丙型肝炎病毒实验室检测技术（63页）讲座

1、2009-2013发生丙肝发生丙肝“聚集性疫情聚集性疫情 ”8 起起发生年份发生年份2009年年1起，起，2011年年3起，起，2012年年3起，起，2013年年1起起疫情发现疫情发现当地舆情当地舆情5起，信息通报起，信息通报3起起筛查情况筛查情况筛查百余人至数千人，筛查人群的筛查百余人至数千人，筛查人群的HCV抗体阳性率抗体阳性率3-82%7起共报告抗体阳性或确诊起共报告抗体阳性或确诊 1528例例疑似原因疑似原因安钠加注射安钠加注射1起，既往有偿供血起，既往有偿供血2起，医源性感染起，医源性感染3起，无明确起，无明确途径途径2起起感染时间感染时间既往感染长期累积既往感染长期累积7起，新近集

2、中感染起，新近集中感染1起起结论结论与卫生机构诊疗行为有关联与卫生机构诊疗行为有关联3起，与既往有偿供血有关联起，与既往有偿供血有关联2起，起，与既往安钠加注射有关联与既往安钠加注射有关联1起，不能明确感染途径起，不能明确感染途径2起起舆情反映舆情反映初期均有舆情推动，初期均有舆情推动，4起因很快查清未扩大，其余均影响较大起因很快查清未扩大，其余均影响较大问题：问题：丙肝聚集性疫情丙肝聚集性疫情（事件）还会（事件）还会继续发生吗？继续发生吗？ 回答：回答：是的！是的！原因：原因： 大量大量HCVHCV感染者感染者“隐匿隐匿”存在存在 （既往感染者可以（既往感染者可以“集中发现集中发现”） 促使

3、促使HCVHCV传播的危险因素存在传播的危险因素存在 （新近感染者可以（新近感染者可以“集中爆发集中爆发”）估计HCV感染者: 500万1000万2013年CDC报告发病数: 158,7581.6%3.2%丙型肝炎病毒实验室检测技术丙型肝炎病毒实验室检测技术河南省疾病预防控制中心河南省疾病预防控制中心艾滋病性病研究所艾滋病性病研究所薛秀娟薛秀娟内内 容容一一、HCV概述；概述；二、实验室检测技术规范；二、实验室检测技术规范；三、检测方法及试剂选择。三、检测方法及试剂选择。一（一）一（一）、丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒单股线性正链单股线性正链RNA病毒病毒于于19891989年被正式命名，在此之前年

4、被正式命名，在此之前被称为肠道外传播的非甲非乙型肝炎病毒。被称为肠道外传播的非甲非乙型肝炎病毒。19911991年被归为黄病年被归为黄病毒科（毒科（FlaviviridaeFlaviviridae）。虽然丙型肝炎作为疾病早已被发现，但）。虽然丙型肝炎作为疾病早已被发现，但因该病毒不能在体外培养且血中的含量很低，故对因该病毒不能在体外培养且血中的含量很低，故对HCVHCV的认的认识主要来自黑猩猩实验和分子生物学的研究结果。识主要来自黑猩猩实验和分子生物学的研究结果。HCVHCV可分可分为为6 6个主要基因型及不同亚型，个主要基因型及不同亚型，目前尚无有效的疫苗。目前尚无有效的疫苗。（一）丙型肝炎

5、病毒（一）丙型肝炎病毒（HCVHCV）2021/8/12119、 人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定。2021-12-312021-12-31Friday, December 31, 202110、低头要有勇气，抬头要有低气。2021-12-312021-12-312021-12-3112/31/2021 6:55:13 AM11、人总是珍惜为得到。2021-12-312021-12-312021-12-31Dec-2131-Dec-2112、人乱于心，不宽余请。2021-12-312021-12-312021-12-31Friday, December 31, 202113、生气是拿别人做错

