过氧化氢刺激人牙髓干细胞的衰老进程

1、过氧化氢刺激人牙髓干细胞的衰老进程210093 ; 2南通大学附属医院口腔徐克1,冯桂娟2,冯兴梅2,黄丹2,郑科2,唐恩溢1(1南京大学医学院,江苏省南京市科,江苏省南通市226001)引用本文：徐克,冯桂娟,冯兴梅,黄丹,郑科,唐恩溢.过氧化氢刺激人牙髓干细胞的衰老进程J.中国组织工程研究,2021, 20(10):1481-1487.文章快速阅读:DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2021.10.016ORCID: 0000-0002-2872-1905 (冯桂娟)徐克,男,1982年生, 江苏省南通市人,汉族, 2006年南通大学毕业, 主治医师,主要从事口腔

2、 颌面外科及牙髓干细胞 生物学特性方面的研究.通讯 冯桂娟,医师, 硕士,南通大学附属医院 口腔科,江苏省南通市 226001中图分类号：R394.2文献标识码：B文章编号：2095-4344(2021)10-01481-07稿件接受：2021-01-24文题释义：牙髓干细胞：2000年,Gronthos等人利用酶消化的方法,从人第三磨牙中别离出比骨髓基质干细胞具有更高克隆水平和增殖水平的牙髓干细胞.牙髓干细胞的鉴别主要依赖于它的生物学特性,包括细胞体积小、集落生成水平、高增殖水平、自我更新水平和多潜能分化水平.细胞衰老：指由DNA损伤、氧化应激、基因表达紊乱和其他有害刺激导致的不可逆的细胞生

3、长停滞,它包含了细胞增殖及功能的改变,细胞的衰老促进了机体的老化和相关疾病的发生.研究发现调节细胞衰老的机制有多种假说,例如端粒酶学说、DNA损伤学说、氧化应激学说等.摘要背景：细胞移植治疗受区存在氧化应激过程,影响疗效.研究氧化应激对牙髓干细胞的影响及机制方面的报道较少.目的：别离培养人牙髓干细胞,分析参加过氧化氢(H2O2)对其衰老程度的影响.方法：牙髓干细胞分为3组,分别用PBS、100 g mol/L H2O2、200 g mol/L H2O2刺激2 h.倒置显微 镜下观察细胞形态,半乳糖普酶染色观察细胞衰老程度,BrdU试剂盒和细胞计数法检测细胞增殖能力,免疫荧光检测细胞骨架排列情况

4、和sirt1蛋白的表达,Western Blot法测定sirt1、p16蛋白的表达.结果与结论：牙髓干细胞呈成纤维细胞样梭形外观.H2O2刺激后,细胞体积增大、3半乳糖普酶染色加深、细胞增殖水平降低,随着H2O2浓度增加,牙髓干细胞衰老增强,在此过程中,p16表达上调,sirt1表达受到抑制.结果说明H2O2刺激促进牙髓干细胞衰老,sirt1、p16参与了此过程,为牙髓干细胞移植提供了理论根底和实验支持.关键词：干细胞；培养；牙髓干细胞；过氧化氢；衰老；p16； sirt1；国家自然科学基金主题词：牙髓；干细胞；过氧化氢；细胞衰老；组织工程基金资助：国家自然科学基金青年基金工程(8150080

5、9)Xu Ke, Attending physician, Medical School of Nanjing University, Nanjing 210093, Jiangsu Province, ChinaCorresponding author: Feng Gui-juan, Master, Physician, Department of Stomatology, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001, Jiangsu Province, ChinaHydrogen peroxide accelerate

6、s senescence of human dental pulp stem cellsXu Ke 1, Feng Gui-juan 2, Feng Xing-mei 2, Huang Dan 2, Zheng Ke 2, Tang En-yi 1 (1Medical School of Nanjing University, Nanjing 210093, Jiangsu Province, China; 2 Department of Stomatology, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001, Jiangs

