代谢控制育种【学时】

1、第七章 微生物代谢控制育种第一节第一节 概论概论第二节第二节 初级代谢的调节控制初级代谢的调节控制第三节第三节 次级代谢的调节控制次级代谢的调节控制第四节第四节 代谢调节控制育种代谢调节控制育种【4学时学时】 p.155第第3 3个转折期：以个转折期：以19561956年谷氨酸发酵成功为标志，发酵工业进年谷氨酸发酵成功为标志，发酵工业进入第入第3 3个转折期个转折期代谢控制发酵时期。代谢控制发酵时期。大体过程：大体过程：以生物化学和遗传学为基础，研究代谢产物的生物合成途径以生物化学和遗传学为基础，研究代谢产物的生物合成途径和代谢调节的机制，选择巧妙的技术路线，通过遗传育种技和代谢调节的机制，选

2、择巧妙的技术路线，通过遗传育种技术获得解除或绕过微生物正常代谢途径的突变株，从而人为术获得解除或绕过微生物正常代谢途径的突变株，从而人为地使有用产物选择性地大量合成和累积。地使有用产物选择性地大量合成和累积。关键：关键：解除微生物代谢调控机制，打破微生物正常的代谢调节，人解除微生物代谢调控机制，打破微生物正常的代谢调节，人为地控制微生物的代谢。为地控制微生物的代谢。代谢控制育种和发酵过程的代谢控制培养是实现这一目标的两代谢控制育种和发酵过程的代谢控制培养是实现这一目标的两个手段，而其中前者是主要支柱技术。个手段，而其中前者是主要支柱技术。与个学科密不可分：生物化学、分子生物学和分子遗传学、过与

3、个学科密不可分：生物化学、分子生物学和分子遗传学、过程控制方法。程控制方法。第一节第一节 概论概论1、初级代谢产物和初级代谢、初级代谢产物和初级代谢2、次级代谢产物和次级代谢、次级代谢产物和次级代谢3、初级代谢与次级代谢的关系、初级代谢与次级代谢的关系1. 概念概念微生物产生的对自身生长和繁殖必须的物质称为微生物产生的对自身生长和繁殖必须的物质称为初级代初级代谢产物谢产物(可细分为中间产物和终产物可细分为中间产物和终产物)，产生这些物质的，产生这些物质的代谢体系称为代谢体系称为初级代谢初级代谢(primary metabolism)。2. 初级代谢体系的组成初级代谢体系的组成分解代谢体系分解代

4、谢体系生物合成体系生物合成体系素材性生物合成体系：小分子素材性生物合成体系：小分子结构性生物合成体系：大分子结构性生物合成体系：大分子1.1 初级代谢产物和初级代谢初级代谢产物和初级代谢次级代谢产物次级代谢产物：对产生它们的生物体本身不：对产生它们的生物体本身不需要的一种产物，也称为需要的一种产物，也称为次生产物次生产物。次级代谢次级代谢(secondary metabolism)：以初级代：以初级代谢产物为前体，合成次生产物的代谢体系。谢产物为前体，合成次生产物的代谢体系。1.2 次级代谢产物和次级代谢次级代谢产物和次级代谢1. 从菌体生化代谢角度分析从菌体生化代谢角度分析1.3 初级代谢与

5、次级代谢的关系初级代谢与次级代谢的关系2. 从遗传代谢角度分析从遗传代谢角度分析1.3 初级代谢与次级代谢的关系初级代谢与次级代谢的关系第二节第二节 初级代谢的调节控制初级代谢的调节控制1、酶合成的调节、酶合成的调节2、酶活性的调节、酶活性的调节3、反馈阻遏与反馈抑制、反馈阻遏与反馈抑制1、酶合成调节的类型、酶合成调节的类型 (1) 诱导诱导 (induction) 根据酶的生成是否与环境中存在的该酶底物或其有关物的根据酶的生成是否与环境中存在的该酶底物或其有关物的关系，可分为：关系，可分为：组成酶：组成酶：细胞固有的酶，相应基因控制合成，不受底物影响。细胞固有的酶，相应基因控制合成，不受底物

6、影响。诱导酶：诱导酶：适应外来物临时合成的酶，受底物影响。适应外来物临时合成的酶，受底物影响。2.1 2.1 酶合成的调节酶合成的调节 (2) 阻遏阻遏 (repression)末端产物阻遏末端产物阻遏(end-product repression)：由某代谢途径末：由某代谢途径末端产物过量累积而引起的阻遏。端产物过量累积而引起的阻遏。对于直线式反应途径，情况较为简单对于直线式反应途径，情况较为简单对于分支代谢途径，情况较复杂：对于分支代谢途径，情况较复杂：每种末端产物仅专一地阻遏合成它的那条分支途径的每种末端产物仅专一地阻遏合成它的那条分支途径的酶。酶。代谢途径分支点以前的公共酶受到所有分支

7、途径末端代谢途径分支点以前的公共酶受到所有分支途径末端产物的阻遏，称为产物的阻遏，称为多价阻遏作用多价阻遏作用。分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏(catabolite repression)：有两种碳源：有两种碳源(或氮或氮源源)分解底物同时存在时，细胞利用快的那种分解底物时分解底物同时存在时，细胞利用快的那种分解底物时会阻遏利用慢的底物有关分解酶合成的现象。会阻遏利用慢的底物有关分解酶合成的现象。2.1 2.1 酶合成的调节酶合成的调节1 1、酶合成调节的类型、酶合成调节的类型1. 酶合成调节的机制酶合成调节的机制(1) 诱导型操纵子负调控诱导型操纵子负调控2.1 2.1 酶合成的调节酶合成的调

