动植物油脂中胆固醇含量的测定凝胶渗透色谱净化液相色谱串联质谱法编制说明

1、动植物油脂中胆固醇含量的测定 液相色谱 -质谱/ 质谱法国家标准制订编制说明一、 工作简况胆固醇学名：5-胆烯-3-伊醇。在类固醇核的 C-3上连接一羟基，而在 C-17位上接有一条八碳或更多碳 原子的脂族侧链。 是由乙酰辅酶 A 通过异戊二烯单位的缩合反应而合成， 可作为胆酸和类固醇激素的前体。 动物组织中含有大量胆固醇，又以肾上腺、神经组织与胆汁中富集浓度最高。血浆中胆固醇水平过高，是 引起动脉粥样硬化的危险因子。油脂是人们日常生活中必须的食品，胆固醇在植物油脂中含量较低，在动物油脂中则大量存在，控制 动植物油脂的摄入量，可有效的控制油脂中胆固醇的摄入量，避免过量摄入胆固醇对人体可能造成的

2、损害。 现代研究已发现，动脉粥样硬化、静脉血栓形成与胆石症与高胆固醇血症有密切的相关性。同时，随着 GB28050-2011 食品安全国家标准 预包装食品营养标签通则实施日期的日益临近，对 于声称低胆固醇或不含胆固醇的的食用油产品必须在标签中标示胆固醇的含量。这使得油脂产品中胆固醇 的检测方法的建立显得尤其迫切与重要。1 、任务来源、起草单位、起草人根据 2014年国标委综合 201467号国家标准委关于下达 2014年第一批国家标准制修订计划的通 知的要求，由国家农副加工食品质量监督检验中心（安徽国家农业标准化与监测中心）负责国家标准动植物油脂中胆固醇含量的测定凝胶渗透色谱净化液相色谱串联质

3、谱法（计划号20140331-T-449）的起草工作。由于本标准在起草过程中相关部分主要参加人员工作变动，以及标准制订过程的合作情况，最终标准 起草工作由国家农副加工食品质量监督检验中心（已整合为安徽省食品药品检验研究院）、合肥燕庄食用 油有限责任公司、合肥海关技术中心、合肥工业大学食品与生物工程学院等4家单位联合共同完成。本标准主要起草人：徐彦辉、程浩、丁磊、卢业举、夏春、姚帮本、李静、蒋俊树、罗水忠、刘健、 陈从贵、郑平、刘燕。注 ：徐彦辉（研究员、博士 /硕导） 、程浩（高级工程师） 、丁磊（工程师、硕士） 、卢业举（教授级 高工、硕导）、夏春（高级工程师）、姚帮本（高级工程师、博士/硕

4、导）、李静（工程师、硕士）、蒋俊树（教授级高工、硕导）、罗水忠（教授、博士/硕导） 、刘健（教授、博士 /博导） 、陈从贵（教授、博士/博导） 、郑平（研究员、硕士 /硕导）、刘燕（董事长）。2、简要起草过程2.1 、 前期工作基础（ 1 ）标准基础国家标准动植物油脂中胆固醇含量的测定 凝胶渗透色谱净化液相色谱串联质谱法的研制是在安徽 省地方标准 DB34/T 1765-2012 动物油脂中胆固醇含量的测定 液相色谱串联质谱法 基础上进行的， 本国 家标准项目的主要参加人员同样为原地方标准制定人员。(2)植物油中是否含有胆固醇动物油脂中含有胆固醇没有争议，但是植物油中有没有胆固醇存在争论，起源

5、于一些品牌植物油在广 告中宣称不含有胆固醇，营养专家认为广告简直就是个笑话，事实上，所有纯正的食用植物油都是不含胆固醇的，也不可能含有。橄榄油、花生油、菜籽油、芝麻油等等都不会含有胆固醇，只有动物油才含胆固 醇。”但是做为分析化学工作者，我们从国内还是国外文献中都有发现植物油中存在胆固醇分析检测报道。关于植物油中含不含有胆固醇，查阅相关文献得出结论：植物油甾醇馏分中含有少量的胆固醇。包括AOAC official method 970.51 及 CODEX STANDARD FOR NAMED VEGETABLE OILS CODEX-STAN 210(Ame nded 2003, 2005)