6、的事来惩罚自己。2021-12-312021-12-312021-12-312021-12-3112/31/202114、抱最大的希望，作最大的努力。2021年12月31日星期五2021-12-312021-12-312021-12-3115、一个人炫耀什么，说明他内心缺少什么。2021年12月2021-12-312021-12-312021-12-3112/31/202116、业余生活要有意义，不要越轨。2021-12-312021-12-31December 31, 202117、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。2021-12-312021-12-312021-12-312021-1

7、2-312021/8/1212烦恼有何惧怕，既然躲不掉，就调好心态与它共存。心向阳光，何惧风霜。茫茫人海你我相遇就是缘分，欢迎下载！（二）国际上公认的（二）国际上公认的HCVHCV传播途径传播途径 n 血液传播血液传播n 经破损的皮肤和黏膜传播经破损的皮肤和黏膜传播n 母婴传播母婴传播n 性接触传播性接触传播（三）病毒的繁殖与复制（三）病毒的繁殖与复制 HCV有严格的宿主限制性，只感染人和黑猩猩。 由于相对低的复制水平HCV在细胞培养时病毒产量很低。 HCV主要复制部位在肝脏： 吸附进入脱壳内质网合成前体多肽（ NS5B复制酶） 负链RNA病毒基因组 合成前体多肽 装配新病毒颗粒（四）病毒的致

8、病机理（四）病毒的致病机理 按病程划分为急性和慢性肝炎。 急性丙肝病程一般是7-8周，但变化范围可为2-26周，潜伏期短，临床过程无显著特征。 急性丙肝的转归：10%30%为自限型；10%-20%ALT正常，血清HCV RNA 持续阳性，抗HCV水平较高并持续较长时间；40%-60%发展为慢性肝炎。 慢性HCV感染有两种生化模式：1、HCV持续或间歇的病毒血症，ALT水平正常；2、伴有ALT 升高的慢性丙型肝炎。20 位患者位患者20% 痊愈痊愈100 位位 HCV 急性感染急性感染80 位患者位患者80% 持续感染持续感染24 位患者位患者30% 稳定，慢性，稳定，慢性，无进展无进展28 位

9、患者位患者28 位患者位患者 56 位患者接受位患者接受抗病毒治疗抗病毒治疗持久性应答持久性应答 (50%)肝脏疾病终末期，肝肝脏疾病终末期，肝细胞癌，肝脏移植，细胞癌，肝脏移植，死亡死亡治疗失败治疗失败 (50%)30% 呈严重进展呈严重进展40% 有不同有不同程度的进展程度的进展32 位患者位患者24 位患者位患者（五）（五）HCV HCV 感染的预后感染的预后诊断、监测诊断、监测方法方法HCV血清学试验血清学试验EIA检测抗检测抗HCV、Immunoblot assayHCV-RNA定性试验定性试验PCR、TMAHCV-RNA定量试验定量试验PCR、bDNAALT肝纤维化非损伤试验肝纤维

10、化非损伤试验肝肝活检活检基因分型基因分型诊断丙肝感染者和现患病人的最佳实验室方法National Institute of Health Consensus Development Conference Statement:Management of Hepatitis C:2002-June 10-12,2002二二、实验室检测技术实验室检测技术 检测方法检测方法: 抗体检测 抗原检测 核酸检测 基因型检测 病毒细胞培养 耐药检测 生化检测方法HCVHCV病毒的基因结构及免疫诊断资源病毒的基因结构及免疫诊断资源 各种基因产物作为免疫诊断的特异性：各种基因产物作为免疫诊断的特异性： NSNS3

11、 3 core core NS NS4 4 NS NS5 5 HCVHCV免疫诊断抗原的策略免疫诊断抗原的策略 NS3+core NS3+core+NS4 NS3+core+NS4+NS5（一）抗（一）抗-HCV检测检测抗-HCV检测分为筛查试验和补充试验（免疫印迹试验）筛查试验和补充试验（免疫印迹试验）筛查试验：酶联免疫吸附试验、胶体金法快速试验、化酶联免疫吸附试验、胶体金法快速试验、化学发光试验、免疫荧光试验学发光试验、免疫荧光试验 （1）HCV感染疫情报告的检测流程感染疫情报告的检测流程 （2）临床诊断筛查检测流程）临床诊断筛查检测流程临床诊断补充试验检测方法临床诊断补充试验检测方法-1