8、节 (2) 阻遏型操纵子正调控阻遏型操纵子正调控2.1 2.1 酶合成的调节酶合成的调节1. 1. 酶合成调节的机制酶合成调节的机制1、反馈抑制的类型、反馈抑制的类型 (A) 直线式代谢途径中的反馈抑制直线式代谢途径中的反馈抑制2.2 2.2 酶活性的调节酶活性的调节(B) 分支代谢途径中的反馈抑制分支代谢途径中的反馈抑制(1) 优先合成优先合成(2) 协同反馈抑制协同反馈抑制(concerted feedback inhibition)2.2 2.2 酶活性的调节酶活性的调节(3) 合作反馈抑制合作反馈抑制(cooperative feedback inhibition)2.2 2.2 酶活

9、性的调节酶活性的调节(B) 分支代谢途径中的反馈抑制分支代谢途径中的反馈抑制(4) 累积反馈抑制累积反馈抑制(cumulative feedback inhibition)2.2 2.2 酶活性的调节酶活性的调节(B) 分支代谢途径中的反馈抑制分支代谢途径中的反馈抑制(5) 同工酶调节同工酶调节2.2 2.2 酶活性的调节酶活性的调节(B) 分支代谢途径中的反馈抑制分支代谢途径中的反馈抑制(6) 顺序反馈抑制顺序反馈抑制2.2 2.2 酶活性的调节酶活性的调节(B) 分支代谢途径中的反馈抑制分支代谢途径中的反馈抑制2. 反馈抑制的机制反馈抑制的机制(1) 受反馈抑制的调节酶一般都是受反馈抑制的

10、调节酶一般都是变构酶变构酶(allosteric enzyme)，酶活力调控的实质就是变构酶的变构调节。酶活力调控的实质就是变构酶的变构调节。(2) 变构酶一般由两个以上亚基组成，有两个和低分子物质变构酶一般由两个以上亚基组成，有两个和低分子物质结合位点：结合位点：活性中心：与底物结合的催化中心活性中心：与底物结合的催化中心变构中心：与调节因子相结合的调节中心变构中心：与调节因子相结合的调节中心2.2 2.2 酶活性的调节酶活性的调节2.3 2.3 反馈阻遏与反馈抑制的比较反馈阻遏与反馈抑制的比较第三节第三节 次级代谢的调节控制次级代谢的调节控制抗生素的生物合成途径中，反馈调节作用包括：抗生素

11、的生物合成途径中，反馈调节作用包括：抗生素本身积累起着反馈调节作用抗生素本身积累起着反馈调节作用作为抗生素合成前体的初级代谢产物，当其受到反馈调节时，必然会影作为抗生素合成前体的初级代谢产物，当其受到反馈调节时，必然会影响抗生素的合成。响抗生素的合成。 因此，这些代谢调节机制实质上是提高抗生素发酵单位的天然因此，这些代谢调节机制实质上是提高抗生素发酵单位的天然屏障，如果使调节机制脱敏，将有可能提高抗生素的产量。屏障，如果使调节机制脱敏，将有可能提高抗生素的产量。第三节第三节 次级代谢的调节控制次级代谢的调节控制1. 次级代谢产物的诱导调节次级代谢产物的诱导调节2. 次级代谢产物碳源分解调节次级

12、代谢产物碳源分解调节3. 次级代谢产物氮源分解调节次级代谢产物氮源分解调节4. 次级代谢次级代谢反馈反馈调节调节5. 磷酸盐调节磷酸盐调节6. 细胞膜透性的调节细胞膜透性的调节 1. 两种可能的诱导机制两种可能的诱导机制诱导物诱导物刺激影响初级代谢，造成代谢流的改变刺激影响初级代谢，造成代谢流的改变大量生成次生代谢物大量生成次生代谢物诱导物诱导物次生代谢物合成酶的合成次生代谢物合成酶的合成大量生产次生大量生产次生代谢物代谢物2. 实例实例色氨酸对麦角碱的作用色氨酸对麦角碱的作用蛋氨酸对头孢霉素蛋氨酸对头孢霉素C的作用的作用3. 大多数分解代谢酶属于诱导酶，可以通过加大多数分解代谢酶属于诱导酶，

13、可以通过加入诱导物使酶的产量提高。入诱导物使酶的产量提高。3.1 3.1 次级代谢产物的诱导调节次级代谢产物的诱导调节1. 涉及对终产物阻遏涉及对终产物阻遏实例实例1：青霉素发酵过程中，葡萄糖不利于青霉素合成，而乳糖：青霉素发酵过程中，葡萄糖不利于青霉素合成，而乳糖虽利用缓慢，但能提高青霉素产量。虽利用缓慢，但能提高青霉素产量。实例实例2：头孢霉素：头孢霉素C的生物合成中，抗生素比产率递减顺序为：的生物合成中，抗生素比产率递减顺序为：蔗糖蔗糖半乳糖半乳糖果糖果糖麦芽糖麦芽糖葡萄糖，其中蔗糖是葡萄糖的两倍葡萄糖，其中蔗糖是葡萄糖的两倍多。多。3.2 次级代谢产物碳源分解调节次级代谢产物碳源分解调

14、节2. 抗生素受碳源分解调节的可能机制抗生素受碳源分解调节的可能机制(1) 可能与菌体生长速率控制抗生素合成有关。菌体可能与菌体生长速率控制抗生素合成有关。菌体生长最好的碳源能抑制抗生素合成，因此，在低生生长最好的碳源能抑制抗生素合成，因此，在低生长率的情况下长率的情况下(例如青霉素合成中缓慢补加葡萄糖例如青霉素合成中缓慢补加葡萄糖)可减少葡萄糖的干扰作用。可减少葡萄糖的干扰作用。(2) 可能与分解代谢产物的堆积浓度有关。乳糖之所可能与分解代谢产物的堆积浓度有关。乳糖之所以比葡萄糖优越，是因为前者被水解为可利用单糖以比葡萄糖优越，是因为前者被水解为可利用单糖的速度正好符合青霉素在生产期合成抗生