6、均有涉及；国内很多文献中也有关于植物油中胆固醇含量测定报道。其中： AOAC official method 970.51 明确提出 “Sterol fraction of some vegetable oils contains small amounts of cholesterol. Sterol fracti on of palm oil may contain con siderable amount of cholesterol.法典标准：CODEX STANDARD FOR NAMED VEGETABLE OILS CODEX-STAN 210 ( Ame nded 2003,

7、2005)中 Other quality and composition factors中 Identity characteristics Levels of desmethylsterols in vegetableoils as a percentage of total sterols are given in Table 3.中也显示有胆固醇( cholesterol )。ISitlkHnau ieIICiK-iHHIJri mHgGfjiffeetee-tJ udl*.韵In siflHi. "dmPaJhib Lrri7 闸HM-HHVIiClMJAEflrfieE4l

8、layhJlX 孚Zfl-CkTXJJ4L34JLL- Ik3ND-EL2?%SiJNONO-U.feNl>CZaiELpCHiCEl JI-i畑1A I-Zi 1IH.7-27 =12 A* il注fi/kZA.IiA4-IAJJLt-ll Ji 1.4-1 iS.h.z 1-h.a¥ m*4 Utin-1 A- It.吐hgj44hMdbJt t电II* 1Si 1 kMkO3101>?.33 Ik讣1 H JNCh* 命ijMjOHIM lbKD-5.1KHND-XOND-1 4讣各屯§1心2 2>24MJ 11K.n-3.1MIM 0 c* It

9、-卞-A M fMMwn 1D-5J5d.-i-l,n *5 5Il TTKfl-fri-H0-1.4Oiheirg、IJ-T.JMlND-5-hTMI3-I 5N11-1i 4%I J-Z -.i Tl.出 lMJZn.Ki-A4ijiiIK1JUW| 丄"1H-3|WMdd aJbuHkwmMMfl -nA fldfE，nMiN!ndJranJijwmocdWTWTflrrawMrtiwfifi unrr c<i (rhad-Alc DClHrinwriilfD-lars,h-i rXLMI.Sai E Z-1.4FMd 7Nll-I! 3G l-JJ zAtlM 心 gi

10、MulMJ3JII-I3.1I:NLM?.4CLM-lND-D.HWi 2NJJ-il.3MJ-ULl4-NLU|7£*t«ulUL4.41SEti.FiLtLL JU.lZ&-5-1AUTJ.l-V.bMIUmiURCIvICJkl.U4J-y.li29-4LMS也AUWty,胛 1- T H«( Z-RII AEFF43 mFU.U备.亍|® 曲育“伸IT II*ZU. AII H-d Hh Z M1 7"J心1J>uhLi-7ll-hl1电丰】乐彳L +-S2h也全1 I I盛 *24 口I7.7-T Qhka - 丁 fb

11、v im hhi *n Lii-ii.AK2 2-h 1H主耳i-2tiL H-4Jh* I" 4CWimTiFlri ntr inpb Ifiiri*1 Kjc)II 品 1*1IW.IMJ-*2和”划2j4k>q<MH 14.+ II.9ULT規-SM 1 .I p illND-LJiMI3- 5、J*川国KJO-cIeAki! £ DOTh-因此：植物油中甾醇馏分中含有胆固醇。(3)胆固醇的存在形式油脂中的胆固醇有酯化状态和游离状态，在皂化过程中酯化状态被释放成游离状态，因此前处理过程 中必须要有皂化过程，才能准确测定油脂中胆固醇总量。2.2、主要工作过程

12、(1 )资料检索为了更好的完成标准任务，起草组查阅相关标准文献，在标准项目研制前期直至2016年12月份，国家标准体系中无任何标准用于食用油脂中胆固醇含量的测定，仅有三个标准用于食品中胆固醇含量的测定，分别为：GB/T 5009.128-2003食品中胆固醇的测定、GB/T 9695.24-2008肉与肉制品 胆固醇含量测定、GB/T 22220-2008食品中胆固醇的测定高效液相色谱法，由于食用油中油脂含量过高，这三种方法均不适用于油 脂中胆固醇的含量测定，且三个标准的检出限均很高，根本无法满足食用油脂中低含量胆固醇测定的要求。2016 年 12 月 23 日，国家卫生计生委和国家食品药品监

