棉花黄萎病菌的分离及培养技术研究

1、 编 号： 审定成绩： 重庆邮电大学毕业设计（论文）设计（论文）题目：棉花黄萎病菌的分离及培养技术研究学 院 名 称 ： 生物信息学院学 生 姓 名 ： 专 业 ： 生 物 技 术班 级 ： 学 号 ： 指 导 教 师 ： 江怀仲答辩组 负责人 ：填表时间： 2015 年 5月重庆邮电大学教务处制重庆邮电大学本科毕业设计（论文） 摘 要棉花黄萎病（Verticillium Wilt of Cotton）是一种土传性的维管束系统病害，严重影响棉花产量和质量，有人称它为“癌症”。病害发生的关键因子，除了品种抗病性较低和适宜的气候条件外，土壤中棉花黄萎病菌的大量积累是棉花黄萎病发生流行的主要原因。据

2、国外报道，棉花黄萎病菌形成的休眠结构微菌核，可以在土壤中常年存活，并成为危害侵染循环中最重要的侵染源。在全球因黄萎病所造成的经济损失平均每年达10亿多美元，筛选利用抗病品种是防治黄萎病最经济有效的途径之一，而品种的筛选与鉴定及相关研究都需要分离和培养黄萎病菌种。本研究通过查阅现有文献和结合现有实验条件，采集四川简阳棉花地里耕作层土壤、棉花根际土壤作为病菌分离材料，然后用最简单有效的逐步稀释法稀释样本，并将稀释液涂布在PDA培养基上。根据生长出来的菌落形态和颜色等特征，挑取单菌落再用平板培养法分离出纯化的棉花黄萎病菌。然后将所得的棉花黄萎病菌用不同液体培养基对照培养，从而选择出一种最利于棉花黄萎

3、病菌生长的培养基，以利于将分离纯化出的棉花黄萎病菌培养成可供应用的黄萎菌液，供相关研应究用。将采集的四份土壤样本，稀释成10-1、10-2、10-3不同浓度，涂布平板和平板培养后得到了4株纯化的真菌，经过鉴定最终得到了1株纯化的棉花黄萎病菌。然后用不同液体培养基对棉花黄萎病菌对照培养，得出淘米水培养基培养的棉花黄萎病菌以微菌核形式为主；察氏液体培养基培养出来的棉花黄萎病菌含有较多菌丝和孢子；马丁氏培养基培养出来的棉花黄萎病菌以含孢子为主。【关键词】棉花黄萎病菌 分离和培养 液体培养基 ABSTRACTVerticillium Wilt of Cotton is one of the main

4、diseases which affecting the yield and quality of the cotton. The key factor of the disease, in addition to less resistant varieties and appropriate climate conditions, the accumulation of a large number of Verticillium dahliae in soil is the main reason which cotton Verticillium wilt is popular. Ac

5、cording to foreign reports, sleeping structure micro-sclerotia which Verticillium dahliae formed can survive in soil all the year round and become the most important infection source of against infection cycle. In the world, the economic loss caused by Verticillium wilt account for one billion U.S.

6、Dollars average every year, one of the most cost-effective ways which control Verticillium wilt is filtering and using resistant varieties, while screening and identification of the species and related research all need to isolate and culture Verticillium species. In this study, according to search

7、the existing literature with the existing experimental conditions, we collected farming soil and rhizosphere soil from cotton of Sichuan Jianyang as bacteria isolated material, and then gradually dilute the sample, and coating the dilution on the PDA medium. Based on the growth characteristics of co

8、lony, such as shape and color, we can pick a single colony and culture it on the medium. In this way, we can isolate and select the purified Verticillium dahliae. And then Verticillium dahliae were cultured with different liquid medium. So that selecting one of the most favorable medium for the grow

9、th of Verticillium dahliae, in order to culture the isolated and purified Verticillium dahliae into yellow wilt bacterium，for research applications.Diluting the four soil samples which collected from Jianyang, into different concentrations of 10-1,10-2,10-3.Plating culture after coating plate, we ge

10、t four sets of purified fungi. After identification, I get a set of purified Verticillium dahliae. Then using different liquid media to culture Verticillium dahliae, finally, from the reproduction of Verticillium dahliae, we can draw a conclusion, after using Taomi Shui medium to culture Verticilliu

11、m dahliae, obtained a lot of micro-sclerotia; using Czapek liquid medium to culture, obtained many mycelium and spores; using Mading Shi medium to culture, obtained many spores.【Key words】Verticillium dahliae Isolation and Culture liquid medium目 录前 言 1第一章 棉花黄萎病菌概述 2第一节 棉花黄萎病菌的形态特征 .2第二节 棉黄黄萎病发病症状 .2