7、u Province, China)AbstractBACKGROUND: The process of oxidative stress that impacts the curative effect exists in the region which accepts cell transplantation. However, there are few reports about the effects of oxidative stress on human dental pulp stem cells and relevant mechanism.OBJECTIVE: To un

8、derstand the effect of hydrogen peroxide on the senescence of human dental pulp stem cells.METHODS: Human dental pulp stem cells were isolated and cultured in PBS, 100 and 200u mol/Lhydrogen peroxide for 2 hours, respectively. Cell morphology was observed under inverted microscope, degree of cell se

9、nesc ence monitored by- galactosidase staining, cell proliferation ability detected by BrdUkit and cell counting method, cytoskeleton of dental pulp stem cells and expression of sirt1 tested using immunofluorescence method, and expression of sirt1 and p16 proteins measured by western blot assay. RES

10、ULTS AND CONCLUSION:Dental pulp stem cells exhibited a fibroblast-like morphology withspindle-shaped appearance. After stimulated by hydrogen peroxide, the cell volume was enlarged, the 3galactosidase staining deepened and the proliferation of dental pulp stem cells reduced. The enhancement of senes

11、cence of dental pulp stem cells was accompanied with the increasing concentration of hydrogen peroxide, and in this process, the expression of p16 was raised while the expression of sirt1 was decreased. In conclusion, the senescence of human dental pulp stem cells can be promoted by the stimulation

12、of hydrogen peroxide, and sirt1 and p16 are involved in this process. Our findings may provide a theoretical and experimental foundation for autologous transplantation of dental pulp stem cells.Subject headings: Dental Pulp; Stem Cells; Hydrogen Peroxide; Cell Aging; Tissue Engineering Funding: the

13、National Natural Science Foundation of China, No. 81500809Cite this article: Xu K, Feng GJ, Feng XM, Huang D, Zheng K, Tang EY. Hydrogen peroxide accelerates senescence of human dental pulp stem cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2021;20(10):1481-1487.0 引言 Introduction牙髓是间充质干细胞最理想的来源之一.2000年,Gr

14、onthos等1利用酶消化法,从人第三磨牙中别离出比 骨髓基质干细胞具有更高克隆水平和增殖水平的干细 胞,并将其命名为牙髓干细胞.牙髓干细胞显示多潜 能分化水平,可以分化为各种细胞,如成骨细胞、成 牙本质细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、神经细胞和 成肌细胞等2-5.牙髓干细胞很容易被别离、培养,且 具有低免疫原性,是理想的种子细胞3' 6-7.骨缺损等部位存在缺血、缺氧、炎细胞浸润等因素8,产生大量活性氧,出现氧化应激状态,损害细胞活性,影响牙 髓干细胞移植效果9.过氧化氢(hydrogen peroxide , H2O2)是活性氧簇的主要成员之一,可通过多种途径损 害细胞10-12 o

15、既往研究显示H2O2可以诱导间充质干细胞 衰老13-17,研究氧化应激对牙髓干细胞的影响及机制, 有利于提升细胞移植的疗效.实验采用不同浓度H2O2处理牙髓干细胞,观察H2O2诱导应激性衰老细胞形态、0-半乳糖甘酶活性、细胞增殖水平、细胞骨架变化及其作用机制,为优化牙髓干细胞移植治疗疾病提供理论依据和实验根底.1 材料和方法 Materials and methods1.1 设计细胞学体外观察实验.1.2 时间及地点实验于2021年10至12月在南通大学附属医院完成.1.3 材料过氧化氢刺激人牙髓干细胞衰老实验所用主要试剂与仪器：试剂及仪器来源DMEM培养基、胎牛血清、100 U/mL 美国H

