膜是厚度为101103mm的玻璃薄膜，其的玻璃薄膜，其电阻为电阻为50500m。v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ SiO-H+Na+ 使膜表面形成以使膜表面形成以 SiO-H+为主要成分的水合硅胶层，为主要成分的水合硅胶层，厚度约为厚度约为10-410-5mmv微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 试试水合硅胶层水合硅胶层 干干 玻玻 璃璃 层层水合硅胶层水合硅胶层内参比溶液内参比溶液1 1 2 2 1-2以以1、2分别表示试液分别表示试液内与内参比溶液中内与内参比溶液中H+离离

10、子活度，子活度，1、2分别表分别表示外侧与内侧硅胶层表示外侧与内侧硅胶层表面面H+离子活度，离子活度， 由于水合硅胶层表面与由于水合硅胶层表面与内（内参比溶液）、外内（内参比溶液）、外（试液）溶液中的（试液）溶液中的H+离离子从活度大的一方向小子从活度大的一方向小的一方迁移，使玻璃膜的一方迁移，使玻璃膜的外、内侧分别产生相的外、内侧分别产生相界电位界电位1和和2。经水浸泡经水浸泡后的玻璃后的玻璃膜截面成膜截面成为三层结为三层结构，如图构，如图:则有：则有：外侧外侧: 1=K1+11LnFRT内侧：内侧：2=K2+22LnFRTv微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 21

11、LnFRT由于内参比溶液的由于内参比溶液的H+活度活度2一定，故玻璃膜电位一定，故玻璃膜电位与待测溶液的与待测溶液的H+离子活度（离子活度（pH值）成线性关系。值）成线性关系。v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ HLnFRT在在25下：下：膜膜=常数常数-0.0591pH（试液）（试液）但实际上玻璃膜内外侧表面性状总有微小差别，即使但实际上玻璃膜内外侧表面性状总有微小差别，即使1=2时，时，膜膜0，这差别所产生的电位叫不对称电，这差别所产生的电位叫不对称电位（位（不对称不对称），这样整个玻璃电极（指示电极）的电），这样整个玻璃电极（指示电极）的电位应是内参比电位、膜

12、电位与不对称电位之和。位应是内参比电位、膜电位与不对称电位之和。v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ +膜膜+不对称不对称其中，其中， 0 与与不对称不对称对于特定的电极是恒定的，对于特定的电极是恒定的，故玻璃电极的电极电位与试液故玻璃电极的电极电位与试液pH值呈线性关系。值呈线性关系。（4）玻璃电极的性能）玻璃电极的性能l存在不对称电势存在不对称电势不对称电势产生于电极敏感玻璃膜部分，由于膜内外不对称电势产生于电极敏感玻璃膜部分，由于膜内外表面状态不完全一样引起的，它与温度、玻璃组成、表面状态不完全一样引起的，它与温度、玻璃组成、敏感膜厚度及加工状况等因素有关。不对

13、称电势可以敏感膜厚度及加工状况等因素有关。不对称电势可以用已知用已知pH值的标准缓冲液来校正值的标准缓冲液来校正 v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 电极电位为零时的溶液电极电位为零时的溶液pH值称为零电势值称为零电势pH值，值，该值取决于内参比溶液的该值取决于内参比溶液的pH值。含有值。含有0.025mol/l的的 KCl和等摩尔浓度的磷酸混合缓冲液的等电势和等摩尔浓度的磷酸混合缓冲液的等电势点为点为pH=7，在，在pH7时，玻璃电极的极性时，玻璃电极的极性发生改变。发生改变。v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 玻璃电极的实际转换系数并

14、不是在整个玻璃电极的实际转换系数并不是在整个pH范围都是常数，因而响应曲线会偏离直线，范围都是常数，因而响应曲线会偏离直线，实际的实际的pH响应曲线如图响应曲线如图测量值测量值pH在碱性范围内在碱性范围内pH10 k降低，测量值偏高降低，测量值偏高在酸性范围内在酸性范围内pH1 k升高，测量值偏低升高，测量值偏低v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 隔膜隔膜 被测被测体系体系 玻璃敏感膜玻璃敏感膜 内参比电极之间达到电内参比电极之间达到电导通，组成原电池，其原理与双电极导通，组成原电池，其原理与双电极pH计的工计的工作原理完全相同，只是结构更紧凑，使用更方便。作原理完