12、第三节 棉花黄萎病菌的传播及防治方法 .4第四节 研究目的及意义.5第二章 棉花黄萎病菌的分离.6 第一节 实验材料 .6 第二节 实验方法 .8第三节 实验结果与分析 .12第三章 棉花黄萎病菌的培养 16 第一节 实验材料 .16 第二节 实验方法 .17 第三节 培养结果 .18 第四节 本章小结 .21结 论 .23 致 谢24参考文献 25附 录 26 一、英文原文26二、英文翻译36- 44 -前 言 我国是棉花产量最高的国家之一，棉花种植最早出现在公元前4-5千年的印度河流域文明中。在棉花传入中国之前，中国只有可供充填枕褥的木棉，没有可以织布的棉花。它既是重要的纤维作物，又是重要

13、的油料作物，也是含有高蛋白的经济作物，还是纺织、精细化工原料的战略物资。现在棉花已经成为我国的重要经济作物之一，它具有产量高、生产成本低的特点，提高棉花的产量除了能给种植者带来丰富的收入，而且能间接提高我国的国民收入。棉花枯、黄萎病是危害棉花生产的两大顽固病害，它们分别在现蕾期和花铃期达到发病高峰期，潮湿或适当的温度也有利于病害的发生。当子叶受害后，出现水渍状小斑，真叶发病时叶片出现斑块。随着植株的生长其病害也不断加重，最终病叶的边缘及斑块变褐色而枯死，病株的茎杆及叶柄等木质部导管也呈现褐色。目前，虽然我国的棉花抗病育种工作已取得了巨大进步，枯萎病也基本得到控制，但是所得到的品种整体上对黄萎病

14、的抗性较差。据调查，一些区县的不少棉田由于该病危害猖獗，一般减产10%30%，发生严重的地块减产可达80%以上，甚至绝收，对棉花产量造成了巨大损失和威胁。由于这种病原菌可以通过种子、土壤、水流和病残体传播，因此传播速度极快；同时，又因病原菌可以在土壤中常年存活，能够在棉花的各个生育期发病，故防治很困难。为了减少全球因棉花黄萎病菌所造成的经济损失，筛选抗黄萎病菌品种是防治黄萎病最经济有效的途径之一，而抗棉花黄萎病品种鉴定、筛选和相关研究需要分离和培养黄萎病菌，本研究内容为国家自然基金项目“陆地棉抗源抗落叶型黄萎病及相关抗病性应答的分子机理研究”的部分内容，为研究陆地棉抗黄萎病基因表达谱，筛选研究

15、差异表达基因，分析研究相关抗病应答的分子机制提供黄萎病菌菌液。第一章 棉花黄萎病菌概述第一节 棉花黄萎病菌的形态特征棉花是我国重要经济作物，而棉花黄萎病是影响我国棉花产量与品质的主要病害之一，是由大丽轮枝菌引起的一种危害性极大的维管束系统病害，它通过病原菌堵塞导管、产生毒素等多种形式危害棉株。由棉花黄萎病菌引起的棉花黄萎病害，近年来在我国南北棉区持续爆发危害，成为发展棉花生产的主要障碍。黄萎病在世界各棉花产区均有分布并且防治极为困难，危害棉花的轮枝菌有五个种，其中对棉花危害最为严重的是大丽轮枝菌和黑白轮枝菌1。张绪振2曾研究来自8个省区的棉花黄萎病菌的23个单孢菌系，经对菌落及休眠结构的观察和

16、不同温度影响研究发现，我国主要棉区黄萎病菌均属大丽轮枝菌。大丽轮枝菌是一种世界性分布，且寄主范围很广的植物病原真菌，已报道可引起 660 种植物的黄萎病3。棉花黄萎病菌的菌丝体白色，分生孢子梗直立，长110130um，呈轮状分枝，每轮有34个分枝，分枝大小为13.721.4×2.39.1(um)，在轮枝顶端或顶枝着生分生孢子，分生孢子无色，呈长卵圆形，单胞无色，大小为2.39.1×1.53.0(um)。孢壁增厚形成了黑褐色的厚垣孢子，许多厚壁细胞结合成近球形的微菌核，大小在3050um之间。棉花黄萎病菌属于真菌中的霉菌。一般的霉菌菌落由菌丝体和孢子组成，其菌落比细菌和放线菌

17、大，有的甚至布满整个培养基表面，菌落较疏松呈绒毛或絮状；因霉菌的基内菌丝在培养基内生长，故其菌落不易被接种针挑起；因霉菌孢子带有各种颜色，使其菌落表面也呈现黄、绿、青、橙、黑等颜色4。而棉花黄萎病菌的菌落也因为其独特的微菌核，使菌落显黑色。第二节 棉花黄萎病发病症状1、发病条件 (1)黄萎病发病的最适温度为2225，高于30时，发病缓慢，35以上时，症状暂时隐蔽。在六月份，棉苗出现4、5片真叶时开始发病，田间出现零星病株；现蕾期进入发病适宜阶段，病情迅速的发展；在七八月份，花龄期达到高峰；(2)棉花的品种不同，对黄萎病的抗性也不同；(3)棉花生育期不同，抗病能力也不同，棉花从营养生长进入生殖生