16、yClone公司 青霉素、100 mg/L链霉素3 g/L I型胶原酶、4 g/L分散酶美国Sigma公司伊半乳糖甘酶试剂盒碧云天公司BrdU试剂盒上海酶联生物科技h2o2美国Santa Cruz公司F-actin武汉艾美捷科技兔抗GAPDH抗体、兔抗人p16抗体、兔抗人sirt1抗体、鼠抗兔生物素化二抗美国Santa Cruz公司荧光显微镜德国Leica公司1.4 实验方法1.4.1 牙髓干细胞别离、培养、鉴定选择正畸减数拔除的健康牙齿标本,告知患者拔除的牙齿将用于提取牙 髓干细胞,得到所有患者知情同意,并签署?南通大学 附属医院知情同意书?.在超净台上用碘伏冲洗正畸减 数拔除的健康牙齿,再

17、用无菌生理盐水冲洗至无血迹, 用咬骨钳沿釉牙骨质界翻开髓腔,镣子取出牙髓,剪去 根部的牙髓组织.将 3 g/L I型胶原酶与4 g/L分散酶以 1 ： 1比例混合,两种酶以1 ： 10的体积与剪碎的牙髓混 合消化1 h ,消化后的组织经 1 000 r/min离心5 min ,弃 上清液,加完全培养液 体积分数为10%胎牛血清、1% 青霉素/链霉素、DMEM混匀、吹打,经 70 am过滤网 过滤,获得的细胞悬液接种于25 cm2培养瓶,参加完全培养液,之后三四天半量换液,细胞到达70%-80%融合后,用0.25%胰蛋白酶室温消化 3 min , 1 000 r/min 离心5 min ,弃上清

18、,沉淀吹打均匀,以 1 : 3比例传代. 牙髓干细胞进行成骨、成软骨、成脂肪分化水平鉴定18.1.4.2 实验分组第1组：牙髓干细胞用 PBS刺激作为对照组.第2组：牙髓干细胞用100心mol/L H2O2刺激, 持续时间为2 h.第3组：牙髓干细胞用200 m mol/L H2O2 刺激,持续时间为2 h 01.4.3 3半乳糖普酶染色取对照组和H2O2刺激组牙髓干细胞,按1X105/孔接种到24孔板中,重复3孔,进 行&半乳糖普酶染色.根据歹半乳糖普酶染色试剂盒说 明书进行操作：小心吸去 24孔板里的培养液,每孔参加 500心晴洗液A液,清洗生长中的细胞外表；去除孔 里的清洗液后每

19、孔参加 500心L固定液B液,孵育5 min ； 吸去固定液,每孔参加 500心瞰性液C液,重复1次后 去除C液,每孔参加400心L染色液,放入37 c培养箱孵 育5 ho在光学显微镜下观察和计数,0-半乳糖昔酶阳性细胞呈蓝色.1.4.4 细胞计数BrdU染色法：牙髓干细胞以3X104/孔接种于6孔板 内,PBS或不同浓度H2O2刺激2 h后,去除H2O2,继续用 普通培养基培养24 h,用BrdU试剂盒检测增殖情况.牙 髓干细胞培养液中参加 100 11 mol/L BrdU酶标液于37 C 孵化4 h,移除细胞培养液,固定细胞,FixDenat溶液使DNA变性,参加抗BrdU-POD 工作

20、液,370 nm波长处 测定裂解液的吸光度值,每组取6个平行样本进行统计.细胞计数法：牙髓干细胞以3X104/孔接种于6孔板 内,PBS或不同浓度H2O2刺激2 h后,去除H2O2,继续 用普通的培养基培养 24 h ,镜下观察,统计细胞数,每组取6个平行样本进行统计.1.4.5 F-actin免疫荧光染色免疫荧光观察H2O2刺激后牙髓干细胞的细胞骨架变化.取牙髓干细胞进行固 定,PBS清洗,血清封闭后孵育F-actin , DAPI染色液复染30 min ,荧光显微镜下观察.1.4.6 Western Blot检测sirt1和p16蛋白表达 收集牙 髓干细胞,用Western Blot分析s