15、全相同，只是结构更紧凑，使用更方便。v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 敏化离子选择性电极敏化离子选择性电极以离子选择性电极为基础电极，通过化学反应或以离子选择性电极为基础电极，通过化学反应或生化反应使离子选择性电极的响应得到敏化，叫生化反应使离子选择性电极的响应得到敏化，叫作敏化离子选择性电极。包括有气敏电极和酶电作敏化离子选择性电极。包括有气敏电极和酶电极等。极等。v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 在某种离子选择性电极的表面覆盖一层憎水的透在某种离子选择性电极的表面覆盖一层憎水的透气膜，在透气膜和这种离子选择性电极之间充以中间气膜，

16、在透气膜和这种离子选择性电极之间充以中间溶液，透气膜不允许溶液中的离子通过，而只允许被溶液，透气膜不允许溶液中的离子通过，而只允许被测定的气体通过，直到透气膜内外两边该气体的分压测定的气体通过，直到透气膜内外两边该气体的分压相等。相等。 进入透气膜的气体与中间溶液起反应，从而使中进入透气膜的气体与中间溶液起反应，从而使中间溶液中的某一被离子选择性电极响应的物质的量发间溶液中的某一被离子选择性电极响应的物质的量发生变化，并通过选择性电极电位反映出来，达到间接生变化，并通过选择性电极电位反映出来，达到间接表征被测气体含量的目的。表征被测气体含量的目的。v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数

17、检测http:/ 能用气敏电极测定气体有能用气敏电极测定气体有CO2、NH3、SO2、NO2、H2S、HCN、HF、Cl2、Br2、I2的蒸气的蒸气等，其中以氨电极比较成熟，应用较广。等，其中以氨电极比较成熟，应用较广。 1、NH4的测量的测量氨是酶反应中最常见的产物和反应物，氨离氨是酶反应中最常见的产物和反应物，氨离子可用氨气敏电极来测定。常用的氨电极为：子可用氨气敏电极来测定。常用的氨电极为：v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 1mol/L的的NH4Cl溶液。氨电极使溶液。氨电极使用的上限为用的上限为1mol/L,下限为下限为10-6mol/L。v微生物培养过程

18、的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ HCO3-+H+产生的氢离子引起产生的氢离子引起pH的变化，就可以测出溶解的变化，就可以测出溶解CO2的浓度。如果的浓度。如果CO2扩散在水或扩散在水或NaHCO3的水的水溶液中，它们的溶液中，它们的pH值会依据下列的式子而变化：值会依据下列的式子而变化：v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ pH=常数常数lg 2COp在在NaHCO3溶液中溶液中 pH=常数常数-lgpCO2在在NaHCO3溶液中测量能方便地确定溶液中测量能方便地确定pH和和pCO2之间的对应关系。使用特殊的气体渗透膜，它之间的对应关系。使用特殊的气体

19、渗透膜，它能够使能够使CO2扩散到扩散到NaHCO3溶液中去，溶液中溶液中去，溶液中pH变化就是变化就是CO2实际分压的测量值实际分压的测量值 v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 0.5%，量程，量程的线性范围大，虽然仪器价格高，但在生物细胞的线性范围大，虽然仪器价格高，但在生物细胞培养时常被采用。培养时常被采用。不分光红外线不分光红外线CO2气体分析原理是：除了单原子气体分析原理是：除了单原子气体（如氖、氩等）和无极性的双原子气体（如气体（如氖、氩等）和无极性的双原子气体（如氧、氢、氮等）外，几乎所有气体都在红外波段氧、氢、氮等）外，几乎所有气体都在红外波段（即微

20、米级）具有不同的红外吸收光谱，（即微米级）具有不同的红外吸收光谱，CO2的的红外吸收峰在红外吸收峰在2.62.9m和和4.14.5m之间有两之间有两个吸收峰，根据吸收峰值可以求出个吸收峰，根据吸收峰值可以求出CO2的所含浓的所含浓度。度。v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 3、排气氧、排气、排气氧、排气COCO2 2和呼吸熵和呼吸熵v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 2NH3+CO2通过通过NH3或或CO2气敏电极测定气敏电极测定NH3或或CO2的分压的分压即可达到间接测定尿素的目的。即可达到间接测定尿素的目的。4 4、酶电极、酶电极v微