12、流程流程 附：免疫印迹试验附：免疫印迹试验HCV Blot 3.03+质控带 (血清加样）核抗原带NS3-1NS3-2NS4NS51+质控带(试剂加样)GST质控带HCV蛋白确证试剂包含HCV蛋白血清质控带血清转换期样本注：1，2，3为阳性样本4为阴性样本HCV BLOT 3.0HCV BLOT 3.0结果分析结果分析膜条呈现膜条呈现结果分析结果分析所有条带出现所有条带出现1+反应度，或核抗原带反应度，或核抗原带呈呈2+反应度反应度 阳性阳性仅一条仅一条HCV条条带呈带呈1+以上反应度，以上反应度，或抗原条带呈或抗原条带呈1+以上，但以上，但2+2+以下反应度以下反应度不确定不确定* * 仅有

13、仅有GSTGST带反应可判为阴性带反应可判为阴性 GST GST 质控带反应度为质控带反应度为1+1+或以上，加上或以上，加上1 1条或更多条或更多HCVHCV条带呈条带呈1+1+反反应度可读成不确定。应度可读成不确定。3+质控带(血清加样)核抗原带NS3-1NS3-2NS4NS51+质控带(试剂加样) 临床诊断补充试验检测方法临床诊断补充试验检测方法-2流程流程 附：特定的阈值附：特定的阈值 部分检测方法/试剂给出了特定阈值（与抗体补充试验比较，其阳性的预测值95）时使用。 高S/CO比值：当S/CO比值特定的阈值时；低S/CO比值：其S/CO比值特定的阈值。 初筛和复检均为阳性，且有样品O

14、D值与临界值（Cutoff）的比值（S/CO）试剂说明书中给出的特定阈值，可报告“抗-HCV阳性”,无需再做免疫印迹试验；否则，还应进一步作免疫印迹试验。免疫印迹试验结果阳性者，报告“抗-HCV阳性”；结果不确定者，报告“抗-HCV不确定”并进行随访。临床诊断补充试验检测方法二流程。附：附：EIA S/COEIA S/CO值与补充试验的相关性值与补充试验的相关性（3）血液筛查检测流程）血液筛查检测流程 （4）检测结果的解释）检测结果的解释便捷记忆：最终报告以补充试验免疫印迹结果为准。便捷记忆：最终报告以补充试验免疫印迹结果为准。TRANSFUSION Volume 40, February 2

15、000（二）抗原检测（二）抗原检测-意义意义 HCV血清血清阳转前阳转前的早期急性丙型肝炎辅助诊断，的早期急性丙型肝炎辅助诊断，尤其有助于尤其有助于HCV感染窗口期患者感染窗口期患者、抗抗-HCV检测结检测结果不确定患者果不确定患者或或HCV阳性母亲所生婴儿阳性母亲所生婴儿是否罹患是否罹患丙型肝炎的辅助诊断；丙型肝炎的辅助诊断； 免疫受损免疫受损或先天性免疫缺陷群体如或先天性免疫缺陷群体如HIV感染者、长感染者、长期透析的肾病患者、器官移植患者或先天性免疫期透析的肾病患者、器官移植患者或先天性免疫功能缺陷患者等功能缺陷患者等HCV感染的筛查；感染的筛查； 抗抗-HCV阳性阳性感染者的感染者的病

16、毒血症病毒血症分析；分析； HCV感染者感染者治疗前后病毒血症治疗前后病毒血症追踪分析。追踪分析。 初次检测抗原阴性样品，报告为初次检测抗原阴性样品，报告为“HCV抗原抗原阴性阴性”； 初次检测抗原阳性反应样品，需要双孔复初次检测抗原阳性反应样品，需要双孔复检。检。 如果双孔复检结果均为阴性，报告为如果双孔复检结果均为阴性，报告为“HCV 抗原阴性抗原阴性”； 如果双孔检测结果至少有一孔结果为阳性如果双孔检测结果至少有一孔结果为阳性反应，则报告为反应，则报告为“HCV抗原阳性抗原阳性”。结果判断结果判断注意事项注意事项 由于目前抗原检测试剂的由于目前抗原检测试剂的灵敏度较低，灵敏度较低，最最灵