13、管总局发布了GB 5009.128-2016 食品安全国家标准 食品中胆固醇的测定，只有第一法适用于植物油脂中胆固醇的测定，采用气相色谱法检测，外标 法定量。本标准采用液相色谱 -质谱质谱法检测，串联四极杆质谱是目前定性与定量最为准确、灵敏度最高 的检测仪器；且本标准采用内标法检测，更能准确测定动植物油脂中胆固醇含量。(2)方案与计划 起草组在相关文献资料的基础上，确定了标准制订方案和工作计划。油脂中的胆固醇有酯化状态和游 离状态，在皂化过程中酯化状态被释放成游离状态，因此前处理过程中必须要有皂化过程，才能将测定中 胆固醇总量。在此基础上优化出不同类型的样品前处理条件、高效液相色谱质谱条件、测

14、定方法的线性范 围、方法检出限、回收率等，并进行实验室内方法精密度的验证。(3)实际工作 在大量文献及实验数据的基础上，起草组根据我国粮油检验技术的现状，草拟了标准验证方案和标准的 征求意见稿，并制备了四个样品，组织了多家实验室进行了实验室间比对验证实验。2.3、研制期间成果标准研制期间已发表文章：1 徐彦辉，刘燕，丁磊凝胶渗透色谱-液相色谱串联质谱法测定植物油中胆固醇含量J.粮食与油脂，2017， 30(11)：51-53.2 丁磊，胡艳云，韩芳等固相萃取-液相色谱串联质谱法测定动植物油脂中胆固醇J.理化检验-化学分册，2018, 54(5): 596-600.二、标准编制原则和主要研究技术

15、内容1 、编制原则本标准是根据 GB/T 1.1-2009标准化工作导则第 1部分：标准的结构与编写规则 和GB/T 20001.4-2009 标准编写规则第 4 部分:化学分析方法的规定进行编制的。2、标准研究的主要内容及原理本标准规定了动植物油脂中胆固醇含量测定方法的原理、试剂、仪器和设备、试样制备、操作步骤、 结果表示及精密度等内容,适用于动植物油脂中胆固醇含量的测定。方法原理：样品经无水乙醇 -氢氧化钾溶液皂化,石油醚和无水乙醚混合溶液提取,固相萃取净化后, 用液相色谱串联质谱( LC-MS/MS )进行分析,内标法定量。操作步骤包括动物油及植物油脂样品前处理方法,液相色谱及串联质谱条

16、件及样品测定的内容等。 结果表示确定了计算公式和结果保留位数的要求等。3、主要研制技术内容3.1 、动植物油脂品种的选择根据 GB 10146-2015 食品安全国家标准 食用动物油脂中规定食用动物油脂,仅包括食用猪油、牛 油、羊油、鸡油和鸭油；植物油的种类较多,有菜籽油、花生油、大豆油、玉米油、葵花籽油等。本标准在研制过程中动物油脂选择了猪油、牛油、鸭油；植物油脂选择了菜籽油、花生油、大豆油、玉米油、葵花籽油等作为研究对象。3.2、检测方法的建立3.2.1质谱条件的建立质谱条件的选择主要包括：离子源的选择、母离子的选择、子离子的选择、检测模式的选择等。通过调 节质谱仪各参数使检测离子达到较高

17、的响应强度，以提高检测灵敏度。通过检测模式的选择和质谱参数的 优化，提高检测的特异性。3.2.1.1离子源的选择胆固醇的测定中试验了不同的离子源。在电喷雾化学电离(ESI)源下，胆固醇很难电离，因为胆固醇的基本结构为环戊烷多氢菲，它由三个环己烷和一个环戊烷稠合而成，C17位上还有长链烷烃，这种结构决定了胆固醇分子极性很弱，在ESI源下胆固醇不能产生足够强的离子，而大气压化学电离适合分析弱极性化合物，胆固醇及其氧化产物的离子产率较高，可以获得较高的响应值。由于ESI离子源主要适用于那些在溶液中易于离子化的极性物质，这些物质在ESI源下通过离子蒸发，液相离子化方式电离，即利用电喷雾自身解离或通过在