21、irt1和p16表达.常规裂 解液裂解细胞,离心后收集上清,样品进行 SDS-PAGE 电泳,280 mA恒流转PVDF月190 min ,含5%脱脂奶粉 缓冲液封闭,分别用一抗 兔抗人sirt1、兔抗人p16、二 抗生物素化二抗鼠抗兔IgG进行孵育及显色观察、扫描 分析结果.1.4.7 免疫荧光检测sirt1蛋白表达收集牙髓干细胞,用免疫荧光分析sirt1表达.分别用一抗兔抗人sirt1、 二抗生物素化二抗鼠抗兔IgG进行孵育,DAPI染色液 复染30 min ,荧光显微镜下观察.1.5 主要观察指标牙髓干细胞形态.牙髓干细胞3半乳糖昔酶活性.牙髓干细胞增殖情况.牙髓干 细胞骨架排列情况.牙

22、髓干细胞衰老相关蛋白表达.1.6 统计学分析采用SPSS 16.0软件处理,数据用x太表示.组间比拟采用t检验,P < 0.05为差异有显著 性意义.2 结果 Results2.1 H2O2对牙髓干细胞形态的影响原代细胞一两天贴壁,第4, 5天细胞呈集落样生长,取第3代牙髓干细胞置于倒置显微镜下观察,细胞形态呈成纤维细胞样梭 形外观图1A.经过100, 200心mol/L H2O2刺激2 h, 细胞体积增大,变扁平,失去纺锤体样形态图1B和C.2.2 H2O2处理牙髓干细胞后&半乳糖普酶活性增加B-半乳糖普酶试剂盒检测100, 200 m mol/L H2O2刺激2 h后牙髓干细

23、胞中衰老细胞数,对照组为18.0 21% , 100 心 mol/L H2O2组为42.0 24% , 200 心 mol/L H2O2 组为79.0 +2.5% ,与对照组相比,100, 200心mol/LH 2O 2刺激后0-半乳糖昔酶阳性细胞数比例显著增加图2A-D.2.3 H2O2处理抑制牙髓干细胞增殖不同?度H2O2作用对牙髓干细胞增殖影响的吸光度值检测结果见图3A o与对照组相比,随着H2O2浓度增加,吸光度值呈浓度依 赖性降低.细胞计数法分析100, 200 amol/L H 2O2对牙髓干细胞增殖的影响,随着H2O2刺激浓度增加,牙髓干 细胞数降低图3B.图1H2O2刺激下牙髓

24、干细胞形态学改变刀00Figure 1 The morphology change of dental pulp stem cells stimulated by hydrogen peroxide 200 x图注：图中A为对照组牙髓干细胞呈成纤维细胞样梭形外观；B, C为100, 200 m mol/L H2O2刺激后牙髓干细胞失去成纤维细胞样梭形外观,细胞体积增大,变扁平,且细胞形变程度随H2O2浓度增大而增大.H2O2 mol/L对照组 1002002 0 8 6 4 2 0000值度光吸AB1003t80乂60数 胞细40200对照组 100200图2 H2O2处理牙髓干细胞后B-半乳

25、糖普酶活性增加Figure 2 The activation of -galactosidase was increased by hydrogen peroxide stimulation图注：图中A-C为对照组,1001 mol/L H2O2组,200 u mol/L H2O2组 加半乳糖普酶染色,随H2O2浓度增加,3半乳糖昔酶阳性细胞数比例显著增加刀00; D为小半乳糖普酶阳性细胞百分比与对照组比拟,aP < 0.05 0图3 H2O2处理抑制牙髓干细胞增殖Figure 3 Dental pulp stem cells grew more slowly after stimula

26、tion with hydrogen peroxide 图注：图中A为BrdU染色法分析细胞增殖情况 与对照组比拟,aP < 0.05; B为细胞计数法分 析细胞增殖情况与对照组比拟,aP < 0.05 0乩029mol/L乩02 mol/L200;H2O2刺激后牙髓干细胞骨图4 H2O2处理导致牙髓干细胞骨架排列紊乱刀00Figure 4 F-actin distribution was abnormal in dental pulp stem cells after stimulation with hydrogen peroxide 图注：图中 A-C分别为PBS、100 u