17、敏的检测试剂只能达到相当于灵敏的检测试剂只能达到相当于500 IU/ml水平的水平的HCV RNA，因此阴性的结果并不能排，因此阴性的结果并不能排除除HCV现症感染的可能。现症感染的可能。 HCV抗原阳性仅作为抗原阳性仅作为HCV感染的辅助诊断依感染的辅助诊断依据，不能据此确诊。特别是对处于据，不能据此确诊。特别是对处于“灰区灰区”的阳性结果，需要结合临床表现及的阳性结果，需要结合临床表现及HCV RNA、抗抗-HCV等检测结果来解释。等检测结果来解释。 监测病程进展或抗病毒治疗效果监测病程进展或抗病毒治疗效果应进行应进行HCV抗原的定量检测。抗原的定量检测。（三）病毒核酸检测（三）病毒核酸检

18、测 丙型肝炎病毒核酸检测主要包括丙型肝炎病毒核酸检测主要包括HCV RNA定定性、定量检测。性、定量检测。 逆转录PC技术（ RT-PCR ） 实时荧光定量PCR技术 分支DNA技术（bDNA） 转录介导的扩增技术（TMA） 最低检测线：进口试剂： 15 IU/ml 国产 试剂(匹基等)：500 IU/ml 东北制药东北制药 ： 25 IU/ml （1）HCV核酸定性检测用于血液筛查流程核酸定性检测用于血液筛查流程 （2）HCV核酸定性检测用于临床诊断流程核酸定性检测用于临床诊断流程 抗抗-HCV（3）核酸检测结果的解释）核酸检测结果的解释便捷理解记忆：便捷理解记忆：抗体检测结果以补充实验中的

19、免疫印迹为准，核酸检测结果以抗体检测结果以补充实验中的免疫印迹为准，核酸检测结果以NAT结果为准。结果为准。（四）丙型肝炎病毒基因型检测（四）丙型肝炎病毒基因型检测 提取核酸，基因测序，基因分型提取核酸，基因测序，基因分型 HCV主要分为主要分为16个型，每个型有若干亚型，个型，每个型有若干亚型，以以a，b，c等表示。等表示。 HCV被分为被分为6个型和个型和70多个亚型。多个亚型。 在我国，最主要的基因型为在我国，最主要的基因型为1b（66%），其），其次为次为2a（14%），还有其他较少见的型别，），还有其他较少见的型别，如西南地区的如西南地区的3型和广东等地区的型和广东等地区的6型等。型

20、等。1a 4份份1b 4 份份2a 4份份3a 4份份3b 4份份6a 4份份6n 4份份NAT(+) NS5B区扩增阴性区扩增阴性 4份份Roche MagNA Pure LC提取核酸提取核酸选取已知基因亚型选取已知基因亚型样本样本自行设计引物自行设计引物HCV database推荐推荐丙肝检测技术规范丙肝检测技术规范推荐推荐巢式巢式RT-PCR凝胶电泳，阳性送公司凝胶电泳，阳性送公司测序，比较分型一致性测序，比较分型一致性（中国区（中国区HCV流行主要基因亚型流行主要基因亚型) 根据中国根据中国HCV流行基因亚型设计流行基因亚型设计NS5B区段引物序列区段引物序列引物名称引物名称序列（序列

21、（5-3）基因组中的位置基因组中的位置NS5B-NZCGT ATG AYA CCM GVT GYT TTG A82578275NS5B-NFCCT RGT CAT AGC HTC CGT GAA86168633NS5BWZCCA ATH SMC ACT ACC ATC ATG GC80018020NS5BWFTGG AGT GTG NCK RGC HGT YTC C87928810注：注：NZ:内侧正向引物内侧正向引物; NF:内侧反向引物，内侧反向引物，WZ:外侧正向引物外侧正向引物; WF:外侧反向引物。外侧反向引物。丙型肝炎病毒基因型检测丙型肝炎病毒基因型检测（五）丙型肝炎（五）丙型肝炎

