工具酶与基因工程-PowerPoint演示文稿

1、 第一部分第一部分 工具酶与基因工程工具酶与基因工程 一限制性核酸内切酶一限制性核酸内切酶 1限制性核酸内切酶的发现限制性核酸内切酶的发现 2I类和类和III类限制和修饰酶的基本特征类限制和修饰酶的基本特征 3II类限制和修饰酶的基本特征类限制和修饰酶的基本特征 4甲基化酶的基本特征甲基化酶的基本特征 二其它工具酶其它工具酶 1 DNA连接酶连接酶 2聚合酶聚合酶 3末端脱氧核苷酰转移酶末端脱氧核苷酰转移酶(TdT) 4. SI核酸酶核酸酶 5Bal31核酸酶核酸酶 6碱性磷酸单脂酶碱性磷酸单脂酶 限制性内切酶限制性内切酶 (Restriction Endonuclease)* 存在于任何一种

2、原核细菌中存在于任何一种原核细菌中.* 在特异位点上催化双链在特异位点上催化双链DNA分子的断裂分子的断裂,产生相应的限制性产生相应的限制性片段片段.* 各种生物呈现特征性的限制性内切酶切图谱各种生物呈现特征性的限制性内切酶切图谱.* 在生物分类在生物分类,基因定位基因定位,基因重组基因重组,疾病诊断疾病诊断,刑事侦察领域极为刑事侦察领域极为重要重要. 一限制性内切酶的发现：一限制性内切酶的发现：(宿主细胞的限制和修饰作用宿主细胞的限制和修饰作用)宿主细胞的限制和修饰作用：宿主细胞的限制和修饰作用：两种不同来源的入两种不同来源的入-噬菌体噬菌体 入入K；入入B，能高频感染各自大肠杆能高频感染各

3、自大肠杆菌宿主细胞（菌宿主细胞（ K株株 ，B 株株 ）。）。当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，感染下降数千倍。当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，感染下降数千倍。一但一但 入入K 噬菌体在噬菌体在 B 株成功，由株成功，由 B 株繁殖出株繁殖出 入入K 后代，能感后代，能感染染 B 株株, 不能感染原来不能感染原来 K株株.1 宿主细胞的限制和修饰作用；宿主细胞的限制和修饰作用；1两种不同来源的入两种不同来源的入-噬菌体噬菌体 （ 入入- K ，入入-B ）。）。2能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞（能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞（ K株株 ，B 株株 ）。）。3当它们分别与其它宿主菌交叉

4、混合培养时，当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时， （ 入入K-B ，入入B-K ）感染下降数千倍。感染下降数千倍。4一但一但 入入K 噬菌体在噬菌体在 B 株成功，由株成功，由 B 株繁殖出株繁殖出 入入-K 后代，能感染后代，能感染 B 株株, 不能再感染原来不能再感染原来 K株株. 称为：宿主细胞的限制和修饰作用称为：宿主细胞的限制和修饰作用二限制和修饰作用的分子机制二限制和修饰作用的分子机制1大肠杆菌宿主细胞大肠杆菌宿主细胞 K株，株，B 株株 ，有各自的限制和修饰系统。，有各自的限制和修饰系统。1） 它们均有三个连续的基因位点控制，它们均有三个连续的基因位点控制，hsdR; hsdM

5、; hsdS.2） hsdR编码限制性核酸内切酶编码限制性核酸内切酶-识别识别DNA分子特定位点，分子特定位点，将双链将双链DNA切断。（切断。（DNA分子转化细胞：受体细胞去掉分子转化细胞：受体细胞去掉hsdR基因位点）基因位点）3） hsdM编码产物是编码产物是DNA甲基化酶甲基化酶-催化催化DNA分子特定位点分子特定位点的碱基甲基化反应。的碱基甲基化反应。4） hsdS表达产物的功能是表达产物的功能是-协助限制性核酸内切酶和甲基协助限制性核酸内切酶和甲基化酶，识别特殊的作用位点。化酶，识别特殊的作用位点。 2.入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞 K株，株