21、生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 溶氧的测定溶氧的测定 对于好氧微生物来说氧的供应十分重要，了解对于好氧微生物来说氧的供应十分重要，了解发酵过程中溶氧情况是发酵控制的关键方面。现在发发酵过程中溶氧情况是发酵控制的关键方面。现在发酵中溶氧测定大多用溶氧电极来测定。溶氧电极可分酵中溶氧测定大多用溶氧电极来测定。溶氧电极可分为极谱型和原电池型。为极谱型和原电池型。 极谱型极谱型 需极化电压及放大器，耗氧少，受气流影需极化电压及放大器，耗氧少，受气流影响小响小 原电池型原电池型 简单便宜，适于中小罐。耗氧较大，受简单便宜，适于中小罐。耗氧较大，受气流和气泡影响大。气流和气泡影

22、响大。v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 敞口式敞口式 封闭式封闭式v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 在电极的玻璃管上有一个小孔，使在电极的玻璃管上有一个小孔，使玻璃管与环境相通，这样在蒸汽灭菌时电极玻璃管与环境相通，这样在蒸汽灭菌时电极玻璃管内外压力相等，有利于保护电极玻璃管内外压力相等，有利于保护电极封闭式的电极玻璃管上没有小孔，蒸汽灭菌封闭式的电极玻璃管上没有小孔，蒸汽灭菌时玻璃管受压大时玻璃管受压大现在使用的大多数是敞口式电极现在使用的大多数是敞口式电极v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 1、复膜氧电

23、极的工作原理、复膜氧电极的工作原理阴极由铂、银、金等贵金属组成，阳极由铅、锡、阴极由铂、银、金等贵金属组成，阳极由铅、锡、铝等组成铝等组成 。当给电极施加极谱电压（。当给电极施加极谱电压（0.60.8V负负电压）时，溶液中的氧就在阴极被还原。当产生电压）时，溶液中的氧就在阴极被还原。当产生的电流与溶液中氧含量成正比时，此时的电极电的电流与溶液中氧含量成正比时，此时的电极电流为饱和电流，此时的电压为极谱电压。氧浓度流为饱和电流，此时的电压为极谱电压。氧浓度与饱和电流成正比关系。与饱和电流成正比关系。v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 2OH-阴极上失去电子后，阳极反应

24、产生的电子流向阴阴极上失去电子后，阳极反应产生的电子流向阴极，于是在二电极之间形成电流，将氧的信号转极，于是在二电极之间形成电流，将氧的信号转变成电信号。氧浓度越高，电流越大。变成电信号。氧浓度越高，电流越大。阳极上的反应是：阳极上的反应是：Pb+2ACO- Pb(ACO)2+2e-化学信号转变成电信号化学信号转变成电信号v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 2、电极的构造、电极的构造在阴极银（铂）在阴极银（铂）片的前面包一张片的前面包一张半透膜，氧可以半透膜，氧可以透过半透膜达到透过半透膜达到阴极上进行电极阴极上进行电极反应。该半透膜反应。该半透膜固定在阴极表面。固

25、定在阴极表面。小孔用于压力补小孔用于压力补偿。偿。v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 3、溶氧电极的影响因素、溶氧电极的影响因素（1）电极的灵敏度）电极的灵敏度电极的阴极表面覆盖了半透膜之后，在一定条件下当电极的阴极表面覆盖了半透膜之后，在一定条件下当膜成为氧扩散的控制因素时，氧分压的变化与电流输膜成为氧扩散的控制因素时，氧分压的变化与电流输出的稳态有以下对应式：出的稳态有以下对应式：IS=NFA(pm/dm)pO2式中式中IS电极电流电极电流 N电子数电子数 F法拉第常数法拉第常数 A阴极表面积阴极表面积 Pm氧在复膜中的穿透系数氧在复膜中的穿透系数 PO2被测溶

26、液中的氧分压被测溶液中的氧分压 dm膜的厚度膜的厚度v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 因为电极表面的氧浓度与液因为电极表面的氧浓度与液体主流中的氧浓度存在浓度梯度体主流中的氧浓度存在浓度梯度搅拌速度、通气量和培养液粘度搅拌速度、通气量和培养液粘度v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 4、电极的标定、电极的标定一般测定中应进行以下二点标定一般测定中应进行以下二点标定（1）零点标定）零点标定用饱和用饱和Na2SO3作无氧状态的溶液，将氧电极放入作无氧状态的溶液，将氧电极放入该溶液中，显示仪表上可见溶氧浓度下降，待下降该溶液中，显示仪表上可见溶

