实验荧光显微镜及激光共聚焦显微镜使用ppt课件

1、实验七实验七-1细胞荧光染色察看与荧光显微细胞荧光染色察看与荧光显微镜的运用镜的运用示范：细胞形状察看与暗视示范：细胞形状察看与暗视野显微镜的运用野显微镜的运用实验目的与教学要求实验目的与教学要求n掌握荧光显微镜的成像根本原理及掌握荧光显微镜的成像根本原理及其运用；其运用；n掌握暗视野显微镜的成像根本原理掌握暗视野显微镜的成像根本原理及其运用。及其运用。荧光显微镜是一种较为常用的的光学显微镜，其荧光显微镜是一种较为常用的的光学显微镜，其根本原理是利用一定波长的激发光对样品进展激根本原理是利用一定波长的激发光对样品进展激发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样品发，使之产生一定波长的荧光，从而用

2、于对样品构造或其组分进展定性、定位、定量察看检测。构造或其组分进展定性、定位、定量察看检测。一、荧光显微镜的成像原理一、荧光显微镜的成像原理什么是荧光什么是荧光 ? ?n物质中的电子吸收光的能量由低能形状物质中的电子吸收光的能量由低能形状转变为高能形状，再回到低能形状时释转变为高能形状，再回到低能形状时释放出的光。放出的光。n即：物质吸收短波光，发射出的长波光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。坚持固有的荧光特性坚持固有的荧光特性荧光波长激发波长荧光波长激发波长荧光强度极小于激发光的强度荧光强度极小于激发光的强度有不同程度的衰减有不同程度的衰减荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率荧

3、光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率荧光的性质荧光的性质优点：优点：检出才干高检出才干高对细胞的刺激小对细胞的刺激小能进展多重染色能进展多重染色用途：用途：物体构造的察看物体构造的察看荧光的有无、颜色比较进展物质判别荧光的有无、颜色比较进展物质判别发荧光量的测定对物质定性、定量分析发荧光量的测定对物质定性、定量分析荧光显微镜的优点和用途荧光显微镜的优点和用途荧光素荧光素激发波长激发波长 发射波长发射波长DAPI372372456456AMCA350350450450Hoechst 33258365365465465FITC490490520520Acridine Orange49049

4、0590590Acridine Yellow470470550550CY3552552565565TRITC541541572572Propidium Iodide530530615615对细胞构造或组分的定性、定位、半对细胞构造或组分的定性、定位、半定量研讨。定量研讨。作为生物大分子挑选与鉴定的标志物。作为生物大分子挑选与鉴定的标志物。荧光显微镜技术在生命科学研讨中的运用荧光显微镜技术在生命科学研讨中的运用二、暗视野显微镜的成像原理二、暗视野显微镜的成像原理经过特殊的暗视野聚光器，使照明光线改经过特殊的暗视野聚光器，使照明光线改动途径，不直接进入物镜，而是倾斜地照动途径，不直接进入物镜，而是

5、倾斜地照射到样品上，由样品外表的绕射光线入射射到样品上，由样品外表的绕射光线入射到物镜内，产生样品的衍射图象。到物镜内，产生样品的衍射图象。三、试剂与器材三、试剂与器材青蛙、洋葱、人正常肝组织切片和脂肪肝组织切片青蛙、洋葱、人正常肝组织切片和脂肪肝组织切片HE染色染色甲醇、甲醇、1 丫啶橙、滤纸、吸管、载玻片丫啶橙、滤纸、吸管、载玻片荧光显微镜、暗视野显微镜、普通光学显微镜荧光显微镜、暗视野显微镜、普通光学显微镜四、实验内容和实验步骤四、实验内容和实验步骤蛙血细胞染色察看：取少许蛙血蛙血细胞染色察看：取少许蛙血 常规血涂片常规血涂片 凉干凉干 甲醇固定甲醇固定10 min 1 丫啶橙染色丫啶橙

6、染色5 min 水洗水洗 室室温枯燥滤纸擦干玻片底面温枯燥滤纸擦干玻片底面 荧光显微镜察看先低倍荧光显微镜察看先低倍后高倍察看后高倍察看 可在同一玻片上察看未荧光染色的血细胞可在同一玻片上察看未荧光染色的血细胞取洋葱取洋葱撕取一小片内表皮撕取一小片内表皮平面单层铺展于玻片上平面单层铺展于玻片上室温室温凉干凉干1丫啶橙染色丫啶橙染色5min 水洗用吸管，小心掉片水洗用吸管，小心掉片 室温枯燥或用滤纸擦干室温枯燥或用滤纸擦干 荧光显微镜察看荧光显微镜察看暗视野显微镜察看蛙血细胞示范暗视野显微镜察看蛙血细胞示范察看人正常肝组织切片和脂肪肝组织切片察看人正常肝组织切片和脂肪肝组织切片HE染色染色n 荧

7、光显微镜要在光线尽量暗的环境下察荧光显微镜要在光线尽量暗的环境下察看。看。n 运用荧光显微镜时要留意不要直接察看运用荧光显微镜时要留意不要直接察看激发光源，维护眼睛。激发光源，维护眼睛。n 暗视野显微镜要在光线尽量暗的环境下暗视野显微镜要在光线尽量暗的环境下察看。察看。 五、本卷须知五、本卷须知六、作业与思索题：六、作业与思索题：描画在荧光显微镜下所察看到描画在荧光显微镜下所察看到的实验景象。的实验景象。绘图比较人正常肝组织细胞和绘图比较人正常肝组织细胞和脂肪肝组织细胞。脂肪肝组织细胞。实验七实验七-2 激光扫描共聚焦显微镜在生命科学中的激光扫描共聚焦显微镜在生命科学中的运用运用 实验目的与要

