真核细胞基因表达的调控

1、MCB课程 真核细胞的基因表达和调控一，生物体内遗传物质的基本结构和功能单位是基因 上个世纪70年代在细胞生物学，细胞遗传学和生物化学的基础上，经过一系列重大发现而奠定基础，逐步发展形成了分子生物学(molecular biology)这一现代生命学科。分子生物学认为生物体内存在着决定生物体性状的遗传物质，其基本的结构和功能单位是基因(gene)。基因的本质是一段携带着能合成功能蛋白质所需的全部信息的DNA，其中包括着蛋白质的编码序列，也包括非编码的调控序列。基因主要具有两大功能。一是指导合成蛋白质，通过蛋白质发挥的功能将遗传信息转换成具体的细胞性状和功能；二是通过细胞有丝分裂过程中的DNA复

2、制(replication)，将遗传信息传递给子代细胞，从而保持子代细胞与母代细胞性状的一致性。基因在双螺旋结构的DNA长链组成的染色体上呈线性排列。在哺乳动物的真核细胞中线性排列的基因以核小体 (nucleosome) 的形式被紧密包绕存在于细胞核中，组成核染质(chromatin)。核小体的核心是由H2a,H2b,H3和H4四组组蛋白形成的八聚体，核心外包绕着1又3/4圈的DNA长链。因此在电镜下核染质呈“串珠样“结构。由于基因的本质是呈双螺旋结构的方向相反的两条脱氧核糖核酸（DNA）分子，因此基因的排列具有方向性，其DNA分子的5端为基因的上游，3端为基因的下游。构成基因DNA分子序列的

3、有腺嘌呤（A）胸腺嘧啶（T）胞嘧啶（C）和鸟嘌呤（G）4种碱基。在双链DNA分子中一条DNA分子上的A总是以两条氢键与 另一条DNA分子上的T相结合，而C总是以三条氢键与G相结合。A与T，C与G之间称为互补关系(complementary)。双链DNA分子中A,T,C,G的不同组合排列形成了三联密码，每一个三联密码都代表着一种相应的氨基酸。然而，基因中的编码序列往往并不连续，其中间隔着非编码的序列。这些编码的序列称为基因结构中的外显子，而非编码序列称为内含子。在基因的上游端具有启动基因表达作用的特殊序列称为启动子，它们的序列中富含A,T,C, 在基因的上游，下游较远处，乃至基因内部还有某些序列

4、对基因的表达有明显的促进作用，称为增强子。基因的下游端往往还有基因表达的终止信号。上述基因本身的主要结构统称为基因的顺式元件，而参与基因表达过程的基因外的蛋白质因子称为基因的反式元件（见下节）。上述排列着基因的DNA成为基因组DNA，真核细胞中除了基因组DNA携带遗传信息外，线粒体中能独立复制的DNA也携带着遗传信息。( 图1: 分子生物学的中心法则-基因的表达 ) 二，生物个体的基因型决定了表现型分子生物学的中心法则 生物体内基因所携带的遗传信息是通过分子生物学中心法则(central dogma)所表述的过程转变成生物体的性状的。中心法则表明，一方面基因作为DNA可以通过复制使遗传信息传递

5、给新生的DNA分子，从而传给子代细胞。另一方面，携带遗传信息的DNA分子可以作为模版，通过转录(transcription)而传递给转录产物RNA（核糖核酸）分子, RNA又能通过翻译(translation)将其携带的遗传信息再转换成多肽/蛋白质，从而使基因所携带的遗传信息最终转换成功能蛋白质而赋予生物体细胞特定的性状。基因的遗传信息从DNA的形式最终转换成功能蛋白质的整个过程称为基因的表达。生物体内基因的结构和功能形式称为基因型(genotype)，而生物体表现的外部形状称为表现型(phenotype)。所以，理论上生物体有怎样的基因就会产生怎样的性状。生物体的基因型决定了表现型。但在实际

6、的具体生物个体上，基因型与表现型的关系不一定很明确。特别是在真核细胞生物中，一方面其细胞中含有比原核细胞复杂得多的遗传物质，其基因的数目成千上万，基因结构更精细更复杂。而这些遗传物质以一定的方式被紧紧包裹压缩在细胞核内的极小的空间里。另一方面，真核细胞生物大多数为多细胞生物，生物体内往往已进化出多种组织细胞，它们具有完全相同的基因型，却在生物体生长发育的不同阶段表现出不同的表型和功能。 所以，作为多细胞组成总体的真核细胞生物来说，许多基因的功能不一定能在外部明确表现出来，许多基因的功能之间可以重叠和互补，因而掩盖了某一单个基因的功能。同时，具有某一种功能的基因都是以等位基因的形式成对地分别排列

7、在一对染色体的相应位点上的。如果等位基因中的一个基因发生缺损，另一基因仍正常发挥功能，生物体的性状并不发生改变，必须两个基因都失去功能，生物体的性状才会发生改变。这样的基因称为隐性基因。如果等位基因中的一个基因发生缺损生物体的性状即发生改变。这样的基因称为显性基因。此外在形成生殖细胞的减数分裂过程中，线性排列在一对染色体上的几个基因有可能由于一段染色体的同源交叉(crossover)而变换位置，发生重组。如果不同基因之间距离很近，往往同时变换位置，因而重组体的子代细胞中，它们决定的几种性状也往往同时出现或改变。这些基因之间称为具有连锁关系(linkage). 位于性染色体X上的基因为性连锁基因