15、素的需要，的速度正好符合青霉素在生产期合成抗生素的需要，而不会有分解代谢产物如丙酮酸的堆积。而不会有分解代谢产物如丙酮酸的堆积。3.2 3.2 次级代谢产物碳源分解调节次级代谢产物碳源分解调节1.定义：定义：氮源分解调节主要指含氮底物的酶氮源分解调节主要指含氮底物的酶(如蛋如蛋白酶、硝酸还原酶、酰胺酶、组氨酸酶和脲酶白酶、硝酸还原酶、酰胺酶、组氨酸酶和脲酶)的的合成受快速利用的氮源，尤其是氨的阻遏。合成受快速利用的氮源，尤其是氨的阻遏。3.3 3.3 次级代谢产物氮源分解调节次级代谢产物氮源分解调节NH4+影响：影响：(1）pH值质子梯度值质子梯度 改变能量代谢改变能量代谢 细胞壁物质和细胞壁

16、物质和 结构的功能；结构的功能；(2)谷氨酰合成酶和丙谷氨酰合成酶和丙氨脱氢酶的合成；氨脱氢酶的合成；(3)高度磷酸化的核苷，高度磷酸化的核苷，如如ppGpp和和pppGpp可能通过可能通过级联机制调节次级级联机制调节次级代谢，而代谢，而ppGpp等等受氨基酸过量的负受氨基酸过量的负控制调节。控制调节。3.3 3.3 次级代谢产物氮源分解调节次级代谢产物氮源分解调节2. 2. 氮源分解调节的可能机制：氮源分解调节的可能机制：抗生素对自身产物抗生素对自身产物抑制的规律：抑制的规律： 抑制特定产生菌合成抗抑制特定产生菌合成抗生素所需浓度与生产水生素所需浓度与生产水平具有相关性，产生菌平具有相关性，

17、产生菌产量高，对自身抗生素产量高，对自身抗生素的耐受力强，反之则越的耐受力强，反之则越敏感。敏感。实例：氯霉素对芳基氨实例：氯霉素对芳基氨合成酶的合成酶的 反馈调节反馈调节3.4 3.4 次级代谢反馈调节次级代谢反馈调节1. 1. 次级代谢自身产物的反馈调节次级代谢自身产物的反馈调节2. 分支代谢初级代谢物反馈调节对次级代谢的影响分支代谢初级代谢物反馈调节对次级代谢的影响次级途径和初级途径具有共同的分叉中间体，由分叉中间体产生的初级次级途径和初级途径具有共同的分叉中间体，由分叉中间体产生的初级代谢产物的反馈调节可能影响次级代谢产物的形成。代谢产物的反馈调节可能影响次级代谢产物的形成。3.4 3

18、.4 次级代谢反馈调节次级代谢反馈调节实例实例1：赖氨酸对青：赖氨酸对青霉素生物合成的反霉素生物合成的反馈调节馈调节3.4 3.4 次级代谢反馈调节次级代谢反馈调节2. 2. 分支代谢初级代谢物反馈调节对次级代谢的影响分支代谢初级代谢物反馈调节对次级代谢的影响(1) (1) 次级途径和初级途径次级途径和初级途径具有共同的分叉中间体具有共同的分叉中间体实例实例2：色氨酸对杀假：色氨酸对杀假丝菌素生物合成的丝菌素生物合成的反馈调节反馈调节3.4 3.4 次级代谢反馈调节次级代谢反馈调节2. 2. 分支代谢初级代分支代谢初级代谢物反馈调节对次谢物反馈调节对次级代谢的影响级代谢的影响(1) (1) 次

19、级途径和初级途径次级途径和初级途径具有共同的分叉中间体具有共同的分叉中间体 (2) 初级代谢终产物作初级代谢终产物作为前体合成次生产物。为前体合成次生产物。实例：缬氨酸对实例：缬氨酸对青霉素生物合成青霉素生物合成的反馈调节的反馈调节3.4 3.4 次级代谢反馈调节次级代谢反馈调节2. 2. 分支代谢初级代谢物反馈调节对次级代谢的影响分支代谢初级代谢物反馈调节对次级代谢的影响在抗生素发酵中，在抗生素发酵中，加入前体可显著加入前体可显著增产，但前体加增产，但前体加入超过一定限度，入超过一定限度，将产生毒性。将产生毒性。3.4 3.4 次级代谢反馈调节次级代谢反馈调节2. 2. 分支代谢初级代谢物反

20、馈调节对次级代谢的影响分支代谢初级代谢物反馈调节对次级代谢的影响(2) 初级代谢终产物作为前体合成次生产物。初级代谢终产物作为前体合成次生产物。1.磷酸盐的亚适量磷酸盐的亚适量: 已发现过量磷酸盐对四环素、氨基糖苷类和多已发现过量磷酸盐对四环素、氨基糖苷类和多烯大环内酯类等烯大环内酯类等32种抗生素的生物合成产生阻种抗生素的生物合成产生阻抑作用。所以，在工业生产中，磷酸盐常常被抑作用。所以，在工业生产中，磷酸盐常常被控制在适合菌体生长的浓度以下，即所谓的亚控制在适合菌体生长的浓度以下，即所谓的亚适量。适量。2. 磷酸盐调节抗生素的生物合成的机制磷酸盐调节抗生素的生物合成的机制按效应来说，有直接

21、作用和间接效应；按效应来说，有直接作用和间接效应；具体而言，磷酸盐能影响抗生素合成中磷酸酯酶和前具体而言，磷酸盐能影响抗生素合成中磷酸酯酶和前体形成过程中某种酶的活性；体形成过程中某种酶的活性；ATP直接影响某些抗生直接影响某些抗生素合成和糖代谢中某些酶的活性。素合成和糖代谢中某些酶的活性。3.5 3.5 磷酸盐调节磷酸盐调节如果细胞膜对某种物质不能运输或者运输如果细胞膜对某种物质不能运输或者运输功能发生障碍，其结果是：功能发生障碍，其结果是：一方面，细胞内合成代谢的产物不能分泌到胞一方面，细胞内合成代谢的产物不能分泌到胞外，必然会产生反馈调节作用，影响发酵产物外，必然会产生反馈调节作用，影响