18、流动相中、溶剂中添加挥发性的酸碱盐等物质，以 产生带电离子，而进行检测。在ESI源下，胆固醇及其氧化产物在液相条件很难电离，向流动相中添加甲酸或乙酸，调节质谱仪的各项参数， 可以检测到胆固醇氧化产物信号，但此信号远不及 APCI源下检测信号。APCI源利用电晕放电离子化，气相离子化。适合于检测中等极性和小分子化合物，是甾体环结构物质 常用的离子源。胆固醇及其氧化产物在 APCI源下响应很好，一般的条件即可产生较高的信号，不用为提高灵敏度而对质谱条件进行细致的选择优化。因此选择APCI源作为检测离子源。3.2.1.2检测模式的选择APCI离子源较容易使待测物带上正电荷，且以M+H+居多。但在AP

19、CI源、正离子模式下，胆固醇 3位上的羟基易脱去成 m/z 369.3的准分子离子峰，此准分子离子峰响应信号很好，见图1的胆固醇的一级谱图和图2的一级谱图的放大图，从放大的图中可以看出，胆固醇的直接M+H+的分子离子峰响应很小，在谱图中基本看不到，三度较大的主要是m/z 369.3的准分子离子峰。对 m/z 369.3进行二级扫描质谱分析，产生的主要碎片离子有m/z161.1，m/z147.1，其裂解方式见图 3。图1:胆固醇的一级谱图图2: 级质谱图的局部放大图选择APCI源的正离子模式进行固醇检测。实验证明，在SIM和MRM检测模式下，检测胆固醇都能避免或减少油脂样品中其它非胆固醇甾醇的干

20、扰，响应信号都很好，且检测特异性高。因此选择在SIM和MRM两种检测模式下分析油样中的胆固醇都是可以的，但是根据CAC和EU第657 /2002 /EEC号决议中有关规定，选择两对离子进行MRM监测可更好的避免假阳性的概率，因此，本实验最终选择了MRM监测模式。147161图3 :胆固醇的MS/MS裂解方式321.3母离子和子离子的选择将胆固醇在APCI源正离子模式下进行 QI分析，扫描范围 m/z 50-400。调节质谱仪参数，其中影响最 大的是Fragmentor电压，该参数的合理设置能使母离子的响应信号升高，且降低碎片离子峰。经过调节，在Fragmentor电压值为20V时，Ql产生的m

21、/z 369.3的准分子离子峰丰度最大，砒分别为399.4和401.4。胆固醇的QI质谱图见图1和2。研究选择m/z 369.3准分子离子分别作为胆固醇的母离子。将胆固醇的母离子分别进行子离子扫描，并改变不同的质谱参数，其中最主要的是碰撞能量（CE）。随着CE的改变，子离子的响应信号进行改变。实验最终选择m/z161.1，m/z147.1作为检测的子离子，则胆固醇的MRM检测离子对分别为 m/z 369.3宀161.1和m/z 369.3宀147.1。胆固醇的二级质谱图见图4。图4:胆固醇的二级质谱图为获得最佳的灵敏度，利用质量浓度为1.0mg/L的胆固醇标准溶液在大气压化学电离模式下进行雾化

22、器温度、压力；气帘气温度、流速；电离电压；电晕电流等参数优化，优化后的质谱参数见表1质谱条件。优化后的离子源参数为：大气压化学电离源（APCI）;扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测模式（MRM ）;雾化气温度 350C；雾化气压力 30psi;气帘气温度 325C ;气帘气流速 6L/min ;电离电 压为4500 v;电晕电流为8 A。碰撞气（CAD ）均为高纯氮气。表1多反应监测模式（MRM ）参数名称母离子（m/z）子离子（m/z）驻留时间（ms）碰撞电压（V）碰撞能量（V）备注胆固醇369.3161.1 探10010020为定量离子对147.110010025氘6-胆固 醇37

23、5.4152.0 探10010025166.5100100203.2.2液相条件的建立液相色谱条件的优化和选择，与目标化合物的灵敏度至关重要，特别是液相色谱串联质谱仪受基质影 响比较大，要选择出合适的液相条件，包括流动相的种类、梯度条件、柱温等。在优化选择过程中发现，3 位上的甲醇作为流动相响应值比乙腈要高，因为甲醇比乙睛具有更小的质子亲和力，更易于帮助胆固醇 羟基易脱去成 m/z 369.3 的准分子离子峰。试验中考察了以甲醇或乙腈作为有机相，0 . 1 %的甲酸水溶液和 5mM 乙酸铵水溶液作为水相， 不同的溶剂组合作为流动相的效果，结果发现：当流动相中含有0 . 1 %的甲酸水溶液时仪器