18、长时，抗病性开始下降，黄萎病的发生率逐渐加重；(4)耕作栽培条件不同，黄萎病发生率也不同。棉田连作时，土壤中病菌数量累积愈多，病害愈重；水愈大，病害传播愈快；同时营养失调也是促成寄主感病的诱因，氮、磷是棉花不可缺少的营养，但偏施或重施氮肥，反而能助长黄萎病的发生5。2、棉花黄萎病不同发病期症状 棉花黄萎病能在棉花整个生长期间侵染危害。一般在播种1个月以后出现黄萎病株，由于受棉花品种抗病性、病原菌致病力及环境条件的影响，黄萎病在棉花生长的不同阶段呈现不同症状类型6。 (1) 幼苗期。一是病叶边缘退绿发软，呈失水状，叶脉间出现不规则淡黄色病斑，病斑逐渐扩大，变褐色干枯，维管束明显变色。二是有些病株

19、在苗期不明显，外观看上去正常，但切开棉花横截面，部分木质部和维管束已变成暗褐色。 (2) 成株期。黄萎病在现蕾期后才逐渐发病，一般在六月下旬，黄萎病病株逐渐增多，到七八月份开花结龄期发病达到最高峰。近年来，其症状呈多样化的趋势，常见症状有：病株由下部叶片开始逐步向上发展，叶脉间产生不规则淡黄色斑块，但叶脉附近仍保持绿色，病叶边缘向上卷曲；有时叶片、叶脉间出现紫红色，失水萎蔫的不规则病斑，病斑逐渐扩大，变成褐色枯斑甚至整个叶片枯焦，脱落成光秆；有时生长在主干上或侧枝上的叶片大量脱落枯焦后，在病株的茎部或落叶的叶腋里，可长出许多赘芽和枝叶；在七八月份，棉花花龄期，在盛夏久旱遇暴雨或大水漫灌时，田间

20、有些病株常发生一些急性型黄萎病症状，先是棉叶呈水烫样，继而突然萎垂，逐渐脱落成光秆；有些黄萎病株黄化但植株不矮缩、结铃少；有些黄萎病株变得矮小，几乎不结铃，甚至死亡。棉花黄萎病发病较晚，一般现蕾期开始发病，花龄期为发病高峰。发病植株的维管束变色较浅，一般不会矮化枯死。植株感病时，多在中下部叶片最先表现症状，并逐渐向上发展，不会形成“顶枯症”。发病初期叶片边缘或主脉之间呈现淡黄色不规则斑块，但叶脉不变黄，随后病斑逐渐扩大，并变成褐色而干枯。第3节 棉花黄萎病菌的传播及防治方法1、传播途径 棉花黄萎病是危害棉株维管束的病害，黄萎病菌传播途径很多，主要有：(1)棉花种子传病。这种现象已经在生产实践中

21、得到证实；(2)病株残体传播。棉田中的病株、病叶、病枝残体直接落到地里或用以沤制堆肥，是造成再循环传播黄萎病的重要途径，有时当年的病株落叶都会对当年的新棉株、健康棉株造成侵染；(3)流水和农业操作也是造成病害蔓延的原因；(4)带菌土壤传播。黄萎病菌在土壤中，能以腐殖质为生或在病株残体中休眠，因而在土壤中能存活长达20-25年之久，连作棉田土壤中因不断积累菌量，发病会更加严重。棉田一旦传入黄萎病菌，若不及时采取措施，将以很快的速度蔓延、危害（特别是遇雨后）7。2、综合治理目前对于棉花黄萎病菌的防治方法很多，主要包括以下方面8： (1)选抗病品种。这是防治黄萎病，提高棉花产量最为经济、有效的措施。

22、 (2)轮作倒茬。在棉田种植3-5年的田块或病株较多的田块，采取轮作方式。可以以多年种植禾本科作物的田块轮换倒茬。 (3)加强棉田管理。清洁棉田，减少土壤菌源，及时清沟排水，降低棉田湿度，使其不利于病菌的滋生和侵染。平衡施肥，氮、磷、钾合理配比使用，切忌过量使用氮肥，重施有机肥，侧重施氮、钾肥，以利棉株健壮生长，增强自身的抗逆能力。如果在整个生长期喷施黄腐酸钾3-4次，可有效减少黄萎病的发病几率。 (4)生物防治。放线菌对大丽轮枝菌有较强的抑制作用。细菌中芽孢杆菌属和假单胞属的某些种，能有效抑制大丽轮枝菌菌丝散发。木霉菌对大丽轮枝菌有较强拮抗作用，可用以改变土壤微生物区系进而减轻发病9。(5)