22、发酵产物的生产量；的生产量；另一方面，细胞外的营养物质不能进入细胞内，另一方面，细胞外的营养物质不能进入细胞内，从而影响产物的合成，造成产量下降。从而影响产物的合成，造成产量下降。3.6 3.6 细胞膜透性的调节细胞膜透性的调节第四节第四节 代谢调节控制育种代谢调节控制育种 p.171 代谢调节控制育种代谢调节控制育种通过特定突变型的选育，达到改通过特定突变型的选育，达到改变代谢通路、降低支路代谢终产物的产生或切断支变代谢通路、降低支路代谢终产物的产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜的透性，使代谢流向目的路代谢途径及提高细胞膜的透性，使代谢流向目的产物积累方向进行。产物积累方向进行。代谢控制发酵

23、：将微生物通过人工诱变，获得代谢发生改变的突变株，在控制条件下，选择性地大量生产某种人们所需要的产品。抗反馈调节抗反馈调节突变株选育突变株选育1. 概念：指操纵基因或调节基因突变引起酶合成诱导机制概念：指操纵基因或调节基因突变引起酶合成诱导机制失灵，菌株不经诱导也能合成酶、或不受终产物阻遏的调失灵，菌株不经诱导也能合成酶、或不受终产物阻遏的调节突变型。节突变型。调节基因突变，致使不能形成活性化的阻抑物；调节基因突变，致使不能形成活性化的阻抑物；操纵基因突变，丧失和阻抑物结合的亲和力。操纵基因突变，丧失和阻抑物结合的亲和力。 因此，可以利用一些易同化碳源或价廉易得的碳源作为因此，可以利用一些易同

24、化碳源或价廉易得的碳源作为基质生产所需的诱导酶类。基质生产所需的诱导酶类。2. 筛选方法及实例筛选方法及实例(1) 限量诱导物恒化培养限量诱导物恒化培养(2) 循环培养循环培养(3) 鉴别性培养基的利用鉴别性培养基的利用(4) 筛选筛选4.1 4.1 组成型突变株的选育组成型突变株的选育 (1) 限量诱导物恒化培养限量诱导物恒化培养将野生型菌种经诱变后移接到低将野生型菌种经诱变后移接到低浓度诱导物的恒化器中连续培养浓度诱导物的恒化器中连续培养由于底物浓度低到对由于底物浓度低到对野生型不发生诱导作野生型不发生诱导作用，所以诱导型的野用，所以诱导型的野生菌不能生长生菌不能生长突变株由于不经诱导突变

25、株由于不经诱导即可产生诱导酶而利即可产生诱导酶而利用底物，因而得以生用底物，因而得以生长成为组成型菌株长成为组成型菌株4.1 4.1 组成型突变株的选育组成型突变株的选育2. 2. 筛选方法及实例筛选方法及实例 (2) 循环培养循环培养含有诱导物含有诱导物的培养基的培养基不含诱导物不含诱导物的培养基的培养基交替连续循环培养交替连续循环培养由于组成型突变株在两种培养基由于组成型突变株在两种培养基上都能产酶，生长逐渐占优势上都能产酶，生长逐渐占优势4.1 4.1 组成型突变株的选育组成型突变株的选育2. 2. 筛选方法及实例筛选方法及实例(3) 鉴别性培养基的利用鉴别性培养基的利用甘油作惟甘油作惟

26、一碳源一碳源涂布诱涂布诱变孢子变孢子悬液悬液喷上喷上O-O-硝基苯酚硝基苯酚-D-D-半乳糖苷半乳糖苷(ONPG)(ONPG)组成型组成型诱导型诱导型4.1 4.1 组成型突变株的选育组成型突变株的选育2. 2. 筛选方法及实例筛选方法及实例 (4) 筛选筛选经诱变剂处理后的菌体移接到含有诱导能力低，经诱变剂处理后的菌体移接到含有诱导能力低，但能作为良好碳源的诱导物的培养基中培养，但能作为良好碳源的诱导物的培养基中培养，突变体能良好生长，野生型不能生长。突变体能良好生长，野生型不能生长。例如：利用苯例如：利用苯-半乳糖半乳糖(PG)筛选筛选-半乳糖苷酶组成半乳糖苷酶组成型突变株。型突变株。4.

27、1 4.1 组成型突变株的选育组成型突变株的选育2. 2. 筛选方法及实例筛选方法及实例概念：抗分解阻遏和抗分解抑制的突变株。概念：抗分解阻遏和抗分解抑制的突变株。分解代谢阻遏现象：在初级或次级代谢中都存在，其含分解代谢阻遏现象：在初级或次级代谢中都存在，其含义是指代谢过程中酶的合成往往受高浓度的葡萄糖或其义是指代谢过程中酶的合成往往受高浓度的葡萄糖或其他易分解利用的碳源或氮源所抑制。他易分解利用的碳源或氮源所抑制。选育抗分解调节突变株选育抗分解调节突变株(如碳源、氮源或磷酸盐分解调节如碳源、氮源或磷酸盐分解调节)，其实就是筛选合成酶的产生不受碳、氮、磷的代谢阻遏其实就是筛选合成酶的产生不受碳

28、、氮、磷的代谢阻遏或抑制的突变株，使抗生素提前到菌体生长期开始合成，或抑制的突变株，使抗生素提前到菌体生长期开始合成，延长产抗期以提高产量。延长产抗期以提高产量。4.2 4.2 抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变株的选育 筛选此类突变株的目的筛选此类突变株的目的由于葡萄糖分解产物的积累，阻遏抗生素合成的关键酶，由于葡萄糖分解产物的积累，阻遏抗生素合成的关键酶，从而抑制抗生素的合成。在实际生产中，采用流加葡萄从而抑制抗生素的合成。在实际生产中，采用流加葡萄糖或应用混合碳源可以控制分解中间产物的累积来减少糖或应用混合碳源可以控制分解中间产物的累积来减少不利影响，但最根本的办法则是筛选抗碳源分解调