24、的噪音明显比含有5mM乙酸铵水溶液的流动相要高；甲醇洗脱能力比乙腈强，甲醇（0.1%甲酸）为流动相时 1.3分钟就会出峰，出峰时间偏早，目标物很容易受到基质干扰。本文通过比较保留时间、响应值、背景干扰和洗脱能力选择了 最合适的流动相为 5mM 乙酸铵水溶液和乙腈 +甲醇（体积比， 1： 1）作为流动相，几种流动相下胆固醇峰 形见下图 5。1 、 0.1%FA+ACN2 、 0.1%FA+MEOH2.5x103 、 0.1%FA+MEOH/ACN4 、 5mMNH4AC+MEOH5 、 5mMNH4AC+MEOH/ACN2.0x101.5x101.0x105.0x100.01.52.02.53.

25、03.54.04.55.05.56.06.57.07.5T(min)图5 不同流动相条件下胆固醇出峰情况最终液相色谱条件为：a）色谱柱：Zorbox SB C18 （2.1mmX50mm , 1.8 m）或柱效相当的色谱柱；b）柱温：35 C；c）进样量：10卩；d）流速： 0.3 mL/min ；e）流动相：流动相 A 为 5mM 乙酸铵水溶液， 流动相 B 为乙腈 +甲醇（体积比， 1： 1），梯度 洗脱程序见表 2。表 2 梯度洗脱程序时间 /minA 相 /%B 相 /%0.0050501.0050501.0101008.0001008.01505010.005050323、样品皂化条

26、件的选择油脂中的胆固醇有酯化状态和游离状态，在皂化过程中酯化状态被释放成游离状态。根据文献报道， 动植物油脂中均含有两种状态的胆固醇，所以前处理过程中必须要有皂化过程，才能准确测定胆固醇含量。在选择皂化条件时首先比较了GB/T22220-2008、GB/T9695.24-2008、GB/T5009.128-2003 及 AOACofficial method933.08皂化条件，这几个标准皂化条件都大致相似，选择在无水乙醇条件下，用氢氧化钾溶 液皂化，不同的是氢氧化钾浓度、皂化时间不同及皂化装置不同。皂化装置方面本实验选择了250mL圆底烧瓶装上30cm蛇形磨口冷凝管于沸水浴中回流。本实验选择

27、了葵花籽油和猪油作为研究对象优化氢氧化钾浓度、皂化时间。两种不同油脂氢氧化钾浓度、皂化时间优化数据相似，最终选择皂化时间为60min，氢氧化钾浓度为 60%氢氧化钾(质量比)。*回收率回收率10010C)%率收回500-I 1 I I I 11 1 I I I 11 11 I I 11 11 I 11 I 11 I -5 0 5 1015202530354045505560657075808580)60%率收40回200-020406080100皂化时间ni(n)氢氧化钾浓度图6皂化时间、氢氧化钾浓度优化按照此条件进行皂化，葵花籽油和猪油样品的皂化液均能至澄清透明状态。(a) 0.5g 油样(

28、b)添加无水乙醇和氢氧化钾(c)皂化60min后图7动物油脂皂化前后对比3.2.4、提取条件的优化同样参考了 GB/T22220-2008 、GB/T9695.24-2008 、 GB/T5009.128-2003 及 AOAC official method933.08 提取条件， 按照 GB/T22220-2008 中提取条件： 将皂化液转移至 250mL 分液漏斗中， 用 30mL 去离子水分两 次冲洗锥形瓶，洗液并入分液漏斗，再用 40mL 石油醚 +乙醚（体积比， 1：1）分两次冲洗锥形瓶并入分液 漏斗，轻轻振摇 2min ，静置分层。转移下层水相至另一 250mL 分液漏斗，再用

