CBA试剂盒原理及问题

1、Cytometric Bead Array ( CBA) ,即微量样本多指标流式蛋白定量技术是一个基于流式细胞检测系统的多重蛋白定量检测方法，它能够同时对单个样品中的多个指标进行检测。日常实验中，常需对溶液体系中的可溶性蛋白进行定量检测，如细胞培养上清或血清中的细胞因子含量的定量分析， 由于这 些因子的含量较少，低于一般常规方法的检测下限，使用常用的蛋白检测方法western Blot等很难检测。BD公司利用流式细胞仪可对荧光信号进行级数放大的特性， 只需使受检的可溶性因子附着于一些具有近似细胞直径的微粒上， 即可对受检样品中的各种可溶性因子进行检测。为此， BD公司开发了的微量样本多指标流式

2、蛋白定量系统，简称CBA 系统，通过利用一系列带有荧光标记的微小、分散的微球连结 特定的捕获抗体以捕捉溶液系统中的待测物， 通过对应各种 不同检测物的特异微球上所带有荧光强度不同从而同时测 定分析样本中多种可溶性成分的数量。BD 的 CBA 系统的工作原理简单，对应受检系统中的每一个检测指标都设有不同的捕获微球， 不同的捕获微球上包被有特异的捕获抗体，并具有不同的荧光强度，通过捕获微球与待测样品溶液混合后， 微球上的特异性抗体就与样品 (血清、血浆或细胞培养液)中的相应抗原或蛋白结合，最后，加入荧光的检测抗体以形成 “三明治 ”夹心复合物，通过流式细胞样进行荧光检测， 便可对样品中的各检测因子

3、的含量进行分析。由于BD的CBA系统中每一个微球都能够提供一个和特定蛋白结合的表面，因此，每个微球就相当于一个单独的、包被女?的ELISAS;相对于传统的ELISA技术，荧光信号显色的灵敏度比一般化学发光的灵敏度高，加上利用流式细胞仪对于荧光信号的高敏感性及放大作用，使用这种技术检测未知样品中的指标所需要的样品浓度更低，实验时间更短；另外，常规的ELISA操作，每次只能对一个样本中的一个指 标进行检测，各检测子标间的操作需分开进行，往往造成珍贵样本的耗费，如病患者血液中向免疫调节细胞因子包括IFN-v TNF-a、IL-2等，通过 BD CBA系统，可同时对一个对 样品中的多个指标进行检测，这

4、为一些ELISA技术无法满足的实验提供了新的检测手段。现时， BD 公司为了满足各种实验所需，符合各种要求的检测试剂盒逐渐增多，随着对CBA 检测技术的不断完善，BD的CBA系统的使用者亦不断上升，为了方便BD的CBA系统 使用， 我们对 CBA 系统操作中一些常见问题及实验注意事项进行了总结，希望以下的总结，可使客户在以BD的CBA系统在开展实验时，能更有效、更准确、省时的完成实验。Q : 我能不能使用 Coulter XL 去分析我的 CBA 数据？A :虽然CBA试剂盒是为 BD FACScan和FACSCalibur流式 细胞仪设计的，CBA试剂盒也可以通过 Coulter XL细胞仪

5、检 测， CBA 版本以上的软件具有参数兼容性的特征，可以使用非 BD 公司的仪器分析实验数据，请参阅软件的用户使用指南或者联系技术支持得到进一步的信息。Q : 实验过程中，除了CBA 的分析试剂盒，我们还需要准备什么？A :除了试剂盒中所包含的成份外，若要进行CBA分析实验，还需要购买BD 的微量样本多指标流式蛋白定量技术分析软件(cat. no. 0421CD/ 550065),此软件主要是用于分析您的实验数据。虽然实验数据的分析可以不使用CBA 的特定软件，但是， 由于 CBA 实验中所采集的数据较为繁杂， 若不通过专用的 CBA 软件进行分析，则进行数据分析的时间将显着增加。CBA的专

6、用软件是建立在Microsoft Excel的基础上的，用户只需要完全安装MS Excel 98 或者 Version 即可安装CBA 的专用软件。此外， 用户还需要一个488 纳米激光器及3 个荧光参数的接收的流式细胞仪 (eg: BD FACScan or BD FACSCalibur cytometer) 。Q : CBA中使用的微珠是由什么做的所使用到的微珠的平均 半径是多少？A : CBA 中使用的微珠的原料是聚苯乙烯，约为 m 。Q :在CBA分析中我应该使用何种型号的试验管？A :除了 FACSArray外，我们建议使用12x75 mm, 5 ml的聚苯 乙烯管(BD Falco