6、，B株株 中，中， 1）宿主细胞甲基化酶，将染色体）宿主细胞甲基化酶，将染色体DNA和噬菌体和噬菌体DNA 特异性保护特异性保护. 2）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点。）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点。-（修饰）（修饰） 3当外来当外来DNA入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解 -（限制）（限制） 4. 由于降解不完全，外来少数由于降解不完全，外来少数DNA分子在宿主细胞中繁殖过程分子在宿主细胞中繁殖过程 中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解。中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解。 5但丧失在原宿主细胞中的存活能力，因

7、为接受了新宿主菌甲但丧失在原宿主细胞中的存活能力，因为接受了新宿主菌甲基化修饰的同时丧失了原宿主菌修饰的标记基化修饰的同时丧失了原宿主菌修饰的标记(一但一但 入入-K 噬菌噬菌体在体在 B 株成功，由株成功，由 B 株繁殖出株繁殖出 入入-K 后代，能感染后代，能感染 B 株株, 不不能感染原来能感染原来 K株株.) 6细菌利用限制和修饰系统来区分自身细菌利用限制和修饰系统来区分自身DNA与外来与外来DNA。C株不能产生限制性内切酶，其它来源入株不能产生限制性内切酶，其它来源入- 噬菌噬菌体可以感染体可以感染C株，而在株，而在 C株繁殖入株繁殖入- 噬菌体则在噬菌体则在 K株和株和 B 株株

8、受到严格的限制作用受到严格的限制作用三三 限制性内切酶的分类：（三大类）限制性内切酶的分类：（三大类）I I类，类， II类类, III类类.2 I类，类，III类为限制类为限制-修饰酶。修饰酶。 限制性内切活性和甲基化活性，都作为亚基的功能限制性内切活性和甲基化活性，都作为亚基的功能 单位包含在单位包含在 同一酶分子中。同一酶分子中。3 II类限制性内切酶与甲基化酶是分离的，切割位点类限制性内切酶与甲基化酶是分离的，切割位点 专专 一，适合于一，适合于DNA重组。重组。四原核细胞中限制和修饰系统四原核细胞中限制和修饰系统四原核细胞中限制和修饰系统四原核细胞中限制和修饰系统 I类酶类酶 II类

9、酶类酶 III类酶类酶 酶分子酶分子 三亚基双功能三亚基双功能 内切酶与甲基化酶分离内切酶与甲基化酶分离 二亚基双二亚基双 能能 识别位点识别位点 二分非对称序列二分非对称序列 4-6bp序列，回文结构序列，回文结构 5-7bp非对称序列非对称序列 切割位点切割位点 距识别位点距识别位点1000bp 在识别位点中或靠识别位点在识别位点中或靠识别位点 在识别位点在识别位点 下游下游24-26bp限制性反应限制性反应 互斥互斥 分开反应分开反应 同时竟争同时竟争与甲基化反应与甲基化反应限制作用限制作用 需要需要ATP 需要需要 需要需要 不需要不需要 五五I类酶，类酶，III类酶限制类酶限制-修饰

10、酶基本特怔修饰酶基本特怔 1）I类酶，类酶，EcoK，EcoB。（1）异源多聚体，亚基异源多聚体，亚基R.M.S分别具有限制分别具有限制,修饰酶的作用，特修饰酶的作用，特 异性位点识别活性。异性位点识别活性。（2）I类酶与类酶与 DNA识别位点结合依赖亚基识别位点结合依赖亚基 M与辅助因子与辅助因子S腺苷腺苷甲硫氨酸甲硫氨酸(SAM)相互作用。相互作用。（3）S腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸(SAM)通过变构作用使酶处于活性状态，通过变构作用使酶处于活性状态，酶与酶与 DNA识别位点结合后，根据甲基化状态发挥相应酶的活识别位点结合后，根据甲基化状态发挥相应酶的活性，或限制性，或限制, 或限修饰，或不

11、限制不限修饰或限修饰，或不限制不限修饰 2）III类限制修饰酶基本特怔类限制修饰酶基本特怔（1）亚基）亚基R，MS亚基组成。亚基组成。MS亚基具有识别和甲基化修饰亚基具有识别和甲基化修饰双重作用双重作用.（2）修饰与限制取决于两亚基之间的竟争。）修饰与限制取决于两亚基之间的竟争。（3）切割位点无特异性，只与识别位点的距离有关）切割位点无特异性，只与识别位点的距离有关 MboII 识别识别 5-AAGA- 3 切割位点切割位点 5-GAAGANNNNNNNN/N-3 3-CTTCTNNNNNNN/NN-53）II类限制修饰酶基本特怔类限制修饰酶基本特怔（1） 命名规则：命名规则： 生物体属名的第