27、 mol/L、200mol/L H2O2刺激牙髓干细胞,F-actin免疫荧光染色可见架排列紊乱.2.4 H2O2处理影响牙髓干细胞骨架排列细胞免疫荧光显示100, 200 11 mol/L H2O2刺激牙髓干细胞后,细胞 骨架排列紊乱图4A-C.2.5 H2O2诱导牙髓干细胞衰老后相关蛋白表达应用Western Blot检测牙髓干细胞 sirt1和p16蛋白表达水平,结果显示：与对照组相比,随着H2O2浓度增加,sirt1表达水平呈浓度依赖性降低,p16表达水平呈浓度依赖性增高图5A, B.免疫荧光结果进一步验证,200心mol/LH2O2刺激组牙髓干细胞中sirt1的表达水平较对照组显著下

28、降图6A-F.Sirt p16GAPDHA H2O2( m mol/L)对照组100200B1.6丁 1.2水空0.8表白蛋0.40对照组100200H2O2( m mol/L)图5 H2O2处理抑制牙髓干细胞中sirt1表达,促进p16表达Figure 5 Dental pulp stem cells stimulated with hydrogen peroxide had the lower level of sirt1 and the higher level of p16图注：图中A为Western Blot法分析各组牙 髓干细胞 sirt1和p16的表达；B显示H2O2 组与对照组

29、比拟差异有显著性意义,aP <0.05 .图6 H2O2处理抑制牙髓干细胞中sirt1表达(刀00)Figure 6 Dental pulp stem cellsstimulated with H 2O2 had the lower level ofsirt1 ( 200)图注：图中A-C为PBS刺激牙髓干细胞,免 疫荧光法分析sirt1表达；D-F为200 u mol/L H 2O 2刺激牙髓干细胞,免疫荧光法分析 sirt1 表达水平较对照组显著下降.3 讨论 Discussion牙髓干细胞具有多向分化和高增殖水平,与骨髓间 充质干细胞比拟,其增殖水平、成骨分化水平和成软骨 分化水平

30、更高18.牙髓干细胞不仅可以应用于牙缺失、 骨缺损的修复,而且可以应用于关节炎、心脏疾病、肌 肉萎缩等治疗,取得了良好的治疗效果19-21 O虽然牙髓干细胞的治疗已经取得了一些进展,但成功的细胞移植 治疗还取决于牙髓干细胞体外培养条件和体内移植的 局部微环境.损伤区的缺血、缺氧、炎细胞浸润等因素, 可导致出现氧化应激状态,过量的活性氧损害细胞活 性,降低其在损伤区的存活率,极大限制了牙髓干细胞 的移植效率22-24 OH2O2是活性氧簇的主要成员之一,可通过多种途 径损害细胞,使细胞膜脂质过氧化,抑制蛋白质的功能, 破坏核酸和染色体等25-26 o既往研究显示异常增高的活 性氧不利于干细胞静息

31、状态的维持和干细胞增殖,适量 增加活性氧那么有利于局部类型干细胞的增殖和分化.此外,干细胞内低浓度活性氧是维持其静息状态的重要保 证,适当增高活性氧浓度那么可促进干细胞的分化成熟与 增殖,但浓度过大那么会损伤细胞的脂质、蛋白质和核酸,导致细胞凋亡27.此项研究采用不同浓度H2O2处理牙髓干细胞,观察细胞形态、小半乳糖甘酶活性、细胞增殖活性、细胞骨架变化及其作用机制,为优化牙髓干细 胞移植治疗疾病提供理论依据和实验根底.既往研究显 示H2O2可以诱导间充质干细胞衰老14' 28.最新的研究发现100, 200 m mol/L H2O2可以促进骨髓间充质干细 胞发生衰老,400 m mol