23、保健栽培。减少辛硫酸、甲胺酸等有机酸农药用药次数及浓度，防止棉株受药害降低自身抗病力。不要偏施、过施氮肥，做好氮磷钾配合试用，注意增施钾肥，提高抗病力。改善棉田生态环境使棉田土温较高，湿度不宜过大，忌大水漫灌，可减少发病。 第四节 研究目的及意义棉花黄萎病是危害棉花维管组织的一种真菌类病害，在全国棉区均有分布，它通过病原菌堵塞导管、产生毒素等形式危害棉株。在棉花生长前期可造成死苗，中后期引起蕾铃脱落，导致棉花产量、品质严重下降。由于这种病的病原菌可以通过种子、土壤、水流和病残体传播，因此传播速度极快；同时，又因棉花黄萎病菌形成的休眠结构微菌核，可以在土壤中长年存活，并成为病害侵染循环中最重要的

24、初侵染源10，故棉花黄萎病的防治很困难。国内外的研究证实，棉花黄萎病的发生及危害损失与土壤中病原菌的初侵染源和繁殖体微菌核有极为密切的关系。棉花黄萎病菌主要以微菌核在土壤中越冬，也能在棉籽内外、病残体、带菌棉籽壳、棉籽饼中越冬而引起侵染，带病种子是远距离传病和使病区迅速扩大的重要途径。因此，明确棉黄萎病菌在土壤中的分布、消长、侵入等基本情况，对抗病育种工作及病害的预测和防治有重要意义。目前，化学防治不仅成本较高，而且效果较差，水旱轮作虽然可有效抑制棉花黄萎病的发生，但受自然条件或耕作制度的影响，这一技术很难得到普遍推广11。多年的实践证明，只有培育和推广抗病品种才是目前在棉花生产上控制棉花黄萎

25、病危害最为经济有效的方法，筛选黄萎病抗原并研究其抗性遗传规律，对抗病育种有着重要意义。而品种的筛选与鉴定及相关研究都需要分离和培养黄萎病菌种，由于黄萎病菌的生长速度很慢，培养数日后才形成典型菌落，因此棉花黄病菌的大量培养还受到一定的限制。本研究为国家自然基金项目“陆地棉抗源抗落叶型黄萎病及相关抗病性应答的分子机理研究”的部分内容，首先从四川棉区（简阳）分离纯化具有中等致病力的黄萎病菌，然后进行液体培养技术的研究，为研究陆地棉抗黄萎病基因表达谱，筛选研究差异表达基因，分析研究相关抗病应答的分子机制提供黄萎病菌菌液。 第二章 棉花黄萎病菌的分离 第一节 实验材料1、 病菌分离材料来源四川简阳棉花地

26、里采集的棉花耕作层土壤、棉花根际土壤2、 主要器材试管、培养皿、锥形瓶、高压蒸汽灭菌锅、显微镜、接种针、酒精灯、移液枪、无菌枪头、涂布棒、恒温箱、电磁炉、铁架台、漏斗、无菌操作台、电子称、棉塞、试管框3、 培养基制备 培养基（Medium）是指由人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合营养料。任何培养基都应具备微生物生长所需要的六大营养要素，一般含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等，有的培养基还含有抗菌素、色素、激素和血清等。 培养基由于配制的原料不同、使用要求不同，因而贮存保管方面也稍有不同。一般培养基在受热、吸潮后，易被细菌污染或分解变质，因此一般培

27、养基必须防潮、避光、阴凉保存。制作培养基时应尽快配制并立即灭菌，否则就会杂菌丛生，并破坏其固有的成分和性质。对一些需严格灭菌的培养基（如组织培养基），较长时间的贮存，必须放在26的冰箱内。由于液体培养基不易长期保管，现在均改制成粉末。此外，为了满足微生物生长繁殖或积累代谢产物的要求，还必须控制培养基的pH。一般细菌、放线菌适于生长在中性或微碱性的环境中，而酵母菌和霉菌则适于生长在偏酸性的环境中。因此，在配制培养基时，须将培养基的pH调节在一定的范围内12。迄今为止，培养基的种类极其繁多、种类各异。根据培养基的化学成分可将培养基分为：天然培养基、组合培养基、半组合培养基；根据培养基的物理状态可将

28、培养基分为：液体培养基、固体培养基、半固体培养基、脱水培养基；根据培养基的作用可将培养基分为：选择性培养基和鉴别性培养基13。PDA培养基的制备：PDA培养基是人们对马铃薯葡萄糖琼脂培养基的简称，即Potato Dextrose Agar （Medium），依次对应马铃薯、葡萄糖、琼脂的英文。PDA是一种常用的培养基，适宜培养酵母菌、霉菌、蘑菇等真菌。按物理性状划分属固体培养基，按培养基成分划分属半合成培养基。1、配方:马铃薯200克,葡萄糖20克,琼脂15克，自来水1000毫升 2、配制步骤(1)将马铃薯洗净，去皮，切成大小约为1cm3的小块，称200g，放入1000mL水中煮20分钟，用双