12、一大写字母和种名前两个小写构成基本名称生物体属名的第一大写字母和种名前两个小写构成基本名称 基本名称基本名称 + 菌株名的字母菌株名的字母 + 罗马字母（发现顺序）罗马字母（发现顺序） Hid III Haemophilus infuenzae d株中的第三个酶株中的第三个酶 EcoR I 基因位于基因位于Escherichia coli 抗药性抗药性R质粒上质粒上 E co R I 细菌属名细菌属名 细菌种名种细菌种名种 菌株类型菌株类型 有几种限制酶有几种限制酶（2）特点）特点 A识别序列识别序列 4，5 或或 6个碱基对，个碱基对， EcoR I 识别识别 5-G/AATTC- 3 序列

13、序列 3-CTTAA/G- 5 B180度旋转对称回文结构，对称轴在第三，四碱基之间。度旋转对称回文结构，对称轴在第三，四碱基之间。 C任何一个任何一个DNA分子，每分子，每9对碱基出现一个对碱基出现一个II类酶切口。类酶切口。 （3） 切割方式切割方式 A以酶切特点来分以酶切特点来分 同位酶：识别相同序列切点不同。同位酶：识别相同序列切点不同。 同裂酶：识别位点相同，酶的来源不同。同裂酶：识别位点相同，酶的来源不同。 同尾酶：识别位点不同，切出片段有相同末端序列。同尾酶：识别位点不同，切出片段有相同末端序列。 B以切出片段末端性质不同可分，粘性末端和平末端。以切出片段末端性质不同可分，粘性末

14、端和平末端。 粘性末端：（粘性末端：（Cohesive Ends）两个突出末端可退火互补两个突出末端可退火互补 DNA是分子重组的基础是分子重组的基础限制内切酶切出的三种断口限制内切酶切出的三种断口 六六甲基化酶的基本特征：甲基化酶的基本特征：1)类限制性内切酶有相应甲基化酶伙伴，类限制性内切酶有相应甲基化酶伙伴，a)限制性内切酶，甲基化酶的识别位点相同，序列内使碱限制性内切酶，甲基化酶的识别位点相同，序列内使碱基甲基化，封闭酶切口。基甲基化，封闭酶切口。b)甲基化酶封闭一个限制性内切酶切口同时产生另一种酶甲基化酶封闭一个限制性内切酶切口同时产生另一种酶切口。切口。 c) DNA腺嘌呤甲基化酶

15、腺嘌呤甲基化酶 Darn DNA胞嘧啶甲基化酶胞嘧啶甲基化酶 Dcm七酶切图谱示意图七酶切图谱示意图1。 一圈表示一种酶。一圈表示一种酶。2 单切口酶在里圈，越多切口酶越在外面。单切口酶在里圈，越多切口酶越在外面。3 大写英文字母表示片段（大写英文字母表示片段（ A，B，C AB ）。）。4 两种片段同样大小两种片段同样大小 （ A1 A2 A3 E1 E2 E3）。）。几次实验后，大小不一几次实验后，大小不一 致以致以 虚线表示不肯定。虚线表示不肯定。 八八DNA切接反应的影响因素切接反应的影响因素1 限制性内切酶的切割反应限制性内切酶的切割反应 10-50mmol/L Tris-HCl (

16、PH7.5), 10mmol/L MgCl2, 1mmol/L DTT (二硫苏糖醇二硫苏糖醇) 只是盐浓度不同，分低盐，中盐，高盐组只是盐浓度不同，分低盐，中盐，高盐组,1）需两种酶切同一分子，酶对盐浓度相同，可同时反应。）需两种酶切同一分子，酶对盐浓度相同，可同时反应。 2）需两种酶切同一分子，酶对盐浓度要求差别不大，中，高）需两种酶切同一分子，酶对盐浓度要求差别不大，中，高 盐，可同时反应。利于酶较贵重的盐浓度缓冲液。盐，可同时反应。利于酶较贵重的盐浓度缓冲液。 3）两种酶切同一分子，酶对盐浓度要求差别大，低，高盐，）两种酶切同一分子，酶对盐浓度要求差别大，低，高盐， 不可不可 同时反应