22、 病毒细胞培养病毒细胞培养 2005年日本科学家年日本科学家Takaji建立了丙型肝炎病建立了丙型肝炎病毒细胞感染模型。毒细胞感染模型。 没有广泛开展没有广泛开展 （六）耐药检测（六）耐药检测 丙肝病毒耐药性检测即检测培养的病毒对丙肝病毒耐药性检测即检测培养的病毒对干扰素或利巴韦林的对抗性。干扰素或利巴韦林的对抗性。 丙肝病毒变异性检测，即通过基因测序的丙肝病毒变异性检测，即通过基因测序的方法，检测丙型肝炎病毒全部基因组序列方法，检测丙型肝炎病毒全部基因组序列，比较其核苷酸和氨基酸序列存在的差异，比较其核苷酸和氨基酸序列存在的差异。丙肝病毒具有显著的异源性和高度可变性，编码囊膜蛋白丙肝病毒具有

23、显著的异源性和高度可变性，编码囊膜蛋白E2/NS1可变可变性最高称为高可变区。性最高称为高可变区。（七）血清生化学检测（七）血清生化学检测 丙氨酸转氨酶（丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平变化可反映肝细胞损害程度，但水平变化可反映肝细胞损害程度，但ALT、AST水平与水平与HCV感染引起的肝组织炎症分度和病情感染引起的肝组织炎症分度和病情的严重程度不一定平行；的严重程度不一定平行； 急性丙型肝炎患者的急性丙型肝炎患者的ALT和和AST水平一般较低，但水平一般较低，但也有较高者。也有较高者。 急性丙型肝炎患者的急性丙型肝炎患者的血清白蛋白、凝血酶原活动血

24、清白蛋白、凝血酶原活动度和胆碱酯酶活性度和胆碱酯酶活性降低较少，但在病程较长的慢降低较少，但在病程较长的慢性肝炎、肝硬化或重型肝炎时可明显降低，其降性肝炎、肝硬化或重型肝炎时可明显降低，其降低程度与疾病的严重程度成正比。低程度与疾病的严重程度成正比。血清生化学检测血清生化学检测 慢性丙型肝炎患者中，约慢性丙型肝炎患者中，约30ALT水平正常，约水平正常，约40ALT水平低于水平低于2倍正常值上限。虽然大多数此类倍正常值上限。虽然大多数此类患者只有轻度肝损伤，但有部分患者可发展为肝患者只有轻度肝损伤，但有部分患者可发展为肝硬化。硬化。ALT水平下降是抗病毒治疗中出现应答的重水平下降是抗病毒治疗中

25、出现应答的重要指标之一。要指标之一。 凝血酶原时间凝血酶原时间可作为慢性丙型肝炎患者病情进展可作为慢性丙型肝炎患者病情进展的监测指标，但迄今尚无一个或一组血清学标志的监测指标，但迄今尚无一个或一组血清学标志可对肝纤维化进行准确分期可对肝纤维化进行准确分期。三三、不同检测方法和试剂不同检测方法和试剂方法生产厂商酶联免疫法(ELIsA) 27（国外3家）家化学发光方法美国强生公司、德国罗氏诊断公司、美国雅培公司；国内已注册的生产厂家有苏州新波公司、科美东雅公司等4家。蛋白芯片技术深圳益生堂胶体金技术国产的7家；进口注册只有韩国一家。重组免疫印迹法（RIBA）凯荣、MP、厦大与万泰合作的。HCVHC

26、V抗体检测抗体检测免疫学指标免疫学指标HCVHCV抗原检测试剂抗原检测试剂试剂名称生产厂商丙型肝炎病毒抗原测定试剂盒（化学发光微粒子免疫检测法）雅培Murex Ag/Ab combination assay(Abbott）雅培*Monolisa HCVBio-Rad（伯乐）丙型肝炎病毒核心抗原诊断试剂盒（酶联免疫法）山东莱博生物丙型肝炎病毒抗原检测试剂盒（酶联免疫法）中国医学科学院医学生物学研究所*尚未在中国上市国内试剂和进口的相比，除了浩源（有罗氏背景）的与之接近。试剂名称生产厂商最低检测限（IU/ml）备注Cobas AmpliScreen HCV 2.0Roche(罗氏)25COBAS