29、层纱布过滤，取其液滤。（也可直接溶解马铃薯营养提取粉）(2)定容：加水补足至1000mL。(3)加入葡糖糖至全部溶化。(4)加琼脂至全部溶化。(5)趁热将一部分分装在试管中（分装试管方法：分装前先准备好铁架台和相应的带有橡胶管和夹子的漏斗，放在铁架圈上，根据所要分装的试管的长度调整好漏斗的高度 将培养基倒在漏斗中，马上就开始分装，培养基不能超过试管的1/5）。(6)加棉塞：分装完毕后，在试管口或三角瓶口塞上棉花，以阻止外界微生物进入培养基而造成污染，并保证有良好的通气性能。(7)包扎：将试管包扎成捆，在棉塞上方包一层牛皮纸（或报纸），用绳系好，贴上标签，注明培养基的名称及配制日期。(8)灭菌：

30、将上述培养基以0.1Mpa，121，高压蒸汽灭菌20min。(9)摆斜面和倒平板：制斜面培养基时，应趁热将试管有棉塞的一头搁在一根长木条上，斜度要适当，斜面长度不超过试管长度的1/2，凝固后即成为斜面培养基。制平板培养基时，应无菌操作，趁热将培养基倾入灭菌培养皿中，使厚度在3mm左右，盖上皿盖，轻轻地摇动培养皿，使其布满皿底，水平静置，等凝固后翻转培养皿。(10)无菌检查：灭菌后的培养基放入28恒温箱中，若24小时内无菌生长，即可使用。3、注意事项(1)培养基经灭菌后，必须放在温箱中培养24h，无菌生长者方可使用。(2)PDA培养基一般不需要调节pH。对于要调节pH的培养基，一般用pH试纸或p

31、H计测其pH。如果培养基偏酸或偏碱，可用lmol/L的 NaOH或lmol/L的 HCL溶液进行调节。调节时应逐滴加入NaOH或HCl溶液，防止局部过酸或过碱破坏培养基成分。(3)培养基在使用时也可以做成不含琼脂的液体培养基，用于菌类的振荡培养。(4)倒培养基前加入适量的链霉素液摇匀，也可以加入氯霉素或土霉素，加入量为0.1g/L培养基，主要是为了抑制细菌的生长，减少干扰14。四、乳酸石炭酸棉蓝染色液（观察真菌）制备 1、配方：石炭酸50克，乳酸（比重1.21）50毫升，甘油100毫升，蒸馏水50毫升，棉蓝0.1克2、制备步骤将石炭酸加在蒸馏水中加热溶解，然后加入乳酸和甘油，最后加入棉蓝，使其

32、溶解即成，即配成了250ml的乳酸石炭酸棉蓝染色液 (因为石炭酸等药品有强烈的腐蚀作用，所以在配种棉蓝染液时要带上一次性手套,而且实验室里面的石炭酸是固体状态，使用前需要用东西将其粉碎，这样可以加快其溶解速度) 。 第二节 实验方法1、 棉花黄萎病菌的分离(一)黄萎病菌的初步分离1、土样制备。在四川简阳的棉花地里，戴上灭菌手套，采用多点取样法，用取土器对棉花地里的耕作层土壤（取土壤深度20cm内）和根际土壤进行取样，取土后立刻将样本放进灭过菌的信封里面，密封好，并贴上相应标签，以免实验时候出错。同时将采集来的土壤放在无菌操作台中风干，然后在研钵里面分别粉碎。表2.1土壤样本编号编号 采集地点及

33、深度S1 耕作层土壤（样本1）S2 耕作层土壤（样本2）S3 根际土壤（样本1）S4 根际土壤（样本2）2、凡是实验中使用的器材，能灭菌处理的必须灭菌，如玻璃器皿（包括吸管、滴管、三角瓶、试管、培养皿等）、培养基、枪头。金属器材（如剪刀、镊子、针头等），凡能包裹的，应先用纸包裹再灭菌。灭菌完，待蒸汽放完后将灭菌的这些器材放在干燥箱中。3、无菌操作台的清洁：用酒精棉球将操作台内部全部擦洗干净，将试管架、酒精灯、标签、接种针、笔、火柴等实验用具放入操作台内。打开操作台的紫外灯，紫外线灭菌20分钟。灭菌完后，关掉紫外灯同时打开照明灯，保持操作台的送风机一直开着，并且点燃酒精灯（注意事项：每次使用前都