8、，它们所决定的性状与一定的性别同时出现，称为伴性遗传。 总之，真核细胞生物的基因型和表现型之间的相互关系日趋复杂和精细，而两者之间的关系，即细胞的基因型如何转换成表现型，就取决于基因如何表达的过程和被调控的机理。 Staudt LM. N Engl J Med. 2003;348:1777-1785三，真核细胞内基因的表达过程和调控机理 真核细胞内的基因表达是一个多步骤的，连续的，精细复杂的过程。主要可分为转录，转录后加工，翻译和翻译后修饰三个大阶段。转录是基因表达的第一步，是在细胞核内由单链的基因组DNA为模版，以RNA聚合酶和一系列酶为工具进行的合成反应，其产物是单链的RNA分子。转录从基

9、因上游5端的启动子开始，RNA聚合酶II为主的转录复合物（主要是通用转录因子GTFs与其他因子构成的全酶 holoenzyme）.结合到启动子上后不断沿着DNA模版向基因的3端移动，转录也即开始从基因的5端向3端进行。直到RNA聚合酶II为主的转录复合物达到模版上基因的终止信号后，转录复合物即与模版分离，使转录停止。转录过程中RNA聚合酶II根据与DNA模版序列的互补原则，将带有四种碱基的核苷酸聚合成RNA分子，不过RNA中不存在T，由与A互补的U代替。为了使RNA聚合酶和其他蛋白质因子易于结合到基因的启动子上，首先必须使基因所在的核染质的空间构型松解开放，双链DNA必须解聚为单链，这些都需要

10、一系列酶的参与，如拓扑酶，解旋酶等，也涉及核染质构型的重塑机制 (chromatin remodeling). 这一过程主要是由构成核小体中的组蛋白在核内酶的作用下发生周期性的乙酰化和去乙酰化，从而使核染质的构型不断发生紧缩闭合和松解开放的交替变化。当核染质松解开放时，外来的转录因子等蛋白质容易接近而与DNA上基因的转录启始点结合而启动基因的转录；反之，当核染质变得紧缩闭合时，外来的转录因子等蛋白质难以接近DNA上基因的转录启始点，因而抑制基因的转录。AcetylationDeacetylation （图2: 核小体组成的核染质的重塑）新生的转录产物RNA称为核内不均一RNA，很不稳定，容易降

11、解。必须经过RNA的转录后加工(post-transcriptional processing)才能成为稳定的mRNA. 大约只有15-20%的核内不均一RNA被加工成mRNA.，通过细胞核核膜上的核孔输出到细胞质中，到核糖体上进一步翻译。RNA的转录后加工主要包括在5端加上 M-7Gppp 帽，在3端加上约20个多聚腺苷酸 (poly A)的尾,以及RNA分子的剪切(splicing). 剪切是复杂精细的过程，由核内剪切子(spliceosome)或称snRNPs介导进行，它可识别RNA中内含子5端和3端的GU和AG，将前后两个外显子的两端拉近，中间内含子部分形成的攀被RNA酶切除后，各外显

12、子就连接成完整的mRNA.。由于剪切过程中可以发生不同的剪切方式，即选择性剪切 (alternative splicing), 形成的mRNA.中可能含有同一基因的多段不同的外显子成分，因而可翻译成几种结构和功能不完全相同的蛋白质异构体。使单一的基因可以编码几种蛋白质。mRNA在细胞质内翻译的场所是核糖体(ribosome),它由60S 和40S的两个亚单位组成，其中分别含有28S 和18S两种核糖体RNA（rRNA）。mRNA分子遭遇附着核糖体后，其戴帽的5端就从两个亚单位之间穿过并前行。也即核糖体沿着作为模版的mRNA从5端向3端移动。随着移动核糖体就能读出mRNA分子序列中的三联密码，每

13、种三联密码都编码一种氨基酸，但每种氨基酸可以有几种相应的三联密码，其中AUG不编码氨基酸，而代表翻译的起始密码，UAA，UGA和 UAG代表翻译终止的密码。基因的翻译还需要转运RNA（tRNA）的参加。tRNA分子呈三叶草状，一条臂可与rRNA相连合，一条臂携带一个氨基酸，另一条臂为反密码臂。当核糖体读到某三联密码时，具有与此密码互补的反密码臂的tRNA就会结合到核糖体上，从而将相应的氨基酸带来并整合到氨基酸链上。随着氨基酸的增加，合成的肽链不断延长。直到核糖体读到终止密码，mRNA分子与核糖体分离，翻译即告终止。从AUG开始，三联密码必须遵循一定的开放阅读框架 (open reading f

14、rame ORF) 阅读，直到终止密码，才能合成正确的氨基酸肽链，如果ORF改变，合成的氨基酸肽链也就变了。例如当mRNA模版发生突变或缺失时ORF发生改变。此时，合成的肽链中某些氨基酸可能发生改变，使其功能受到一定影响，这种突变成为误义突变。也可能所发生突变或缺失使终止密码提早出现，从而使肽链不能合成或仅仅能合成很短，并导致丧失功能，这种突变成为无义突变。一条mRNA模版可以同时穿过多个核糖体，也即多个核糖体可同时按序从mRNA分子的5端向3端移动，所以一条mRNA模版可以同时翻译合成多条肽链。翻译合成的肽链尚不是最终产物功能蛋白质，还必须经过翻译后加工，包括肽链间的连接裁剪，形成蛋白质后分

15、子的折叠，以及糖基化，磷酸化，乙酰化等修饰，才能最后成为具有功能的蛋白质。 （图3: 真核细胞基因转录调控的模式图）处于某一时刻的真核细胞内并非所有的基因都在同时有同样水平的表达。对于一个细胞体内每时每刻都在进行的如此精细复杂的多步骤的连续过程，显然需要有一套精密灵敏的调控机制加以掌握，才能保证所有基因在质，量和时空各方面的准确高效表达，以敷细胞各种生理功能行为之需。如果表达调控机制出了差错，必然使细胞遭受危害，甚至是致命的打击。所以基因表达的调控机理是分子生物学理论研究的核心问题。目前可将基因表达调控的机理简单归纳如下：在转录前，主要是确定将启动表达的有哪些基因，此基因所在的核染质构型是否松