27、Taqscreen MPXRoche(罗氏)10.7* COBAS Taqscreen MPX 2.0Roche(罗氏)10.7与一代相比，二代能够直接鉴别出HBV、HCV或HIV阳性Procleix ULTRIO AssayChiron(诺华）5血源筛查HBVHCVHIV一1病毒核酸检测试剂盒(PCR一荧光探针法)达安100HBV/HCV/HIV-1 Blood Screening Real Time PCR Kit凯杰91.6Nucleic Acid Test Kit for HBV、HCV、HIV(Real-time PCR)科华100人类免疫缺陷病毒（HIV-1）、丙型肝炎病毒、乙型肝

28、炎病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光法）浩源23.3HCV HCV 核酸定性检测核酸定性检测（血筛）试剂（血筛）试剂*尚未在中国上市试剂名称生产厂商最低检测限（IU/ml）线性范围（IU/ml）COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV TestRoche(罗氏)154.3E+01-6.9E+07*COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Test 2.0Roche(罗氏)国内未见此资料*Amplicor HCV Monitor 2.0Roche(罗氏)内未见此资料5.0E+02 5.0E+05*COBAS TaqMan HCV with HPSRo

29、che(罗氏)152.8E+01 1.4E+09*Abbott RealTime HCV with m2000雅培121.2E+01 1.0E+08*Versant HCV RNA 3.0西门子国内未见此资料6.15E+02 7.7E+06丙型肝炎病毒（HCV）核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）凯杰5001.0E+03 5.0E+07丙型肝炎病毒核酸扩增荧光（PCR）定量检测试剂盒科华5001.0E+03 1.0E+07丙型肝炎病毒RNA定量荧光PCR检测试剂盒艾康生物5001.0E+03 8.0E+08丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒RNA定量检测试剂盒定量检测试剂盒-磁珠法磁珠法东北制药东北

30、制药251.0E+02 1.0E+08HCV HCV 核酸核酸定量检测试剂定量检测试剂试剂名称生产厂商区分亚型丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒（PCR-反向点杂交法）达安1b2a3a3b6aHCV基因分型测定试剂盒（荧光PCR法）上海之江生物 仅能区分I型和非I型*Versant HCV Genotype Assay (LiPA) 2.0西门子6个型均能区分*Trugene HCV genotyping assay西门子6个型均能区分*Abbott RealTime HCV genetyping 雅培仅能区分1a和1bHCV HCV 分型检测试剂分型检测试剂中国公共卫生杂志（河南数据）中国公共卫

31、生杂志（河南数据）河南省河南省175岁人群的岁人群的HCV抗体、抗体、HCV RNA调整流行率分别为调整流行率分别为0.64%、0.35%。孙国清孙国清HCV抗体筛查S/CO值在13.8和3.810的两组样本WB补充试验结果有显著性差异（2=11.231，p=0.001）；结论结论1-抗体检测：抗体检测：高高S/CO值结果的样本值结果的样本WB补充试验阳性率高于低补充试验阳性率高于低S/CO值者。值者。 S/CO值分别为110和1018.3两组的HCV RNA核酸阳性率有显著性差异（2=11.231，P0.001）。结论结论2核酸结合抗体检测：核酸结合抗体检测：高高S/CO值结果的样本核酸检测阳性率高于低值结果的样本核酸检测阳性率高于低S/CO值者。值者。National Institute of Health Consensus Development Conference Statement:Management of Hepatitis C:2002-June 10-12,2002美国：美国：在在20152015年以前，临床诊断年以前，临床诊断HCVHCV的成人病例数增加的成人病例数增加4 4倍倍中国：中国：挑战？！挑战？！高慢性化率高慢性化率高感染率、低诊断率高感染