29、节突不利影响，但最根本的办法则是筛选抗碳源分解调节突变株，以解除上述调节机制，达到增产的目的。变株，以解除上述调节机制，达到增产的目的。 筛选方法与实例筛选方法与实例(1) 循环培养法循环培养法(2) 鉴别性培养基鉴别性培养基(3) 特殊氮源特殊氮源(4) 葡萄糖结构类似物葡萄糖结构类似物4.2 4.2 抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变株的选育1. 1. 解除碳源调节突变株的选育解除碳源调节突变株的选育(1) 循环培养法循环培养法快速利用的快速利用的碳源培养基碳源培养基慢速利用的慢速利用的碳源培养基碳源培养基交替培养交替培养突变型解除了阻遏现象，在乳糖突变型解除了阻遏现象，在乳糖的培养基上

30、比野生型生长速度快，的培养基上比野生型生长速度快，4.2 4.2 抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变株的选育1. 1. 解除碳源调节突变株的选育解除碳源调节突变株的选育(2) 鉴别性培养基鉴别性培养基含有葡萄含有葡萄糖的琼脂糖的琼脂平板平板涂布诱涂布诱变后的变后的菌体菌体喷上喷上O-O-硝基苯酚硝基苯酚- -D-D-半乳糖苷半乳糖苷(ONPG)(ONPG)突变型突变型野生型野生型4.2 4.2 抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变株的选育1. 1. 解除碳源调节突变株的选育解除碳源调节突变株的选育(3) 特殊氮源特殊氮源用葡萄糖为碳源，受阻遏酶的底物作为惟一氮源用葡萄糖为碳源，受阻遏酶的底物

31、作为惟一氮源配制成培养基，连续移接诱变后的产气杆菌配制成培养基，连续移接诱变后的产气杆菌(Aerobacters aerogenes)，可以筛选出不受葡萄糖，可以筛选出不受葡萄糖阻遏的组氨酸酶突变株。阻遏的组氨酸酶突变株。4.2 4.2 抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变株的选育1. 1. 解除碳源调节突变株的选育解除碳源调节突变株的选育(4) 葡萄糖结构类似物葡萄糖结构类似物 特性：特性：2-dG和和3-mG既不被微生物代谢又具有分解既不被微生物代谢又具有分解阻遏作用，因此可用来筛选抗分解阻遏的突变株。阻遏作用，因此可用来筛选抗分解阻遏的突变株。2-dG3-mG4.2 4.2 抗分解调节突

32、变株的选育抗分解调节突变株的选育1. 1. 解除碳源调节突变株的选育解除碳源调节突变株的选育 筛选方法筛选方法培养基要求含低浓度培养基要求含低浓度2-dG或或3-mG及一种生长碳源，该及一种生长碳源，该碳源必须经相应的诱导酶水解才能被微生物同化利用。碳源必须经相应的诱导酶水解才能被微生物同化利用。 抗性突变株的性质抗性突变株的性质应用应用2-dG或或3-mG不仅可以定向选育分解阻遏脱敏突变不仅可以定向选育分解阻遏脱敏突变株，也可有效地分离到高产菌株。株，也可有效地分离到高产菌株。4.2 4.2 抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变株的选育1. 1. 解除碳源调节突变株的选育解除碳源调节突变株的

33、选育(4) (4) 葡萄糖结构类似物葡萄糖结构类似物2. 解除氮源分解调节突变株的选育解除氮源分解调节突变株的选育氮源分解调节：指含氮产物的酶受快速利用的氮源阻遏。氮源分解调节：指含氮产物的酶受快速利用的氮源阻遏。类型：细菌、酵母、霉菌等微生物对初级代谢产物的氮类型：细菌、酵母、霉菌等微生物对初级代谢产物的氮降解物具有调节作用。次级代谢的氮降解物的阻遏主要降解物具有调节作用。次级代谢的氮降解物的阻遏主要指铵盐和其他快速利用的氮源对抗生素生物合成具有分指铵盐和其他快速利用的氮源对抗生素生物合成具有分解调节作用。解调节作用。实例：筛选芽孢杆菌中耐氨基酸菌株，是提高蛋白酶产实例：筛选芽孢杆菌中耐氨基

34、酸菌株，是提高蛋白酶产量的一种有效方法。量的一种有效方法。4.2 4.2 抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变株的选育3. 解除磷酸盐调节突变株的选育解除磷酸盐调节突变株的选育（A）磷酸盐对次生产物的调节机制）磷酸盐对次生产物的调节机制(1) 通过初级代谢的变化影响次级代谢通过初级代谢的变化影响次级代谢 加强初级代谢，推迟抗生素合成的起始；加强初级代谢，推迟抗生素合成的起始； 改变糖类分解代谢途径，磷酸盐有利于糖酵解，改变糖类分解代谢途径，磷酸盐有利于糖酵解，从而降低戊糖途径的活力，导致某些以戊糖途径为从而降低戊糖途径的活力，导致某些以戊糖途径为先导的抗生素合成受抑制；先导的抗生素合成受抑制；

35、 限制抗生素合成的诱导物；限制抗生素合成的诱导物； 抑制或阻遏磷酸脂酶类的合成。抑制或阻遏磷酸脂酶类的合成。(2) 磷酸盐对磷酸盐对ATP调节：磷酸盐可能通过调节细胞内调节：磷酸盐可能通过调节细胞内的效应物的效应物cAMP、ATP等来控制抗生素的基因表达。等来控制抗生素的基因表达。4.2 4.2 抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变株的选育（B） 发酵过程中对磷酸盐的控制发酵过程中对磷酸盐的控制其添加浓度要严格限制在亚适量的水平，但最主要的目其添加浓度要严格限制在亚适量的水平，但最主要的目标是选育解除磷酸盐调节突变株。标是选育解除磷酸盐调节突变株。4.2 4.2 抗分解调节突变株的选育抗分解调