16、解开放，该基因是否具备完备有效的启动子等顺式元件和其他转录条件。而被启动表达的基因往往必须首先感知到编程的信号或来自细胞外部而传入的信号，所以这些信号和指令是基因表达的先决条件。在转录过程中，影响转录效率的主要是结合到DNA模版上的各种转录因子(transcription factor)。转录因子的发现至今已逾20年，做为基因转录的反式元件，早先对转录因子的一般概念是它含有两种结构域: DNA结合结构域使之与DNA相连，激活或抑制结构域使之能调控转录。近年的研究对转录因子的认识又有显著的深化和发展。例如，转录因子在缺乏DNA结合结构域时也可通过蛋白质之间的相互作用而与基因DNA上的启动子结合。

17、又如转录因子可同时含有激活和抑制结构域，而DNA结合结构域本身就可起转录调控结构域的作用。另一个重要概念是转录因子一般并非单独起作用，而是多个转录因子通过相互作用，协同或组成复合物形式来调控转录。转录因子的作用需要其他蛋白质作为共活化或共抑制因子参与，而转录因子的功能本身也受一些小分子或其本身翻译后的修饰所调控，这种调控可通过多渠道，并发生在多层面上。影响转录水平的另一重要机理是基因启动子序列内CpG的甲基化，高甲基化会导致基因的低转录表达，甚至使基因沉默(gene silencing). 这些机理都是当前研究的热点。转录后的调控主要作用于RNA的加工环节。新生的RNA分子能否正确地“戴帽”“

18、加尾”关系到形成的mRNA的稳定性，能否稳定地被运输到细胞质中，并顺利附着到核糖体上进行下一步的翻译。不能“戴帽”“加尾”的RNA将很快降解。另一个转录后加工的重要环节就是剪切。它关系到转录产物是否正确以及最终是否能获得功能蛋白质产物。这一步骤精细复杂，往往易出差错而影响下一步的翻译，是进行调控的重要环节。翻译过程中主要影响因素是mRNA分子5端帽结构和3端的非翻译区5-UTR和 3-UTR，其中前者的影响更大。5-UTR的突变或缺失会使翻译效率大受影响。mRNA的稳定性也是影响翻译效率的重要因素。稳定的mRNA分子可在较长时间内作为模版而翻译出较多的肽链，而不稳定的mRNA分子仅能充当几次模

19、版就降解了。综上所述，基因的表达处在非常复杂的调控机理控制下，任何环节发生问题和差错，都会导致基因表达在质，量和时空方面的异常，从而导致细胞表型的紊乱，影响细胞的正常生理功能和行为。四，真核细胞基因转录的表观遗传学调控：近年来提出了表观遗传学调控的概念。这一概念主要来自对真核细胞发育进化过程的考察发现真核细胞内的基因的数量增加与其功能的多样化完全不相称。最明显的现象是人类基因组的研究结果表明人类的基因组中只含有大约28000 - 30000个基因，而这比人们根据人类所具有的复杂功能所想象的基因数目要少得多，与简单的低等动物的基因组中的基因数相比并没有多少增加。在类似的环境下的遗传背景相似的真核

20、细胞生物，其表现出来的功能表型可以有很大的差异。这些现象提示真核细胞生物进化过程中获得的复杂多样的表型并非仅靠基因数目的增加，而更重要是靠每一个基因表达方式的增加，即单个基因表达能被编程和调控的方式变得越来越复杂多样。这些无形的基因表达和调控的方式并不因为母代细胞分裂为子代细胞而消失，相反它可以在基因数目本身和DNA序列并无改变的情况下通过减数分裂或有丝分裂而遗传给子代。所以我们现在可以将真核细胞内包含的信息分为两种：有形的遗传信息和无形的表观遗传信息。遗传信息为真核细胞制造所有必须的蛋白质提供了蓝图，而表观遗传学信息则为细胞何时何地如何使用这些蓝图提供了指令。在结构基因组学进入功能基因组学的

21、时代，很显然，研究无形的表观遗传学的调控机理比有形的基因结构的遗传学对阐明真核细胞生物的功能具有更重大深远的意义。 目前认为表观遗传学机理是细胞genotype和phenotype之间的桥梁。在细胞genotype不变的情况下，环境的作用也会通过影响表观遗传学的调控机理，从而改变细胞的phenotype。不过环境影响所致的表观遗传学的改变往往非常微细和缓慢，不易觉察，且这种改变在特定时间段内是可逆的，因此，细胞的Phenotype 的改变不一定显现出来。各组织体细胞随着正常的发育分化过程根据其内在的表观遗传学机理对基因的总体转录实行编程(program), 决定基因转录的态势，从而赋予分化成熟

22、的各组织细胞特定的表型。如果人为地改变环境而改变一系列表观遗传学作用机制，可以使体细胞内基因转录的总态势被“重编程”(reprogramming)，从而改变体细胞的Phenotype,甚至赋予成熟的体细胞新的“多能性”(pluripotency)。多细胞的真核细胞内基因表达激活的核心问题是基因所处的染色质的修饰，即一方面包裹在致密的染色质中的某个靶基因如何通过染色质组蛋白的修饰和重塑而被识别并激活，另一方面又需防止这些修饰重塑的染色质的范围蔓延扩散而使不应表达的基因被激活。典型的染色质修饰起源于基因组的某一点（一般相当于某基因的增强子），再向周围扩散，一般是单方向的。这种染色质的修饰会受到某些