34、要提前20分钟打开紫外灯，并启动送风机；净化区内严禁放不必要的物品以保持洁净的气流不受干扰）。4、平板制备：左手持皿，用左手的拇指、食指及中指将皿盖揭开20度左右的角度（角度越小越好，以免空气中的细菌进入皿中将培养基污染）。右手将溶化后凉至50度左右的培养基加入抗菌素后倒在培养皿中（培养基要适量，过多就浪费，过少会影响涂布和真菌的生长；培养基不要沾在了培养皿边缘，以免造成细菌污染；培养基要倒平，以免涂布的时候弄破培养基，影响结果观察），倒完后盖上皿盖，放在操作台空的地方。5、制备土壤稀释液。称取各样品土壤5g，分别放入45ml无菌水的三角瓶中（瓶中事先放入消毒过的玻璃球，以便土壤混合），振荡1

35、0min，即为稀释10-1的土壤悬液，并作好相应标记。6、在无菌操作台上，取装有9ml无菌水试管2支，用记号笔编上10-2、10-3。取用无菌吸管吸取已稀释成10-1的1号土壤液1ml，注入这编号为10-2的试管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10-2土壤稀释液。同法从10-2中取1ml制备10-3土壤稀释液。7、待培养皿中的培养基凝固后，开始涂布。首先将涂布棒在酒精灯上烧灼，以杀死细菌；然后待涂布棒冷却后，用移液枪吸取1ml的稀释液涂布，如此重复将上面的几个稀释浓度都分别涂布，每一组做两个相同平板，以观察平均结果。8、涂布好所有浓度的土壤稀释液后，在皿盖上贴好相应的标签。然后将

36、培养皿放在恒温箱中倒置培养，培养温度为28。表2.2土壤稀释液编号土壤 10-1 10-2 10-3 耕作层土壤（S1） S111 S112 S121 S122 S131 S132耕作层土壤（S2） S211 S212 S221 S222S231 S232根际土壤（S3） S311 S312 S321 S322 S331 S332根际土壤（S4） S411 S412S421 S422 S431 S4329、收拾干净实验台，如果还有剩下的平板，可以将平板倒置放在保存箱中，但是放置时间最好不要超过两天。 (二) 黄萎病菌的纯化真菌的分离培养的目的是进行真菌的菌种鉴定，帮助诊断。常用的方法有斜面培养

37、法、玻片培养和平板培养法三种。在本次实验中采用平板培养法对棉花黄萎病菌进行分离、纯化，平板法培养霉菌与分离细菌的方法不同，一般采用点植法。将上述长出的比较规整且呈现单个菌落，菌落形态和颜色有差异的S111、S212、S311、S312、S421、S221平板上的菌落分别用接种针挑到加了链霉素的PDA培养基上。在接种前，无菌操作台跟前面一样进行清洁和杀菌处理，接种针在酒精灯上加热烧红，挑取菌落前注意接种针要冷却，不然会烫死真菌。左手拿起平板底，使培养基朝下，右手持接种针挑取菌落边缘的单菌丝，点种在培养基中心点或成三角形的三分点（接种过程中最好不要刺破培养基，同时避免孢子散落在培养基上，使菌落生长

38、一个或三个扇形的典型菌落，便于观察）。然后盖上平皿盖，贴上接种菌丝的来源，始终保持平板底朝上，在恒温箱中倒置培养4-5天。过后再观察培养基中长出的菌落形态是否一样，并根据棉花黄萎病菌的菌落特征从中挑选出纯化的棉花黄萎病菌。二、棉花黄萎病菌的鉴定及形态观察区分和识别各类微生物可从菌落形态（群体形态)和细胞形态（个体形态）两方面进行，菌落形态是无数细胞形态的集中反映，因此，每一大类微生物都有其一定的菌落特征，可通过这些特征差异区分和识别。一般根据长出的菌落颜色、粗糙程度、孢子、菌丝等的特征对棉花黄萎病菌进行生理、生化鉴定。由于棉花黄萎病菌属大丽轮枝菌，其微菌核是大丽轮枝菌在土壤中的主要存活结构，而

39、微菌核也正是鉴定棉花黄萎病菌的一个重要特征。将S312、S421菌落菌丝接种到水琼脂培养皿上培养（用水琼脂培养真菌，有利于单个菌丝的形成），然后从中挑取单个菌丝，再对其菌丝、孢子等在显微镜下面观察，结合SMITH15通过显微镜观察的大丽轮枝菌分生孢子梗较细、数量少、完全透明；分生孢子较小,富含黑色的微菌核；寄主范围广等形态学特点，最终确定棉花黄萎病菌。对于棉花黄萎病菌的形态观察，本次实验采用的直接观察法。制片时常用乳酸石炭酸染液，它一方面可以杀菌防腐，保持细胞不变形，另一方面有染色作用。操作步骤如下：1、在载玻片上滴加一滴乳酸石炭酸棉蓝染液，用解剖针从棉花黄萎病菌菌落边缘挑取少量已产孢子的棉花