17、。同时反应。 a) 低盐组先切，加热灭活后，补加盐浓度再切。低盐组先切，加热灭活后，补加盐浓度再切。 b) 沉淀后重新加入另一种盐浓度缓冲液沉淀后重新加入另一种盐浓度缓冲液 c）两种酶不能同时反应，有先有后。两种酶不能同时反应，有先有后。 图图3-162酶量酶量 标准反应标准反应37度反应度反应1小时完全水解小时完全水解1微克所需的酶量。微克所需的酶量。 0.11.0微克微克DNA 5微升微升 10倍缓冲液倍缓冲液 2微升微升 酶酶 1微升（微升（10倍过量）倍过量） 无菌水无菌水 12微升微升 总体积总体积 20微升微升 酶加入量不超过总体积十分之一酶加入量不超过总体积十分之一. 九酶切位点

18、的确定九酶切位点的确定 line DNA W=N+1 ccc DNA W=N 1. 片段大小片段大小2450 line DNA W=N+1 ccc DNA W=N2. 两单酶切成三个片段两单酶切成三个片段,说明各有两个切点说明各有两个切点 -p- p- 750 500 12003 .Pst1, 1200, 750不见不见, 说明说明:(1) 另外两个酶的切点在其中另外两个酶的切点在其中 -x-p-p-x- Xbo1 500 (2) 两个两个Pst1酶的切点相距酶的切点相距500 500 -1200-4. 1200-300+900(被被Xbo1) -x-p-p- x- 300 900 Pst1距

19、距Xbo1为为300 -750-5. 750150+600 -x-p-p-x- 150 600 Pst1距距Xbo1为为600 -1400-6. 1400600+500+300 -x-p-p-x- 600 500 300 -2450-7. 2450-150+600+500+300+900 -x- p- p-x- 150 600 500 300 900 基因重组的其它工具酶基因重组的其它工具酶 1 DNA连接酶连接酶 催化的基本反应形式：催化的基本反应形式： 图图3-11 DNA双链分子上相邻双链分子上相邻 3 羟基和羟基和 5 磷酸集团共价结合，磷酸集团共价结合， 形成形成 3-5 磷酸二酯键

20、，磷酸二酯键， 使原来断开的缺口重新连接起来。使原来断开的缺口重新连接起来。（1）T4 DNA连接酶连接酶 由由 T4 噬菌体基因编码，分子量噬菌体基因编码，分子量60KD。 基本活性基本活性: 图图3-12 1）修复双链）修复双链DNA上单链缺口上单链缺口 2）连接）连接RNA-DNA杂交双链上杂交双链上DNA链缺口链缺口 3）连接完全断开两个平头双链）连接完全断开两个平头双链DNA分子。分子。 修复双链修复双链 DNA上上 单链缺口，单链缺口， 连接连接 RNA-DNA杂交双链上杂交双链上 DNA链缺口，链缺口， 连接完全断开两个平头连接完全断开两个平头 双链双链DNA分子。分子。 2聚合

21、酶聚合酶 DNA聚合酶活性聚合酶活性 3-13 1）5-3聚合酶活性聚合酶活性 2）3-5外切酶活性外切酶活性 3）5-3外切酶活性外切酶活性 4）核酸内切酶活性）核酸内切酶活性 Klenow酶酶 1）5-3聚合酶活性聚合酶活性 2）3-5外切酶活性外切酶活性 作用：作用： 1）修复限制性内切酶造成）修复限制性内切酶造成3凹端，成为平末端。凹端，成为平末端。 2）用同位素对）用同位素对DNA标记。标记。 3）催化第二链合成）催化第二链合成 4）测定）测定DNA序列序列 3末端脱氧核苷酰转移酶末端脱氧核苷酰转移酶(TdT) 图图3-141)1） 适合于带有适合于带有3游离羟基的双链分子。游离羟基的双链分子。2) DNA双链双链3端突出时，端突出时，