23、基因边缘的DNA序列的限制，这些序列称为边界元素(boundary element)或绝缘子(insulator)，对它们的作用和机理目前所知甚少。这些序列可能与特定的蛋白质结合，也可能在复合位点中将不同组织特异性增强子分隔开，使某一时间只有一种增强子发挥功能。边界元素防止中心粒或端粒处的异染色质扩散到常染色质区域。4.1，染色质结构的重塑机理及基因转录调控 染色质结构的重塑调控基因的转录主要通过两种复合物来进行。一是ATP依赖的酶复合 物，应用ATP作为能量水解破坏和改变局部组蛋白与DNA链之间结合；二是组蛋白的乙 酰化和去乙酰化酶复合物改变组蛋白氨基端的乙酰化程度。 4.1.1, 组蛋白的

24、乙酰化和去乙酰化与基因转录活化和抑制 组蛋白的翻译后乙酰化和去乙酰化主要由组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferase, HAT）和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase, HDAC）复合物分别执行。组蛋白的乙酰化有利于基因转录的活化。近年来发现的组蛋白乙酰化酶（histone acetylase）有p300/CBP(CREB-binding protein)。它是CREB(cyclic adenosine monophosphate response element-binding protein) 转录因子的共刺激因子。许多转录因子都需与p300/

25、CBP结合成复合物来激活转录。p300/CBP本身具有乙酰化酶活性，与其结合的p/CAF和 hGCN5以及TAF250也可能有组蛋白乙酰化酶活性。这几种乙酰化酶组成的复合物被转录因子带到特异性基因启动子激活转录。此外ACTR (activator of the thyroid and retinoic acid receptor) 和 SRC-1(steroid receptor coactivator)也具有乙酰化酶活性，在某些基因转录活化中起作用。多种组蛋白乙酰化酶往往组成不同的复合物共同激活一个基因的转录，提示不同的乙酰化酶可能作用于不同的核内组蛋白底物，表明了问题的复杂性。 另一方面，

26、组蛋白的去乙酰化抑制基因的转录。长期以来就知道某些物质，如丁酸钠，trichostatin A和 trapoxin 会造成组蛋白高乙酰化。它们都是组蛋白去乙酰化酶（HDAC）的抑制剂，丁酸钠的作用较为非特异，而trichostatin A和 trapoxin分别可逆和不可逆地特异性抑制组蛋白去乙酰化酶。HDAC是进化中高度保守的，它一般都以与Sin3 和Rb等共抑制因子组成的复合物形式存在，并被某些特异的DNA结合性转录因子，如Mad, E2F和未结合配体的核激素受体，带到DNA特定序列附近。近来研究发现HDAC涉及基因前CpG的甲基化过程而抑制基因的转录，甲基化的CpG及与之特异性结合的Me

27、cp2蛋白已知能使基因沉默。目前认为是Mecp2能将Sin3和HDAC拉近DNA上的启动子序列从而抑制转录。有趣的是，大多数组装着HDAC复合物的DNA序列都可对其下游基因转录有着两种相反的调控功能，是使转录增强还是沉默取决于组装其上的是组蛋白乙酰化酶复合物，还是HDAC复合物。不同真核细胞内有多种HDAC/Rpd3蛋白质。人类的3种HDAC/Rpd3蛋白质在各种组织细胞中都表达，似乎没有组织特异性的表达谱，对 4种组蛋白底物也未报导有作用特异性。其转录抑制功能来自去乙酰化的酶学活性，如果HDAC/Rpd3突变使去乙酰化活性缺陷，则以显性负作用方式使转录抑制功能丧失。 4.1.2, ATP依赖

28、性染色质结构重塑复合物与基因转录调控 除了对组蛋白的乙酰化修饰外，另一类参与染色质结构重塑的酶复合物也调控基因的转录，它们含有腺嘌呤三磷酸腺苷酶(ATPase) 活性，能利用ATP提供能量水解而破坏或改变局部DNA与组蛋白间的相互作用。这类复合物包括酵母中的SWI/SNF 和高等真核细胞中的 BRG1和BRM. 它们都能改变核小体的结构而使转录因子易与之结合。酵母中的RSC (remodeling the structure of chromatin)和果蝇中的NURF (nucleosome-remodeling factor)都含这类复合物。这些不同物种的复合物中虽然包括不同的组分并具有各

29、异的性质，但他们都含有SWI/SNF相关的亚单位，因而具有ATPase 和螺旋酶(Helicase)活性。实验表明人类hSWI/SNF的作用是使核小体在正常构型和较开放的构型之间可逆地交互变换。这一变换之际为转录因子接近并与DNA结合提供了机会。虽然一般认为ATP驱动的染色质重塑活性与组蛋白乙酰化不同，但近来的研究表明两种活性可能密切相连。例如应用HDAC1和HDAC2单抗提纯细胞内组蛋白去乙酰化酶相关蛋白时，发现多个含有HDAC1/2的蛋白复合物，而在这样的复合物中就有两种蛋白质(CHD-3,CHD-4)是SWI/SNF样蛋白质，具有ATP依赖性染色质结构重塑活性。这种活性虽非为使组蛋白去乙

30、酰所必需，但能促进其组蛋白去乙酰化酶的活性。此复合物称为NRD (nucleosome remodeling and histone deacetylases), 其两种活性相辅相成，能充分地调控基因的转录。哺乳动物细胞中BRG1和BRM.具有ATPase酶活性，是SWI/SNF复合物中的主要成分，有利于促进转录。它们常与Rb蛋白相互作用，而Rb常会拉近组蛋白去乙酰化酶来抑制转录。这提示两种相反的染色质重塑活性结成对子，可能是调控转录的一种常见形式。长期以来，人们较多关注转录因子对真核细胞基因转录的作用，近两年的发现表明转录因子激活转录还必须通过与某些基本的转录复合物中的成分相互作用来实现。转