29、30mL 石油醚 +乙醚（体积 比， 1： 1）提取一次，合并有机相。用去离子水每次100mL 洗涤提取液至中性，初次水洗涤时轻摇，防止乳化，提取液通过装有 10g 无水硫酸钠的玻璃漏斗脱水后转移至浓缩瓶中浓缩至干，加入 5mL 正己烷复溶 待净化，葵花籽油和猪油回收率为76106%。3.2.5、样品净化条件的选择在标准研制过程中比较了凝胶渗透色谱和固相萃取两种净化方式的效果，通过比较回收率选择合适的 净化方式。研究对象选择了含量较低的植物油做为研究对象，净化条件优化时选择了胆固醇本底值为 0.56mg/kg 葵花籽油做为加标回收对象。3.2.5.1 凝胶渗透色谱仪净化效果首先在葵花籽皂化待净

30、化基质中添加胆固醇，分段收集凝胶渗透色谱仪的馏出液，前7min 不收集，分别收集 7-10min、10-13min、13-16min、16-19min、19-21min、21-24min、24-27min、27-30min、30-33min 馏出液氮吹后供液质分析， 结果表明在 16-21min 胆固醇出峰， 最终凝胶渗透色谱仪的收集时间为1 6-21 min 。但是，在葵花籽油中添加 0.5mg/kg 、1.0mg/kg 和 2.0mg/kg 三个不同浓度胆固醇标准溶液进行皂化并过 凝胶渗透色谱净化，最终平均回收率数据为134%、63%和 55%，经多次测试回收率和样品数据的平行性较固相萃取

31、稳定性较差，最终并未选择凝胶渗透色谱做为净化方式。3.2.5.2 固相萃取净化效果凝胶渗透色谱仪净化时回收率和平行性较差，在参考文献的基础上选择了固相萃取净化方式。根据胆固醇弱极性特点，本标准选择了硅胶固相萃取柱净化，硅胶固相萃取柱非常适合用来分离结构 相似的弱极性化合物，主要用于从非极性溶剂如烃类、卤代烃或较弱极性的酯或醚中吸附分析物；然后用 极性更强的溶剂如极性醚、酯、醇、乙腈或水进行洗脱。在非极性溶剂中的分析物萃取过程中，逐步添加 极性改性剂的浓度来渐进提高溶剂的极性，可以得到更加完美的萃取结果和回收率。根据这种思路设计， 再参考相关文献考察了两种不同极性浓度的溶液0.5%乙醚的正己烷溶

32、液和15%乙醚的正己烷溶液，分别做为淋洗液和洗脱液， 优化过程具体为从上样开始收集溶液， 上样液为 5 mL ，淋洗液和洗脱液分别为 20 mL， 每 5 mL 收集一次，研究发现胆固醇在上样和淋洗过程中没有析出，洗脱液前10 mL 被洗脱出来，回收率96%，具体见图。采用硅胶固相萃取柱净化，能满足动植物油脂中胆固醇含量测定。80706050403020100上样r淋洗液1淋洗液2淋洗液3淋洗液4洗脱液1洗脱液2洗脱液3洗脱液4图8固相萃取条件优化图图9试剂空白图3.3、方法验证3.3.1线性范围在优化的测定条件下，配制一系列不同浓度的标准溶液进行测定，以目标物定量离子的峰面积对浓度绘制标准曲

33、线，其线性关系和相关系数见表3。结果表明，在0.25.0卩gmL范围内，胆固醇的质量浓度和定量离子的峰面积呈良好的线性关系。表3线性方程、线性范围线性方程相关系数线性范围/（ umL）备注胆固醇Y = 4316.5926 + 402.4090* X0.99980.25.03.3.2加标回收率及精密度3.3.2.1同一油样中不同添加浓度的回收率及精密度选择了本底值为0.56mg/kg的市售葵花籽油脂样品（品牌代号DL），分别准确平行称取 6份油样样品,添加两种浓度0.5、1和5mg/kg胆固醇标准品，按上述方法进行添加回收率试验，结果如下：表4胆固醇添加回收率及精密度(n=6)试样序号加标浓度(

34、mg/kg)测试结果(含本底)X(mg/100g)回收率X (%)平均回收率(%)相对标准偏差(%)DL-10.51.0088.091.39.35DL-21.0190.0DL-30.9680.0DL-41.0394.0DL-51.0190.0DL-61.09106DL-71.01.5397.089.84.85DL-81.4993.0DL-91.4488.0DL-101.4286.0DL-111.4286.0DL-121.4589.0DL-1354.9398.696.33.54DL-144.5891.6DL-155.05101DL-164.8597.0DL-174.6793.4DL-184.82