27、氧浓度下降，待下降稳定后，调节零点旋钮显示零值。稳定后，调节零点旋钮显示零值。 （2）饱和校正（满刻度）饱和校正（满刻度） 进行简便测定时，可以采取空气饱和方式。将电进行简便测定时，可以采取空气饱和方式。将电极放入培养液中，通气搅拌一段时间，显示仪上极放入培养液中，通气搅拌一段时间，显示仪上可见溶氧上升，待上升稳定，调节满刻度旋钮至可见溶氧上升，待上升稳定，调节满刻度旋钮至100%即为饱和值。即为饱和值。v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ r的测定的测定(1)用溶氧电极测定用溶氧电极测定r要求电极响应时间短，能跟上摄氧率的变化。要求电极响应时间短，能跟上摄氧率的变化

28、。测定前先用纯水标定电极，得到单位电流代表测定前先用纯水标定电极，得到单位电流代表的溶氧浓度：的溶氧浓度： 残饱iiC*I饱饱在饱和氧浓度在饱和氧浓度C*时的电流值时的电流值I残残氧浓度为零时电极所具有的电流氧浓度为零时电极所具有的电流v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ (-i/t) 残饱iiC* t停止供气后停止供气后CL下降到最低点下降到最低点时所需时间时所需时间 i在在t时间内的电流变化时间内的电流变化v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 6、氧传递系数、氧传递系数kLakLa的测定的测定设备的设备的KLa可以用亚硫酸钠法来测定，但它

29、可以用亚硫酸钠法来测定，但它是在非发酵过程中测定的，不能完全代表发是在非发酵过程中测定的，不能完全代表发酵过程中的酵过程中的KLa值。其它测定方法有值。其它测定方法有(1)用溶氧电极和热磁氧分析仪共同测定用溶氧电极和热磁氧分析仪共同测定在发酵过程中如果溶氧浓度恒定在一定值表示在发酵过程中如果溶氧浓度恒定在一定值表示此时供氧和需氧达到平衡，即此时供氧和需氧达到平衡，即 r=KLa(C*-CL)式中式中C*可以查得，可以查得，CL可以用溶氧电极测得，可以用溶氧电极测得，r也可算出，因此可求得也可算出，因此可求得KLa值值v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 溶解氧浓度随通

30、气变化的情况溶解氧浓度随通气变化的情况 KLa的求取的求取v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 参数的离线检测进展参数的离线检测进展（一）（一） 利用高效液相（利用高效液相（HPLC）分析代谢中间产）分析代谢中间产物物 通过中间代谢产物的测定可以深入了解微生通过中间代谢产物的测定可以深入了解微生物代谢的流向，依此来分析代谢的情况。从而有物代谢的流向，依此来分析代谢的情况。从而有的放矢的控制发酵过程的放矢的控制发酵过程v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 1、有机酸的积累、有机酸的积累 有机酸积累有机酸积累 pH下降下降 补加氨水补加氨水 在正

31、常代谢情况下，细胞通过在正常代谢情况下，细胞通过EMP途径和途径和TCA循循环的过程是为细胞合成提供前体和能量的，按照细环的过程是为细胞合成提供前体和能量的，按照细胞经济学的原则不会供过于求，即不会出现有机酸胞经济学的原则不会供过于求，即不会出现有机酸的积累的积累若发酵后期有机酸积累会引起加入的若发酵后期有机酸积累会引起加入的NH4+积累，积累，相应出现产苷速率下降。相应出现产苷速率下降。代谢不正常代谢不正常v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 2、氨基酸的积累、氨基酸的积累在有机酸分析的基础上进一步通过在有机酸分析的基础上进一步通过HPLC测定发酵过程中不同时间发酵

32、液中氨基酸，测定发酵过程中不同时间发酵液中氨基酸，结果发现总氨基酸积累并且其积累晚于有结果发现总氨基酸积累并且其积累晚于有机酸和机酸和NH4+积累。积累。v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 3、分析原因、分析原因发酵过程中积累的氨基酸主要是丙氨酸，而丙氨发酵过程中积累的氨基酸主要是丙氨酸，而丙氨酸的合成可以直接由丙酮酸转化而来，因此可以酸的合成可以直接由丙酮酸转化而来，因此可以推断由于推断由于EMP途径代谢流的增加造成了丙酮酸的途径代谢流的增加造成了丙酮酸的积累，丙酮酸随后转化为丙氨酸积累，丙酮酸随后转化为丙氨酸丙氨酸本身又会对谷氨酸合成酶（丙氨酸本身又会对谷氨酸合