31、录需要分几步进行。第一步由上述两种不同的染色质重塑机制（组蛋白乙酰化和ATP依赖性染色质重塑活性）协同重塑细胞染色质，然后由转录因子和基本的转录复合物中的成分相互作用，并与基因启动子DNA上转录活化基序结合，从而使转录复合物参与激活转录。在这过程的开始，一类转录因子可能首先与处于核小体之间的DNA上转录因子结合位点结合，并将组蛋白乙酰化酶复合物拉近DNA而乙酰化核小体中的组蛋白，开放核小体结构，使之易于接受其他转录因子或基本转录复合物。然后第二类转录因子再引入其他基本转录复合物而激活转录。同样，转录抑制可能也是这样两步的过程。 4.1.3, DNA甲基化和染色质蛋白甲基化对基因转录的影响 基因

32、组含有遗传(genetic)和表观遗传(epigenetic)两类信息。遗传信息为合成生命所需的全部蛋白质提供蓝本，而遗传外信息为遗传信息在何时何地如何发挥作用提供指令。最重要的遗传外信息是DNA的甲基化，也即在CpG中的胞嘧啶的5位上以共价键加上甲基基团的态势。DNA的甲基化对哺乳动物的基因组有重大的影响，包括对基因转录的抑制，染色质结构修饰，X染色体失活和基因组的完整性和稳定性等。CpG的甲基化由三种独立的甲基转移酶DNMT1, DNMT3A 和DNMT3B催化。最近还克隆了第四种甲基转移酶DNMT2。利用果蝇基因敲除实验表明DNMT3属于“初始类”（de.novo）,而DNMT1属于“维

33、持类”（maintenance）。因为DNMT1敲除的ES细胞仍能保持初始的甲基化活性，而DNMT3A 和DNMT3B的纯合缺失并不能改变ES细胞中已存在的DNA甲基化态势。但DNMT1基因的杂合性缺失却造成甲基化胞嘧啶的含量减少70%。不过某些转基因实验的结果也提出了争议。有可能此3种DNMT酶在体内都具有起始和维持甲基化的功能，它们对特定的基因组DNA的转甲基功能必须视与其他核蛋白或DNA结合因子的相互作用而定。ICF是一种极为罕见的常染色体隐性遗传病，具有严重的免疫缺陷（至少2种免疫球蛋白严重减低），伴有呼吸道感染，不同程度智力低下，发育迟缓和奇特面容。目前研究表明，ICF可能由DNMT

34、3B基因在不同区段的突变而使甲基化功能减低或影响其与其他DNA结合蛋白的相互作用所致。多种智力低下的遗传病均有细胞内甲基化的缺陷，提示甲基化介导的染色质修饰可能对脑的发育具有特殊的重要意义。在肿瘤细胞中，基因组的甲基化态势经常有很大改变。在基因组整体低甲基化的大环境中特定区域出现高甲基化。大多数低甲基化发生在正常时原本高甲基化的重复或“寄生”的元件区域，使这些转座元件的转录增加而增加了基因组的不稳定性。许多实验证据表明DNA甲基化对肿瘤发生具有早期直接的作用。例如在某些抑癌基因（如Rb）的启动子处发生高甲基化，就可使抑癌基因的表达沉默而使细胞获得增殖的优势。又如具有微卫星不稳定性的大肠癌细胞中

35、错配基因hMLH1的启动子也发生高甲基化而导致转录沉默。此外，在实验性肿瘤模型和自然发生的肺癌上皮细胞中也可测知P16INK4a的启动子高甲基化。在肿瘤细胞DNA中约45000个CpG中，有人分析了98种肿瘤标本中的1184个CpG的甲基化状态，发现平均608个CpG有异常甲基化（最高可达4500个CpG）。但甲基化程度在不同个体和不同肿瘤类型之间有差别。乳腺，头颈部和睾丸瘤的CpG异常甲基化率较低而大肠癌，脑胶质瘤和白血病细胞的异常甲基化率显著增高。此外，CpG的异常甲基化并非随机分布，提示某些基因CpG比其他处更易甲基化或某些基因CpG丢失甲基化能使细胞获得生长优势。甲基化的DNA可能通过

36、与之结合的MeCP2蛋白拉近HDAC，而使局部染色质核组蛋白去乙酰化，从而抑制转录。除了MeCP2以外，近来还发现MBD1,2,3 , RbAp46/48等蛋白质也与甲基化的DNA相连，并与染色质重塑机理相关。除了DNA甲基化外，近来发现核内组蛋白在赖氨酸和精氨酸位上的甲基化也能与组蛋白的其他翻译后修饰共同调控染色质构型和基因的转录。在H3分子的核心及尾部的多处赖氨酸位点，以及H4尾部单个赖氨酸位点可发生甲基化，此外，还有H3的三处精氨酸位点和H4上一处精氨酸位点也发生甲基化。许多转录因子和与RNA加工过程相关的蛋白质也都会甲基化，提示核内许多蛋白质的甲基化也可通过其他途径调控转录或转录后步骤