40、黄萎病菌菌丝，再放在载玻片上的染液中。用解剖针小心地将菌丝分散开，盖上盖玻片。 2、将载玻片置低倍镜下观察，当寻找到清晰的图像时，换高倍镜对棉花黄萎病菌的菌丝和孢子进行仔细观察。三、棉花黄萎病菌的保藏将前面鉴定出的纯化的棉花黄萎病菌S312，放在无菌操作台上备用。具体的实验操作步骤如下：1、清洁好无菌操作台并点燃酒精灯，用75%的酒精清洁手。2、接种针垂直插入酒精火焰中烧红，再横过火焰3次，然后左手持皿，用左手的拇指、食指及中指将皿盖揭开20度左右的角度，右手把接种针放在皿盖上停留片刻待其冷却。3、将接种针伸进培养皿挑取S312菌落边缘的菌丝（可以带上一些培养基），挑取好就盖好皿盖。4、将保藏

41、菌种的斜面试管，挟于左手的拇指与其他四指之间，用右手的无名指与小指和手掌边拔出棉塞并挟住。5、将带有棉花黄萎病菌菌丝的接种针伸进试管中接种到试管培养基上。6、取出接种针，试管口和棉塞进行火焰灭菌，重新塞上棉塞。7、烧死接种针上的残余菌，把试管和接种工具放到试管框中。8、在斜面管口写明菌种名称、日期，置28恒温培养。9、此种接种到斜面试管的方法是作为对已分离纯化的棉花黄萎病菌的保存，以备下一次使用。但是如果保藏时间过长，使用前还需要对再一次纯化，以防保藏过程中杂菌的污染。第三节 实验结果与分析一、 初分离结果每天都对实验室里的真菌生长情况进行观察，由于真菌的生长速度比较慢，所以在培养上比细菌的培

42、养时间要长。最后观察到培养结果为：稀释度为10-2和10-3的平板长出的真菌菌落很少，只有浓度为10-1平板长出了各种菌落。菌落特点为：外观干燥，不透明，呈现绒毛状或棉絮状，从菌落颜色看有黑色、青色和灰色几种。根据菌落颜色和形态，初步断定分离出了青霉、曲霉和棉花黄萎病菌。表2.3第一次纯化菌株编号编号 菌株来源 稀释度 菌落颜色S111 耕作层土壤（样本1） 10-1 绿色S212 耕作层土壤（样本2） 10-1 黑灰色S221 耕作层土壤（样本2） 10-2 灰色 S311 根际土壤（样本1） 10-1 黑色（而且菌丝很发达）S312根际土壤（样本1） 10-1 黑色S421 根际土壤（样本

43、2） 10-2 黑色二、 纯化结果通过对S111、S212、S311、S312、S421、S221这几个菌落的再一次分离纯化，以及将分离前后长出的菌落形态、颜色进行对比，最终分离出几种纯化的真菌。表2.4第二次纯化菌株编号编号 编号来源 菌株来源 菌落颜色B1 S111 耕作层土壤（样本1） 绿色B2 S221 耕作层土壤（样本2） 灰色B3 S312 根际土壤（样本1） 黑色B4 S421 根际土壤（样本2） 黑色根据棉花黄萎病菌独特的微菌核结构（是菌落呈现黑色），而且具有菌丝孢子等，从第二次纯化的菌株来看，只有B3、B4的菌落颜色、特征等比较像棉花黄萎病菌。图2.1分离的棉花黄萎病菌菌落形

44、态图三、鉴定结果通过在显微镜下对分离纯化的棉花黄萎病菌进行形态学观察，从其明显的微菌核和无色、长卵圆形的分生孢子以及菌丝形态与V991和D07038棉花黄萎病菌形态进行对比，确定出只有S312是棉花黄萎病菌。S312是从根际土壤中分离出来，稀释浓度为10-2。（图2.2图2.4） 图2.2棉花黄萎菌形态（物镜4倍）图2.3棉花黄萎菌形态（物镜10倍）图2.4棉花黄萎菌形态（物镜40倍）四、保藏结果图2.5棉花黄萎菌试管培养(菌种保存) 第三章 棉花黄萎病菌的培养第一节 实验材料一、 实验材料来源实验过程中分离而来的棉花黄萎病菌；来源于中国农科院植物保护研究所的致病力强的V991；来源于中国农科