33、成酶（GS）造成反馈）造成反馈抑制和阻遏，使产苷速率降低。抑制和阻遏，使产苷速率降低。v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 氨水补加增加氨水补加增加NH4+积累积累抑制抑制GS抑制抑制TCA循环循环丙酮酸积累丙酮酸积累激活磷酸果糖激酶激活磷酸果糖激酶EMP流量增加流量增加恶性循环恶性循环丙氨酸丙氨酸积累积累v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 代谢流迁移的酶学证明代谢流迁移的酶学证明糖代谢途径关键酶糖代谢途径关键酶糖酵解途径（糖酵解途径（EMP）在糖酵解途径中有两个不可逆的步骤的酶：在糖酵解途径中有两个不可逆的步骤的酶：磷酸果糖激酶和丙酮酸激

34、酶磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶 磷酸果糖激酶的时序分析磷酸果糖激酶的时序分析v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 磷酸戊糖途径（磷酸戊糖途径（HMP）关键酶）关键酶磷酸戊糖途径中主要的限速酶是磷酸戊糖途径中主要的限速酶是6磷酸葡萄糖脱磷酸葡萄糖脱氢酶，该酶催化氢酶，该酶催化6磷酸葡萄糖脱氢生成磷酸葡萄糖脱氢生成6磷酸葡磷酸葡萄糖酸内酯萄糖酸内酯。v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 螺旋霉素生物合成代谢网络途径螺旋霉素生物合成代谢网络途径 v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参

35、数检测http:/ 螺旋霉素生物合成中间物动态流量分布图螺旋霉素生物合成中间物动态流量分布图 哪个代谢中间物过多积累哪个代谢中间物过多积累v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 要减少要减少FO-FO-转化为转化为FO-必须降低必须降低C3酰化酶的活力，但这与酰化酶的活力，但这与SP、SP合成有矛盾合成有矛盾在发酵结束时，在发酵结束时， SP-SP-还有一定的积累，如能最大还有一定的积累，如能最大限度的转化为限度的转化为SP-SP-、SP-SP-，即加强步骤，即加强步骤3 3对发酵对发酵效率和发酵效价是有积极意义的。而效率和发酵效价是有积极意义的。而FO-FO-、NSP

36、-NSP-的最终积累则导致流量浪费，因为这两种物质最的最终积累则导致流量浪费，因为这两种物质最终不能转化为目的产物。因此必须减小步骤终不能转化为目的产物。因此必须减小步骤4 4的通的通量。但由于这几个步骤的转化都是由量。但由于这几个步骤的转化都是由C C3 3酰化酶催化酰化酶催化反应，这给改变通量带来一定的困难。反应，这给改变通量带来一定的困难。v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96发酵时间（h）质量浓度（g/L）乙酸丁酸图图2 有机酸前体的动态流量分布图有机酸前体的动态流量分布图v微生物培养过程的参数检测微生

37、物培养过程的参数检测http:/ 2中，乙酸和丁酸在从中，乙酸和丁酸在从4040小时开始积累小时开始积累并在并在6464小时达到最高值，对照图小时达到最高值，对照图3 3螺旋霉素螺旋霉素生物合成代谢网络途径生物合成代谢网络途径99，我们可以推测在，我们可以推测在发酵中前期在图发酵中前期在图3 3中的步骤中的步骤1 1也即大环成环步也即大环成环步骤有一定程度的骤有一定程度的“瓶颈瓶颈”影响，从而导致乙影响，从而导致乙酸、丁酸有一定的积累。若能加强这一步骤酸、丁酸有一定的积累。若能加强这一步骤的通量，应能提高代谢网络的通量，提高螺的通量，应能提高代谢网络的通量，提高螺旋霉素的效价。旋霉素的效价。我们测定了内酯环合成相关的酶活我们测定了内酯环合成相关的酶活前体前体的活化的活化v微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测http:/ 测定酶活并建立酶活趋势曲线。测定酶活并建立酶活趋势曲线。分析：两种酶在发酵过程中都有两个活性高峰期分析：两种酶在发酵过程中都有两个活性高峰期, ,但但出现的时间相差很大。出现的时间相差很大。酰基激酶的活性高峰期主要集中在发酵中前期酰基激酶的活性高峰期主要集中在发酵中前期酰基酰基CoACoA合成酶的活性高峰期主要集中在发酵中后合成酶的活性高峰期主要集中在发酵中后