37、。在表观基因组(Epigenome)中（见下图），H3K4me1, H3K36me3和H3K4ace是染色质开放（呈常染色质），基因转录活化的标志；相反，H3K9me2,3和H3K27me3是染色质闭锁（异染色质），基因转录受抑而静息的标志。组蛋白赖氨酸的甲基化由赖氨酸甲基转移酶(KMTs或 HMTs)催化。这些酶大多数含有保守区SET结构域。与组蛋白乙酰化相同，组蛋白甲基化也是可逆的。两族赖氨酸去甲基化酶(KDMs), 包括LSD1和Jumonji酶可使H3或H4的赖氨酸去甲基化。同样，不同的酶也可使精氨酸去甲基化。这些组蛋白甲基化和乙酰化修饰相互排斥，也可相互转换，从而使不同基因的转录态势

38、处于某种动态的平衡。在静息或异染色质区域，H3K9的甲基化与DNA的甲基化相关联。 靶向H3K9 赖氨酸的酶是含SET结构域的Suv39h1. HDAC对H3K9的去乙酰化必须发生在该位点的甲基化之前。甲基化的H3K9会募集蛋白质HP1, 结合于H3K9me的HP1 则靶向激活DNA甲基转移酶 (DNMTs), 使该处的DNA发生甲基化。在整个基因组的范围内，标示出各DNA序列所处的染色质构型的表观遗传学标志，从而显示出各基因的转录活性，就形成了表观基因组。 4,1,4 非编码RNA近年来，继在细菌中发现有小RNA (约50-200核苷酸) small RNA(sRNA)可调控靶基因的翻译后，

39、在大多数真核细胞内也发现有微小RNA (MicroRNA, miRNA)能调控许多基因的转录。miRNA是约22个核苷酸的非编码RNAs (non-coding RNAs)，能够以序列特异性的方式，通过抑制转录产物的翻译和促使mRNA降解的方式调控基因的表达。人类基因组中估计有1000多种基因编码miRNAs参与细胞内的RNA干扰(RNAi) 而不编码蛋白质。 其中约半数以编码基因的内含子为模板产生，另一半来自长非编码RNA (lncRNA)，有些miRNA甚至来自失活的假基因。此外，生殖细胞内有一类特殊的miRNA称为piRNA (piwi-associated RNAs)。另一种在病毒感染

40、时产生的siRNA (small interfering RNA), 两者都能调控细胞内可移动元素的表达。miRNAs的生物合成过程主要分为两个步骤：首先在细胞核内由编码miRNA的基因为模板转录为初始转录本 (pri-miRNA), 其分子序列往往自我互补而自动折叠成双链发夹结构。此分子在细胞核内被Drosha (一种RNase III超家族成员的内切酶) 切割成约70bp的前miRNA (pre-miRNA)后转运出细胞核，到达细胞质内。第二步，再由Dicer酶催化切割成22bp的双链RNA。这些短小的双链RNA参与组成复合物RISC (RNA-induced silencing comp

41、lex)，该复合物中的Argonaute (Ago) 家族蛋白可以最终将之加工成单链的miRNA，并投递到其靶mRNA的3-UTR上发挥作用。作为一种公认的重要表遗传机理，虽然它们并不影响DNA序列的改变，但对人类的健康生长发育和疾病的发生却有着非常深远的影响。据2007年8月发布的最新资料统计，目前在人类基因组中已被确认的miRNA序列已有500多种，并预测至少还有相同数量的miRNA序列有待证实。人类细胞中约有三分之一mRNA种类都受miRNA的负调控。在进化上miRNA比较保守，其分子茎部保守性更强，而环部可能存在突变。miRNA基因以单拷贝，多拷贝和集簇等形式排列在基因组中，绝大多数位

42、于蛋白质编码的基因间隔区，独立转录，但不翻译成蛋白质，其表达水平有较强的组织特异性和时相性。miRNA一般不改变其作用靶mRNA的稳定性，而通过抑制mRNA的翻译而使基因沉默。 由于一般miRNA针对mRNA分子3端的非翻译区形成互补，并不能完全封闭其翻译，所以在表遗传的层面上miRNA本身只以一种潜在的，非直接的方式同时调控许多基因的表达。miRNA有两种方式降解和下调mRNA。如果两者高度互补，则miRNA通过去除帽和polyA的尾而切割和降解mRNA。不过大多数情况miRNA与其互补序列结合得并不完全，因此仅能抑制靶mRNA的翻译。4.2，转录因子功能的调控 转录因子的发现至今已逾20年

43、，做为基因转录的反式元件，早先对转录因子的一般概念是它含有两种结构域: DNA结合结构域使之与DNA相连，激活或抑制结构域使之能调控转录。近年的研究对转录因子的认识又有显著的深化和发展。例如，转录因子在缺乏DNA结合结构域时也可通过蛋白质之间的相互作用而与基因DNA上的启动子结合。又如转录因子可同时含有激活和抑制结构域，而DNA结合结构域本身就可起转录调控结构域的作用。另一个重要概念是转录因子一般并非单独起作用，而是多个转录因子通过相互作用，协同或组成复合物形式来调控转录。转录因子的作用需要其他蛋白质作为共活化或共抑制因子参与，而转录因子的功能本身也受一些小分子或其本身翻译后的修饰所调控，这种

44、调控可通过多渠道，并发生在多层面上。4.2.1, 转录活化和抑制结构域 (domain) 的作用机理 RNA聚合酶II对基因的转录需要在基因的启动子上组装通用性转录因子(general transcription factors GTFs) 来构成启动前复合物 (preinitiation complex, PIC). 对大多数基因启动子来说，开始由GTF-TFIID 与TATA盒结合。TFIID是一个多亚单位因子，由TATA结合蛋白（TBP）和TBP相关蛋白（TAFs）组成，再加入TFIIA, TFIIB，然后再结合上TFIIE, F, H 和RNA聚合酶II组成完整的PIC。不过，正常情况