35、96.43.322不同油样中添加浓度的回收率及精密度准确称取6组不同油样样品，分别添加胆固醇标准品，按上述方法进行添加回收率试验，结果如下:表5不同胆固醇添加回收率及精密度(n=6)项目调和油葵花仁油花生油大豆油猪油鸭油加标浓度(mg/kg)10.03.03.010500500本底值(mg/kg)9.911.452.736.66760550平均测试结果X(mg/kg)17.513.915.3114.961155.0995.0平均回收率 X (%)768286837989精密度(%)5.126.245.483.212.152.683.3.3方法检出限和定量限本标准方法的检出限和定量限，根据GB/

36、T27417-2017选择通过检测出分析物最低浓度值的方法确定。因为植物油中都含有胆固醇，没有完全空白的样品，因此选择有本底值的葵花籽油做为检出限研究对象， 通过不断降低称样量检测并结合试剂空白的测量信号进行比较，选择S /N = 3时最低的出峰浓度为方法检出限，本方法检出限为 0.10mg/kg，定量限为 0.30 mg/kg。334与传统方法比较的优势及实际样品检测比较了液相色谱仪和液相色谱串联质谱仪两种结果，因为本实验中液质仪器同时有光电二极管列阵检测器(DAD)和质谱检测器，所有数据可以同时测定光谱数据和质谱数据，在同样的色谱分离条件下，液相的结果为：胆固醇在1mg/L浓度时才能出峰，

37、胆固醇在0.25mg/L范围内不成线性，而很多植物油脂中胆固醇含量均在0.5mg/100g以下，所以无法用液相色谱仪无法进行准确定量测定含量较低的植物油脂样品中胆 固醇；而本文采用的液相色谱串联质谱仪在0.25mg/L范围内线性良好，线性相关系数为大于0.995，在0.05和0.1 mg/100g添加水平时，加标回收率在96.0106%之间，相对标准偏差小于 10%，检出限为0.1mg/kg , 完全满足低含量胆固醇油脂的测定，方法的灵敏度和稳定性明显高于文献报道的方法。表6实际动植物油脂中胆固醇含量测定试样序号样品名称平均值(mg/kg)相对标准偏差%1食用调和油9.913.222压榨葵花仁

38、油1.453.623压榨一级花生油2.731.264压榨特香菜籽油23.52.415绿色菜籽油25.03.216一级大豆油6.663.567葵花籽油0.562.418玉米油14.83.569猪油7602.3610鸭油5502.893.3.5参考文献1 丁卓平，王明华，刘振华，等食品中胆固醇含量测定方法的研究与比较J.食品科学，2004,25(1): 130-135.2 周永生，罗士平，孔泳.固相萃取-气相色谱-液质联用检测地沟油中胆固醇J.色谱，2012, 30(2): 207-210.3 郭涛，杜蕾蕾，万辉，何东平.高效液相色谱法测定胆固醇含量鉴别地沟油J.食品科学，2009 , 30(22

39、):286-289.4 何文绚，杜方润，李艳霞，等.快速测定植物油胆固醇含量在地沟油筛查中的应用J.分析化学研究报告，2015, 43(3): 394-398.5 DB34/T 1765-2012 ,动物油脂中胆固醇含量的测定液相色谱串联质谱法.6 陈红，杨梅，朱蓉，等.超高效液相色谱三重四级杆质谱法测定火锅油、潲水油及地沟油中胆固醇含量J.中国食品卫生杂志，2011, 23(5): 429-432.7 许秀丽，任荷玲，李娜，等.氘代同位素内标-气相色谱-质谱法测定胆固醇含量鉴别地沟油的研究J.检验检疫科学，2012, 22(2): 16-23.8 朱蓉，陈红，杨梅，等.UPLC-MS/MS法测定常用植物油料中胆固醇含量J.中国卫生检验杂志，2012 ,22(1): 14-18.9 张丽，汤佳佳，徐国兵，等.高效液相色谱法测定牛奶中的胆固醇J.食品科学，2012, 33(2) : 216-218.10 郭玮，陈方俊，潘柏中.胆固醇检测方法的发展历史及标准化J.检验医学，20