36、节突变株的选育3. 3. 解除磷酸盐调节突变株的选育解除磷酸盐调节突变株的选育 （C）抗磷酸突变）抗磷酸突变株的筛选方法株的筛选方法4.2 4.2 抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变株的选育3. 3. 解除磷酸解除磷酸 盐盐调节突变株的调节突变株的选育选育 营养缺陷型突变株的特性：营养缺陷型突变株的特性： （1）代谢障碍突变株，由结构基因突变引起合成代谢中一个）代谢障碍突变株，由结构基因突变引起合成代谢中一个酶失活，使某个生化反应发生遗传性障碍，使菌株丧失合成酶失活，使某个生化反应发生遗传性障碍，使菌株丧失合成某种物质的能力，导致该菌株在培养基中不添加这种物质就某种物质的能力，导致该菌株在培

37、养基中不添加这种物质就无法生长。无法生长。 （2）营养缺陷型菌株常常会使发生障碍的前一步的中间代谢）营养缺陷型菌株常常会使发生障碍的前一步的中间代谢产物得到累积，这就成为利用营养缺陷型菌株进行工业发酵产物得到累积，这就成为利用营养缺陷型菌株进行工业发酵来积累有用中间代谢产物的依据。来积累有用中间代谢产物的依据。 （3）营养缺陷型菌株由于生物合成途径中某一步发生障碍，）营养缺陷型菌株由于生物合成途径中某一步发生障碍，合成反应不能完成，从而解除了终产物反馈阻抑。外加限量合成反应不能完成，从而解除了终产物反馈阻抑。外加限量需要的营养物质，克服生长的障碍，使终产物不至于积累到需要的营养物质，克服生长的

38、障碍，使终产物不至于积累到引起反馈调节的浓度，从而有利于中间产物或另一途径的某引起反馈调节的浓度，从而有利于中间产物或另一途径的某种终产物的积累。种终产物的积累。4.3 4.3 营养缺陷型在代谢调节育种中的应用营养缺陷型在代谢调节育种中的应用1、在初级代谢调节育种中、在初级代谢调节育种中 的的应用应用（1）直线式生物合成途径）直线式生物合成途径4.3 4.3 营养缺陷型在代谢调节育种中的应用营养缺陷型在代谢调节育种中的应用 （2） 分支式生物分支式生物合成途径合成途径 实例实例1：谷氨酸：谷氨酸棒状杆菌的棒状杆菌的L-谷氨酸生物合谷氨酸生物合成途径成途径生物素缺陷型生物素缺陷型硫胺素缺陷型硫胺

39、素缺陷型4.3 4.3 营养缺陷型在代谢调节育种中的应用营养缺陷型在代谢调节育种中的应用1 1、在初级代谢调节育种中的应用、在初级代谢调节育种中的应用实例实例2：谷氨酸棒状杆菌的腺核苷酸、鸟核苷酸的合：谷氨酸棒状杆菌的腺核苷酸、鸟核苷酸的合成代谢途径成代谢途径腺嘌呤缺陷型腺嘌呤缺陷型协同反馈抑制协同反馈抑制实例实例3 高丝氨酸营养缺陷型菌株的赖氨酸合成途径高丝氨酸营养缺陷型菌株的赖氨酸合成途径高丝氨酸缺陷型高丝氨酸缺陷型协同反馈抑制协同反馈抑制2. 在次级代谢调节育种中的应用在次级代谢调节育种中的应用（1）抗生素增产：抗生素产生菌的营养缺陷株多数生产能力）抗生素增产：抗生素产生菌的营养缺陷株多

40、数生产能力是下降的。然而，在初级或次级代谢产物的分支代谢途径中，是下降的。然而，在初级或次级代谢产物的分支代谢途径中，营养缺陷型切断初级代谢支路，有可能使抗生素增产。营养缺陷型切断初级代谢支路，有可能使抗生素增产。4.3 4.3 营养缺陷型在代谢调节育种中的应用营养缺陷型在代谢调节育种中的应用实例：四环素、制霉菌素产生菌的脂肪酸缺陷型实例：四环素、制霉菌素产生菌的脂肪酸缺陷型可增加抗生素。可增加抗生素。脂肪酸缺陷型脂肪酸缺陷型 （2）新产品）新产品 实例：实例： 金霉素第六碳原子上金霉素第六碳原子上甲基是由氮氨酸供甲基是由氮氨酸供应的，如果获得蛋应的，如果获得蛋氨酸缺陷型，阻断氨酸缺陷型，阻断

41、了蛋氨酸这一区段了蛋氨酸这一区段的合成，导致次级的合成，导致次级代谢中甲基供给受代谢中甲基供给受到限制，结果产生到限制，结果产生去甲基金霉素，而去甲基金霉素，而不产生金霉素。不产生金霉素。4.3 4.3 营养缺陷型在代谢调节育种中的应用营养缺陷型在代谢调节育种中的应用2. 2. 在次级代谢调节育种中的应用在次级代谢调节育种中的应用概念：渗漏缺陷型概念：渗漏缺陷型(leaky mutants)是一种特殊的营是一种特殊的营养缺陷型，是遗传性代谢障碍不完全的突变型。其养缺陷型，是遗传性代谢障碍不完全的突变型。其特点是酶活力下降而不完全丧失，并能在基本培养特点是酶活力下降而不完全丧失，并能在基本培养基

42、上少量生长。基上少量生长。筛选的方法：将大量营养缺陷型菌株接种到基本培筛选的方法：将大量营养缺陷型菌株接种到基本培养基平板上，挑选生长特别慢而菌落小的即可。养基平板上，挑选生长特别慢而菌落小的即可。应用：正是利用了渗漏缺陷型既能少量合成代谢终应用：正是利用了渗漏缺陷型既能少量合成代谢终产物，又不造成反馈抑制的特点。产物，又不造成反馈抑制的特点。4.4 4.4 渗漏缺陷型在代谢调节育种中的应用渗漏缺陷型在代谢调节育种中的应用概念：抗反馈调节突变株是一种解除合成代谢反馈调节机概念：抗反馈调节突变株是一种解除合成代谢反馈调节机制的突变型菌株。其特点是所需产物不断积累，不会因其制的突变型菌株。其特点是