45、院棉花研究所的中等致病力的D07038。二、 主要器材试管、培养皿、锥形瓶、高压蒸汽灭菌锅、接种针、酒精灯、移液枪、无菌枪头、涂布棒、无菌操作台、电子称、棉塞、试管框、HZP-250型全温振荡培养箱。三、 培养基制备 真菌在静止条件下培养时，会在其周围形成透过养分的障壁，因此养分的摄入会受到很大的阻碍。但是，液体培养基具有进行通气培养、振荡培养的优点。振荡培养可消除这种阻碍以及增加供氧量，所以有利于细胞生长和提高真菌繁殖数。本次研究也正是抓住了液体培养的这个优点，所以对棉花黄萎病菌进行液体培养。（一）马丁氏培养基制备1、配方:葡萄糖10克，蛋白胨5克，磷酸二氢钾1克，硫酸镁0.5克，1%孟加拉

46、红3.3毫升2、制备步骤 (1)在电子称上分别用小烧杯称好葡萄糖、蛋白胨、 磷酸二氢钾、 硫酸镁。再将上述药品加适量无菌水溶化，然后再将上述溶液依次倒在量程为1000ml的量筒中，此培养液1000ml加1%孟加拉红水溶液3.3ml，定容至1000ml。(2)将配好的马丁氏液体培养基分装在量程为250ml的锥形瓶中，但是分装量一般在100ml左右就可以了（避免振荡培养时液体培养基外溅）。(3)灭菌：将上述培养基以0.1Mpa，121，高压蒸汽灭菌20min。（二）察氏培养基制备1、配方：硝酸钠2克，磷酸二氢钾1克，氯化钾1克，硫酸镁1克，七水硫酸铁0.02克，蔗糖30克，水1000毫升2、制备步

47、骤(1)在电子称上分别用小烧杯称好硝酸钠、磷酸二氢钾、 氯化钾、硫酸镁、七水硫酸铁、蔗糖。再将上述药品加适量无菌水溶化，然后再将上述溶液依次倒在量程为1000ml的量筒中，定容至1000ml。(2)将配好的察氏液体培养基分装在量程为250ml的锥形瓶中，分装量一般在100ml左右。(3)灭菌：将上述培养基以0.1Mpa，121，高压蒸汽灭菌20min。 第二节 实验方法 一、棉花黄萎病菌的培养方法1、将灭菌好的马丁氏液体培养基、察氏液体培养基和淘米水放在无菌操作台自然冷却。2、待培养基冷却后，在无菌操作台中分别挑取适量保存在试管中的棉花黄萎病菌（包括分离纯化的棉花黄萎病菌、致病力强的V991、

48、中等致病力的D07038），由于真菌生长速度较慢，因此需要多挑取一些棉花黄萎病菌。3、接种好棉花黄萎病菌后，用无菌膜将锥形瓶包扎好，放在HZP-250型全温振荡培养箱中开始振荡培养，每天连续振荡培养。注意每天观察锥形瓶中棉花黄萎病菌的生长状况，记录好每一种液体培养基中棉花黄萎病菌的生长状况。二、测棉花黄萎病菌生长情况对测定繁殖数来说，一定要一一计算各个体的数目。所以，计繁殖数只适宜于测定处于单细胞状态的细菌和酵母菌，而对放线菌和霉菌等丝状生长的微生物而言，则只能计算其孢子数。1、 直接法指用计数板（例如血球计数板）在光学显微镜下直接观察细胞并进行计数的方法。此法十分常用，但得到的数目是包括死细

49、胞在内的总菌数。为解决这一矛盾，已有用特殊染料做活菌染色后再用光学显微镜计数的方法，例如用美蓝液对酵母菌染色后，其活细胞为无色，而死细胞则为蓝色；细菌经吖啶橙染色后，在紫外光显微镜下可观察到活细胞发出橙色荧光，而死细胞则发出绿色荧光，因而也可作活菌和总菌计数。2、 间接法间接法是一种活菌计数法。这是一种依据活菌在液体培养基中会使其变混或在固体培养基上（内）形成菌落的原理而设计的。最常用的是利用固体培养基上（内）形成菌落的菌落计数法。一般有平板菌落计数法（此法最为常用，但操作较繁琐且要求操作者计数熟练）和厌氧菌的菌落计数法（此法设备较复杂，计数难度很高）。测定各液体培养基中棉花黄萎病菌的生长情况，既可以用直接计数的方法，也可以用间接计数的方法。在本次研究中使用了间接计数的方法，主要操作是：取出摇床上的马丁氏、察氏、淘米水棉花黄萎病菌培养基，分别摇匀；在无菌操作台上分别移取这三种液体培养基1ml到无菌试管中，并加上99ml的无菌水稀释；用带橡皮乳头的1ml灭菌吸管反复吸吹50次，使棉花黄萎病菌的孢子充分散开；将10-2 浓度的棉花黄萎病菌液体分别涂布两个平板；将培养皿在28的恒温箱中倒置培养。表3.1三种液体培养基稀释编号液体培养基 S312 V991 D07038马丁氏培养基 SM01 SM11 VM01 VM11DM01 DM11察氏培养基 SC01 SC