45、下似乎许多GTF还和其他因子与RNA聚合酶II共同组成一个全酶 (holoenzyme).虽然不同方法提取的全酶的组分高度变化，但各种方法的全酶提取物中总含有几种GTFs，包括SRB (suppressors of RNA polymerase B)和MED (MEDiator) proteins.所以PIC的组装可能仅需要有限的因子，这些因子被认为对调控基因转录是最重要的。上述PIC足以在裸露的DNA模板上启动转录，但在活细胞内DNA组装成染色质，使PIC不易接近DNA。所以染色质结构必须经过重塑（见上述重塑机理）才使PIC得以与启动子结合。转录效率被严格控制，例如在细胞有丝分裂时转录过程即

46、停顿。此时转录机器被直接修饰，故影响到所有的基因。还有些机制是全局性的，如Dr1是通用的转录抑制因子，它直接接触TFIID，阻止TFIID 与TATA盒结合而使PIC不能组装。更重要的是那些作用于特异基因启动子相关序列元件而以基因特异性方式影响转录的调控因子。特定基因的转录过程包括一系列分子事件。其中有多处环节可被调控。例如染色质重塑，PIC在转录前的组装，PIC的结合使DNA模板熔为单链并由RNA聚合酶II与启动子结合，此后伴随着核小体的重塑，PIC中的多种因子脱离而变成为延长转录的新的PIC。其间，TFIID始终保持与TATA盒的结合。延长转录的复合物也是被调控的靶点。转录调控因子可在上述

47、所有环节上调控转录，某些可活化转录，某些抑制转录。不过近来发现一些转录调控因子在不同的细胞环境下既可激活，也可抑制转录。 转录活化因子的活化结构域根据其氨基酸组成大致可分为几类：一类如疱疹病毒VP16 蛋白和酵母GAL4蛋白中活化结构域那样的酸性转录活化结构域，另有谷氨酸富集（如SP1）和脯氨酸富集(如CTF1)的两类转录活化结构域。其中某几组疏水的氨基酸残基在上述三类转录活化结构域中都对其活性功能起关键作用。转录活化结构域怎样发挥功能是基因表达的中心问题。转录活化因子的作用必须与染色质重塑过程相配合。几种染色质重塑因子与转录活化结构域都相互作用。例如作为HATs的共活化因子p300/CBP与

48、转录活化蛋白 CREB相互作用，也作用于 GTFs。转录活化因子将p300/CBP拉至基因启动子，同时也会拉住ATP依赖性染色质结构重塑复合物，使组蛋白乙酰化和染色质构型失稳以便在该区域形成PIC。有证据表明转录活化因子能促进PIC的组装。TFIID与TATA结合，作为PIC 组装的第一步可能是转录活化因子作用的靶点，不过对此尚有争议。位于同一个启动子的多个转录活化因子总是协同激活转录，从而获得大大超过预期的转录水平。这可能因为不同转录因子活化结构域可与PIC中各个成分接触并相互作用，因而在PIC组装的不同步骤都影响和促进了PIC的组装。也有人认为TFIID中的TAFs与转录活化因子的协同作用

49、有关。 大致有三种机制可使特异性的基因转录被抑制：转录抑制因子可以阻止转录活化因子与启动子相结合或着可以抑制结合于DNA上的转录活化因子蛋白的功能。第三种所谓“真正的抑制因子”是指含有的转录因子抑制结构域能阻止转录复合物的形成。例如Rb既能抑制与DNA结合的 E2F的活化结构域，又具有转录抑制结构域与 HDACs接触，破坏PIC的组装。一般认为转录抑制结构域含有疏水的碱性氨基酸，如富集丙氨酸。实际上也有抑制结构域富集脯氨酸的，如在Oct2 和WT-1抑癌蛋白分子中。Eve是一种在果蝇和哺乳动物细胞中的转录抑制因子。其功能不但需要丙氨酸富集区，也需要其自身结构域。体外实验表明Eve阻止TFIID

50、与TATA结合而影响PIC 的组装。哺乳动物细胞中另一转录抑制因子Msx-1也需通过其自身结构域与TBP的相互作用来抑制转录。转录抑制因子的作用一般不互相协同。这可能因为转录活化因子在PIC组装的不同步骤都影响和促进了PIC的组装而转录抑制因子只需破坏其中一个步骤即可。活化转录的负调控子复合物 (negative regulator of activated transcription，NAT) 也包含一组SRBs 和MEDs，其转录抑制功能在于SRB10/11异二聚体，它能在PIC组装前磷酸化RNA聚合酶Pol II中的CTD，使Pol II失去功能而抑制转录。转录抑制因子的主要功能是使启动

51、子相关的染色质恢复受抑构型。它的抑制结构域作用于几种含HDAC活性的复合物而发挥作用。如NcoR (nuclear receptor corepressor) 和SMRT (silencing mediator for retinoic acid receptor and thyroid hormone receptor) 。这些复合物含有HDAC1/2 和Sin3共抑制因子。NuRD (neucleosome remodelling and histone deacetylase)复合物含有ATP依赖的核小体重塑活性SWI/SNF和HDAC1/2，也是抑制结构域的作用靶点。此复合物中还含有的

52、MBD3蛋白具有与甲基化CpG结合的结构域，而与甲基化DNA特异性结合的蛋白MeCP2也与HDAC复合物相连，进一步将DNA甲基化与HDAC活性在抑制转录方面的作用联系起来。 几种转录调控因子在不同的细胞内环境下既可激活转录也可抑制转录。例如果蝇细胞内的kruppel蛋白浓度增加时可从活化转录变成抑制转录。这与其从单体形式二聚化有关。WT1也是这样。不仅与DNA直接结合的转录调控因子，某些共调控因子也有此特性。如Mdm2对P53是共抑制因子，对E2F却是共激活因子。还有一些核激素受体在与配体结合后也会由抑制转录变成激活转录。它们未结合配体时与含有HDAC活性的NcoR/SMRT/SIN3共抑制