43、所需产物不断积累，不会因其浓度超量而终止生产：浓度超量而终止生产：如果由于结构基因突变而使变构酶成为不能和代谢终产物相结如果由于结构基因突变而使变构酶成为不能和代谢终产物相结合的，便是失去了反馈抑制的突变，称为合的，便是失去了反馈抑制的突变，称为“抗反馈突变型抗反馈突变型”；如果是由于调节基因突变引起调节蛋白不能和代谢终产物相结如果是由于调节基因突变引起调节蛋白不能和代谢终产物相结合而失去阻遏作用的，称为合而失去阻遏作用的，称为“抗阻遏突变型抗阻遏突变型”。 一般而言，抗阻遏突变结果使胞内酶有可能成倍增长，而一般而言，抗阻遏突变结果使胞内酶有可能成倍增长，而抗反馈突变的胞内酶量没有什么变化。但

44、从作用效果上讲，抗反馈突变的胞内酶量没有什么变化。但从作用效果上讲，均造成终产物大量积累，而且往往两种突变同时发生，难均造成终产物大量积累，而且往往两种突变同时发生，难以区别。通常就统称为以区别。通常就统称为“抗反馈调节突变型抗反馈调节突变型”。4.5 4.5 抗反馈调节突变株的选育抗反馈调节突变株的选育在实际应用中，抗反馈调节突变株的选育可在实际应用中，抗反馈调节突变株的选育可以通过以下几个方面：以通过以下几个方面：从遗传上解除反馈调节从遗传上解除反馈调节 (如各种抗性和耐性育种、如各种抗性和耐性育种、回复突变子的应用等回复突变子的应用等)截流或减少终产物堆积截流或减少终产物堆积 (如借助营

45、养缺陷型或采用如借助营养缺陷型或采用渗漏缺陷型等渗漏缺陷型等)移去终产物移去终产物 (借助膜透性的突变等借助膜透性的突变等)4.5 4.5 抗反馈调节突变株的选育抗反馈调节突变株的选育1、回复突变引起的抗反馈调节突变株、回复突变引起的抗反馈调节突变株2、耐自身产物突变株选育、耐自身产物突变株选育3、抗终产物结构类似物突变株的选育、抗终产物结构类似物突变株的选育4、累积前体和耐前体突变株的选育、累积前体和耐前体突变株的选育4.5 抗反馈调节突变株的选育抗反馈调节突变株的选育1. 概念：一种可逆性突变，即具有突变型基因的个体通过再突变概念：一种可逆性突变，即具有突变型基因的个体通过再突变又成为野生

46、型表型的过程。又成为野生型表型的过程。2. 产生的原因产生的原因(1) 原有基因的回复突变：指基因内部位点突变引起的逆向突变现象，分以下原有基因的回复突变：指基因内部位点突变引起的逆向突变现象，分以下两种情况：两种情况： 同一基因内的同一个或几个碱基的突变引起的回复，消除了原有突变同一基因内的同一个或几个碱基的突变引起的回复，消除了原有突变效应，完全恢复野生基因型及其功能，即真正的回复突变；效应，完全恢复野生基因型及其功能，即真正的回复突变； 在同一基因内，但不同的位点碱基的变化，改变了基因的核苷酸序列，在同一基因内，但不同的位点碱基的变化，改变了基因的核苷酸序列，补偿了原有突变点已失去的功能

47、，使其出现野生表型，称为基因内抑制补偿了原有突变点已失去的功能，使其出现野生表型，称为基因内抑制突变。突变。4.5.1 4.5.1 回复突变引起的抗反馈调节突变株回复突变引起的抗反馈调节突变株(2) 非原有基因的回复突变非原有基因的回复突变概念：在概念：在DNA分子链上的一个基因突变成为突变分子链上的一个基因突变成为突变型，随后在邻近的基因某位点碱基发生突变，抑型，随后在邻近的基因某位点碱基发生突变，抑制了前一个突变基因的效应，重新出现野生型的制了前一个突变基因的效应，重新出现野生型的表型，又称为抑制基因突变。表型，又称为抑制基因突变。4.5.1 4.5.1 回复突变引起的抗反馈调节突变株回复

48、突变引起的抗反馈调节突变株2. 2. 产生的原因产生的原因 区别基因回复突变和抑制基因突变的方法区别基因回复突变和抑制基因突变的方法将回复突变菌株和野生型菌株进行回交试验或杂交将回复突变菌株和野生型菌株进行回交试验或杂交重组试验，观察它们的子代是否有突变型出现：重组试验，观察它们的子代是否有突变型出现： 有同样的突变型重新出现，说明回复突变和原来突变有同样的突变型重新出现，说明回复突变和原来突变型不在同一位置而是分开的，属于抑制基因回复突变株；型不在同一位置而是分开的，属于抑制基因回复突变株； 如果杂交后代没有产生突变型，表明回复突变的位置如果杂交后代没有产生突变型，表明回复突变的位置与原突变

49、型位点相同，是真正的回复突变。与原突变型位点相同，是真正的回复突变。4.5.1 4.5.1 回复突变引起的抗反馈调节突变株回复突变引起的抗反馈调节突变株3. 回复突变引起的抗反馈调节突变株的筛选回复突变引起的抗反馈调节突变株的筛选 (1) 初级代谢途径障碍性回复突变型初级代谢途径障碍性回复突变型采用回复突变方法来筛选抗反馈调节突变株是根据采用回复突变方法来筛选抗反馈调节突变株是根据“原原养型养型营缺型营缺型原养型原养型”选育途径进行的。二次突变后选育途径进行的。二次突变后的情况有以下两种：的情况有以下两种： 一种是在原位点发生回复突变，恢复野生型酶活力；一种是在原位点发生回复突变，恢复野生型酶