32、/L H2O2刺激导致其死亡,所以 实验选择100, 200 11 mol/L H2O2刺激牙髓干细胞11. 细胞衰老包括两种类型：一种是细胞在体外培养过程中会逐渐到达一个增生的极限,此时细胞会停止分裂增 殖,进入衰老状态,即复制性衰老；二是外界局部因素 对细胞的刺激逐渐积累而导致细胞丧失了自我增殖分 化或修复的功能,通常被称为早熟性衰老,主要受环境 的影响29 o课题组利用 H2O2短刺激牙髓干细胞使其在 氧化应激作用下诱导产生早熟性衰老.衰老的细胞表现为细胞变扁平、细胞体积增大、B-半乳糖甘酶高表达、细胞周期停滞和细胞骨架紊乱30,同时也会激活 p16、p53等衰老信号通路的活化,进而启动

33、衰老反响.实验 结果显示,与对照组相比,H2O2作用2 h后牙髓干细胞 体积增大,变扁平,失去纺锤体样形态.卜半乳糖甘酶活性能反映细胞溶酶体的功能状态,被公认为是细胞衰 老程度的重要标志之一.实验结果说明,与对照组相比,100, 200 m mol/L H2O2刺激后0-半乳糖甘酶阳性细胞 数显著增加,牙髓干细胞呈现衰老征象.利用 BrdU试 剂盒和细胞计数法检测 H 2O 2刺激对牙髓干细胞增殖的 影响,结果显示,随着 H2O2刺激浓度增加,牙髓干细 胞数降低.活性氧的产生可以促进DNA损伤31-34 o在老龄鼠的几乎所有器官都出现DNA损伤,通过p16信号通路促进细胞衰老35.p16基因是

34、衰老诱导基因,可以直接 引起细胞衰老,p-Rb磷酸化,cyclinDI与cyclin依赖 激酶4和cyclin依赖酶6结合成复合体来限制细胞周 期Gi期进入S期进程,而此过程可以被cyclin依赖激酶抑制剂调节,如 p16蛋白36.结果显示,随着H2O2浓度增加,p16表达水平呈浓度依赖性增高.sirt1作为组蛋白去乙酰酶,不仅调节着组蛋白去乙酰化,还调节 着一些和细胞周期密切相关的基因,进而影响细胞的寿 命.作为可能潜在的衰老抑制基因,它可能与其他衰老 和细胞周期调控基因一样,在某种程度上通过调节多个 基因,在细胞水平上调节哺乳类动物细胞生命的进程37.既往研究报道sirt1基因的过表达和白

35、藜芦醇的激活可以 在WI38细胞和2BS细胞中显著降低 p16基因的活性, 提升Rb的磷酸化,进而增加2BS细胞传代寿命,增加 了 Gi期细胞的比例,细胞生长加快,延缓了衰老38.研究发现sirt1/ERK/S6K1可能是衰老的原因之一,而且磷酸化的 ERK/S6K1 可以通过提升细胞分化抑制蛋 白或DNA结合抑制蛋白的表达,降低 p16的基因活性 进而抑制衰老38.实验结果亦发现 H2O2刺激组牙髓干 细胞sirt1表达水平呈浓度依赖性降低.作者奉献：实验设计为唐恩溢,实验实施为徐克,实 验评估为冯兴梅,资料收集为郑科.利益冲突：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利 益冲突.伦理问题：选择正

36、畸减数拔除的健康牙齿标本,告知 患者拔除的牙齿将用于提取牙髓干细胞,得到所有患者知 情同意,并签署?南通大学附属医院知情同意书?.文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测 系统进行3次查重.文章外审：本刊实行双盲外审制度,文章经国内小同 行外审专家审核,符合本刊发稿宗旨.作者声明：文章第二作者对研究和撰写的论文中出现 的不端行为承当责任.论文中涉及的原始图片、数据 包括 计算机数据库记录及样本已根据有关规定保存、分享和销 毁,可接受核查.文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议.4参考文献References1 Gronthos S, Mankani M, Brah

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