53、复合物接触. 当与激素配体结合后，它们脱离NcoR/SMRT/Sin3共抑制复合物，转而与含组蛋白乙酰化酶活性的p300/CBP或p/CAF复合物结合，从而激活转录。4.2.2, 磷酸化对转录因子功能的调控细胞外环境对细胞的刺激通过细胞内多种信号转递通路将信号送达细胞核内的DNA，调控基因的转录表达，使细胞从而做出相应的反应。这一调控主要是通过信号传递通路中一系列介质的磷酸化，最后作用于转录因子，使其转录活性发生快速的改变而实现的。因此，转录因子，转录共调节因子和染色质重塑因子如何受蛋白质磷酸化激酶作用而磷酸化，或受蛋白质磷酸酶作用而去磷酸化是这一调控的关键环节。这也为某些疾病中的治疗性干预提

54、供了可能的靶点。蛋白质的磷酸化或去磷酸化可以通过以下至少5种机理来调控转录因子的功能：影响转录因子在细胞核内发挥作用的持续时间；影响转录因子受蛋白水解酶降解的难易程度；影响转录因子，共调节因子和基本转录复合物之间的相互作用；影响转录因子与DNA的结合；以及修饰染色质的空间构型。具体来说，转录因子的磷酸化/去磷酸化首先能决定转录因子在细胞内的位置。虽然许多转录因子原本就在细胞核内被磷酸化/去磷酸化，但有相当多的转录因子在细胞质和细胞核之间穿梭往来。它们在细胞内的位置取决于其蛋白分子上核定位信号（nuclear localization signal, NLSs）和核输出信号（nuclear ex

55、port signal, NESs）是否能被核转运机制的蛋白所识别。转录因子的磷酸化/去磷酸化会影响NLSs和NESs被核转运机制蛋白的识别。例如在被激活的T淋巴细胞中，转录因子（NF-AT）的核浆穿梭就是受磷酸化/去磷酸化调控的。NF-AT被细胞质内钙依赖性蛋白磷酸酶（Calcineurin）作用，在丝氨酸去磷酸化后，使NF-AT被输入细胞核内。反之NF-AT可被某些蛋白磷酸化激酶（如MAPK）磷酸化后运出细胞核。磷酸化也可调控决定转录因子定位的调节蛋白的功能。如转录因子NF-k B异二聚体通常与其胞质锚定蛋白抑制分子lk B相结合，其NLS被遮盖从而防止被转位到细胞核内。当细胞对感染信号起

56、反应时，lk B的NH2端两处丝氨酸被lk B激酶（IKK）复合物磷酸化，从而易被泛素化（ubiquitination）而快速降解。这时NF-k B分子上的NLS暴露出来并被识别，NF-k B异二聚体就能进入细胞核去发挥功能了。蛋白质的磷酸化/去磷酸化不但能调控转录激活因子，也能调控转录抑制因子在细胞内的定位。其次，磷酸化可使转录因子发生蛋白酶介导的降解。这种降解最典型的是由泛素(ubiquitin）通过一组酶（如E1, E2和 E3）与靶蛋白相连而实行的。泛素化的蛋白质接着被26S蛋白酶复合物降解。上述lk B/NF-k B是最为人了解的以磷酸化/去磷酸化所致的蛋白溶酶调控的转录因子。抑癌基

57、因P53是另一个例子，作为转录因子，其磷酸化状态影响它被降解的命运。癌蛋白Mdm2与P53蛋白的NH2端相结合而抑制其转录活性，同时还起着E3泛素连接酶的作用，使P53被泛素介导的溶蛋白酶降解。当P53反转录区段的丝氨酸被磷酸化时，Mdm2与P53蛋白连接的亲和力减低，使P53蛋白的稳定性和转录活性增加。另一方面非活化的MAP蛋白激酶 JNK也与P53蛋白NH2端相结合介导泛素的蛋白溶酶降解作用。JNK的激活可使P53蛋白NH2端磷酸化,阻滞其与Mdm2的结合而使P53蛋白更稳定。转录因子与共调节因子和基本转录复合物之间存在着相互作用，许多转录因子分子中存在磷酸化依赖性转录活化或转录抑制区域。

58、这些区域的磷酸化可能直接阻挡转录因子与其他分子的联系或改变转录因子局部的空间构型，从而影响转录因子与共调节因子和基本转录复合物之间的亲和力。蛋白质磷酸化还可直接调控共调节因子本身的活性。例如细胞受刺激时CREBP (cAMP-response element binding protein)在133位丝氨酸可被许多蛋白质激酶所磷酸化（如PKA, CaMKII及 MAPK等）。Ser-133的磷酸化使之能与CBP (CREB-binding Protein)和基本转录复合物相连，从而增加了转录活性。而CBP作为一种共活化因子，其本身也需要被PKA, CaMKIV及 MAPK磷酸化才具有转录活性。基本转录复合物 (basal transcriptional complex) 中的许多成分，如TFIID, TFIIF 和TFIIH都具有磷酸化激酶活性，它们在调控基本转录复合物的转录活性方面的功能尚不清楚。蛋白质磷酸化还能直接或间接地调控转录因子与DNA上启动子的结合。许多转录因子的DNA结合区段呈碱性，而在此区段的磷酸化会引进负电荷而使之不能有效地与DNA结合。例如WT-1，作为一种含锌指结构的转录抑制因子，被PKA磷酸化其锌指区内的丝氨酸可抑制其