50、活力； 另一种是在原突变位点以外位置回复突变。这种回复突变体的另一种是在原突变位点以外位置回复突变。这种回复突变体的表型虽然与原养型相似，但基因型不同，它并不是原有结构基因表型虽然与原养型相似，但基因型不同，它并不是原有结构基因的恢复，而是反馈调节变构酶的调节中心发生突变造成。突变后的恢复，而是反馈调节变构酶的调节中心发生突变造成。突变后的调节中心与活性中心相互影响，催化位点得以恢复酶活力，由的调节中心与活性中心相互影响，催化位点得以恢复酶活力，由于调节位点已发生突变，它不能再和阻遏物结合，因此，回复突于调节位点已发生突变，它不能再和阻遏物结合，因此，回复突变解除了反馈调节机制，使有效代谢产物

51、大量累积。变解除了反馈调节机制，使有效代谢产物大量累积。4.5.1 4.5.1 回复突变引起的抗反馈调节突变株回复突变引起的抗反馈调节突变株 (2) 次级代谢途径障碍性的回复突变次级代谢途径障碍性的回复突变次级代谢回复突变，是一种初级代谢途径或次级代谢途径障次级代谢回复突变，是一种初级代谢途径或次级代谢途径障碍性回复突变型。例如金霉素回复突变就是利用碍性回复突变型。例如金霉素回复突变就是利用“原养型原养型营缺型营缺型原养型原养型”选育途径进行的，获得了增产。选育途径进行的，获得了增产。除放线菌外，真核微生物获得高活性的回复突变的例子不多。除放线菌外，真核微生物获得高活性的回复突变的例子不多。回

52、复突变的选育途径也可以应用回复突变的选育途径也可以应用“零变株零变株”的回复突变型来的回复突变型来达到超产目的。达到超产目的。“零变株零变株”指完全失去产生抗生素能力的突变株；指完全失去产生抗生素能力的突变株；选育途径是：原养型选育途径是：原养型零变株零变株回复突变型。回复突变型。“零突变零突变”可以发生在初级代谢，也可以发生在次生代谢途径中，总可以发生在初级代谢，也可以发生在次生代谢途径中，总之是失去了产量的代谢障碍突变。之是失去了产量的代谢障碍突变。“零变株零变株”的回复突变株的筛选的回复突变株的筛选4.5.1 4.5.1 回复突变引起的抗反馈调节突变株回复突变引起的抗反馈调节突变株3.

53、3. 回复突变引起的抗反馈调节突变株的筛选回复突变引起的抗反馈调节突变株的筛选发生障碍性突变的营养缺陷型，抗生素产量大多数发生障碍性突变的营养缺陷型，抗生素产量大多数都比亲株低，而回复突变株往往比原养型亲株高。都比亲株低，而回复突变株往往比原养型亲株高。原因在于：原因在于：A. 缺陷型菌株中几种不能合成的氨基酸都是参与相应抗缺陷型菌株中几种不能合成的氨基酸都是参与相应抗生素生物合成的，基因突变的结果是使菌体丧失参与合生素生物合成的，基因突变的结果是使菌体丧失参与合成这些氨基酸的酶活力，导致有关抗生素合成过程因缺成这些氨基酸的酶活力，导致有关抗生素合成过程因缺乏氨基酸而产量下降。乏氨基酸而产量下

54、降。B. 回复突变除原变异位点发生逆转突变而使野生型基因回复突变除原变异位点发生逆转突变而使野生型基因重建以外，有时还会发生原突变位点以外的基因内抑制重建以外，有时还会发生原突变位点以外的基因内抑制或抑制基因突变。或抑制基因突变。自身代谢产物，包括初级代谢产物和次级代谢产物。自身代谢产物，包括初级代谢产物和次级代谢产物。微生物控制初级代谢产物的反馈机制相当严格；微生物控制初级代谢产物的反馈机制相当严格；对次生产物，反馈调节机制也起重要作用。对次生产物，反馈调节机制也起重要作用。 要使这些产物适量生产，必须绕过这些调节机制。要使这些产物适量生产，必须绕过这些调节机制。一个菌株的生产能力与耐自身抗

55、生素的浓度是成正相关的。一个菌株的生产能力与耐自身抗生素的浓度是成正相关的。抗自身产物能力是高产菌株的特性之一。抗自身产物能力是高产菌株的特性之一。除耐自身产物之外，还可以考虑与以下情况结合进行：除耐自身产物之外，还可以考虑与以下情况结合进行：第一，抗第一，抗Mg 2离子突变离子突变第二，许多抗生素的钝化酶已知作为选择性标记，设想筛选高活第二，许多抗生素的钝化酶已知作为选择性标记，设想筛选高活性钝化酶的变株，其自身耐性亦会提高。性钝化酶的变株，其自身耐性亦会提高。 钝化酶：又称合成酶，可催化某些基团结合到抗生素的钝化酶：又称合成酶，可催化某些基团结合到抗生素的OH基或基或NH2基上，使抗生素失

56、活。基上，使抗生素失活。 4.5.2 4.5.2 耐自身产物突变株选育耐自身产物突变株选育1. 结构类似物是指那些在结构上和代谢终产物结构类似物是指那些在结构上和代谢终产物(氨基酸、嘌呤、维生素等氨基酸、嘌呤、维生素等)相似相似的物质。它们和终产物一样能够和变构酶的调节蛋白结合，起共遏物作用，的物质。它们和终产物一样能够和变构酶的调节蛋白结合，起共遏物作用，用酶变构引起反馈阻抑；所不同的是，终产物与酶结合是可逆的，而类似物用酶变构引起反馈阻抑；所不同的是，终产物与酶结合是可逆的，而类似物由于不真正掺入细胞结构，酶活性不会恢复，因而是由于不真正掺入细胞结构，酶活性不会恢复，因而是“假反馈抑制假反馈抑制”。4.5.3 4.5.3 抗终产物结构类似物突变株的选育抗终产物结构类似物突变株的选育2. 结构类似物对微生物是致死的，它们往往具有抑菌的作用。结构类似物对微生物是致死的，它们往往具有抑菌的作用。在含有结构类似物的培养基上野生型是不能生长，然而抗结在含有结构类似