8、求实验目的与要求1. 掌握激光扫描共聚焦显微镜的成像根本掌握激光扫描共聚焦显微镜的成像根本原理及其在生命科学中的运用。原理及其在生命科学中的运用。Laser Scanning Confocal Microscope普通荧光显微镜的缺乏普通荧光显微镜的缺乏 运用荧光物质标志细胞中的特定成分或构造，运用荧光物质标志细胞中的特定成分或构造，不仅图像与对比度加强，而且由于许多荧光显不仅图像与对比度加强，而且由于许多荧光显微镜的光源运用短波长的紫外光，大大提高了微镜的光源运用短波长的紫外光，大大提高了分辩率分辩率=0.61 / NA 。但当所察看的荧光标。但当所察看的荧光标本稍厚时，普通荧光显微镜不仅接

9、纳焦平面上本稍厚时，普通荧光显微镜不仅接纳焦平面上的光量，而且来自焦平面上方或下方的散射荧的光量，而且来自焦平面上方或下方的散射荧光也被物镜接纳，这些来自焦平面以外的荧光光也被物镜接纳，这些来自焦平面以外的荧光使察看到的图像反差和分辨率大大降低即焦使察看到的图像反差和分辨率大大降低即焦平面以外的荧光构造模糊、发虚，缘由是大多平面以外的荧光构造模糊、发虚，缘由是大多数生物学标本是层次区别的重叠构造。数生物学标本是层次区别的重叠构造。一、激光扫描共聚焦显微镜的成像根本原理一、激光扫描共聚焦显微镜的成像根本原理2. 共聚焦扫描显微镜的成像原理共聚焦扫描显微镜的成像原理采用点光源照射标本，在焦平面上构

10、成一个轮廓清采用点光源照射标本，在焦平面上构成一个轮廓清楚的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜楚的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。两者的几何尺寸一致，约孔。两者的几何尺寸一致，约100-200nm；相对于；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点经过一系焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点经过一系列的透镜，最终可同

11、时聚焦于照明针孔和探测针孔。列的透镜，最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。以激光逐点扫描样品，探测测孔之外而不能成像。以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上图像，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成明晰的整个焦平面的共聚焦图像。聚合成明晰的整个焦平面的共聚焦图像。Confoca

12、l Principle每一幅焦平面图像实践上是标本的光学横切面，每一幅焦平面图像实践上是标本的光学横切面，这个光学横短面总是有一定厚度的，又称为光学这个光学横短面总是有一定厚度的，又称为光学薄片。由于焦点处的光强远大于非焦点处的光强，薄片。由于焦点处的光强远大于非焦点处的光强，而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的景深近似为零，沿景深近似为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断轴方向的扫描可以实现光学断层扫描，构成待察看样品聚焦光斑处二维的光学层扫描，构成待察看样品聚焦光斑处二维的光学切片。把切片。把X-Y平面焦平面扫描与平面焦平面扫描与Z轴光轴轴光轴

13、扫描相结合，经过累加延续层次的二维图像，经扫描相结合，经过累加延续层次的二维图像，经过专门的计算机软件处置，可以获得样品的三维过专门的计算机软件处置，可以获得样品的三维图像。图像。察看方式：以荧光为主察看方式：以荧光为主光源：激光紫外、可见光、近红外光源：激光紫外、可见光、近红外照明方式：点照明、逐点扫描照明方式：点照明、逐点扫描成像方式：共聚焦、逐点成像成像方式：共聚焦、逐点成像输出：实时观测输出：实时观测,数字化图像，可以进展图像处置和定量分析数字化图像，可以进展图像处置和定量分析多重染色样品的察看多重染色样品的察看LSCM的根本特点3. 共聚焦扫描显微镜在生命科学研讨中的运用共聚焦扫描显

14、微镜在生命科学研讨中的运用细胞构造、蛋白质如受体、抗原、抗体、酶、细胞构造、蛋白质如受体、抗原、抗体、酶、细胞细胞骨架蛋白等基因表达产物、骨架蛋白等基因表达产物、DNA、RNA等等细胞膜流动性荧光光漂白恢复技术细胞膜流动性荧光光漂白恢复技术细胞内氧自在基活性细胞内氧自在基活性细胞内钙离子浓度变化细胞内钙离子浓度变化膜电位膜电位三、试剂与器材三、试剂与器材青蛙青蛙冷丙酮、冷丙酮、 DAPI 、甘油、甘油/PBS封片剂、滤纸、吸管、载封片剂、滤纸、吸管、载玻片、盖玻片玻片、盖玻片激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜四、实验步骤四、实验步骤取涂有细胞的载玻片细胞涂在中间，冷丙取涂有细胞的载玻片细胞涂在中间，冷丙酮酮40C固定固定10 min;PBS漂洗漂洗2次，每次次，每次3 min; 滴加滴加DAPI溶液溶液100 ul室温孵育室温孵育30 min; PBS漂洗漂洗3次，每次次，每次5min; 滴一小滴甘油滴一小滴甘油/PBS封片剂封片剂(pH8.5，PBS:甘油甘油=1:9，v/v)封片封片