7、n Cat No. 352008)。Q : CBA 分析中在进行标准曲线的配制时， 有什么需要特别 注意的地方？A : CBA 试剂盒中所提供的标准样品是蛋白冻干粉， 由于大部份的标准样品属细胞因子类的敏感型蛋白， 在重悬标准样品成溶液或进行标准样品稀释时， 不可采用振动混匀及剧烈吹打的方式处理标准样品， 在重悬标准样品成溶液时， 在加入溶液后，只需放于室温下平衡15 分钟即可。在进行标准样品的系列稀释时，只需轻轻吹打样品数次即可 。否则，由于制成溶液后的标准样品不稳定，经剧烈混匀后易降解失活，影响实验中标准曲线的拟制。Q : 是不是每次实验都要使用一瓶新的标准品？A :不管是标准品储备液（x

8、10）或实验中的稀释液中，标准品在配成溶液后不稳定，在配制成储备液（x10）的12小时后将不能再使用。在每次实验前都要重新配置新的标准品溶 液。Q : 为什么振动混合微珠这个实验步骤如此关键？A : 在使用之前，微球必须充分的振动混合，从在微球混合液试管中加入另外一种微球之前，至微珠添加完毕后，直至在送到仪器进行上样检测之前，反应管都必须充分振动混合，这是由于充分的振动能够防止微珠聚集成团。若混合不足会导致在进行样品分析时候出现检测到很少或者没有检测到微珠的情况。 因此在使用流式细胞仪分析标准品或者样品之前，必须充分振荡混合微珠。试验管在放置到流式细胞仪上检测前需要振荡混合3-5秒钟，这样在F

9、L3通道里面能够更好的分辨出带有不同标志的微珠。Q : CBA操作实验中，哪些步骤需要避光进行为什么？A : 凡涉及含捕获微球以检测抗体的相关步骤都需避光操作。这是由于CBA技术是使用R-藻红蛋白检测样品的荧光信 号。由于使用R藻红蛋白报告系统，可使获得CBA达到最佳 敏感度的分析效果， 因此每步添加了检测试剂后都要避光反应。此外，在加入检测试剂时，除了需避光操作外，还需严格遵守试剂盒的要求规范操作（比如：精确的加液），因为添加的微珠数量不准确会改变有效捕获面积从而影响检测 的敏感性。Q : 我看不到 FL2 荧光信号或者看到的 FL2 荧光信号很弱， 怎样解决这个问题？A : 检查样品的稀释

10、度，不要随意的更改要求的孵育时间，在孵育过程中，保护样品试剂管不受到光照。Q : 实验中，在检测的时候我发现微珠聚集在一起，这是什 么原因？A : 这可能是因为样品中的细胞因子的浓度太高了。此外，在实验前， 请按试剂盒上的操作说明对流式细胞仪上各荧光补偿进行仔细调节， 以确保所使用流式细胞仪参数是对应于C B A操作的最优化设定。Q : 为什么在实验中我的实验结果背景很强/ 或者全部样品测。 如果所有样品都显示阳性或者高于标准品的最高浓度读数， 这时候请对您的样品进行进一步的稀释， 因为您的样品的浓度已高于本系统的正常检测范围。Q : 为什么在实验中会出现看到微珠碎片和没有看到微珠的 情况？A

11、 :如果在样品分析的时候在FSC/SSC勺检测图中出现碎片，上调SSC的阈值C或者同时上调 FSC和SSC勺双阈值。如果 在调整SSC的阈值以后问题依然存在，请重复样品的洗涤步骤或者再次稀释样品。Q: CBA的检测结果是否可直接与ELISA的分析结果进行对比？A：不可。因为CBA是基于荧光的报告系统实现的，虽然CBA系统相对于ELISA分析具有良好的优势，能够提供更高的敏 感性和更大的浓度检测范围。 但是两者得出的实验数据不能 够直接比较，需对CBA的数据通过和已有的ELISA数据进行校正，得到两者的相关性结果。Q : 在血清和血浆中，CBA 试剂盒所能够检测到的最低浓度是多少？A : 我们不

12、建议研究者根据标准曲线外推低于标准曲线最低值的实验报告数值。 这样的外推操作会增加结果的数学统计学上的变化程度和导致标准差值的增大。 最理想的情况是我们做标准曲线的时候增加额外的稀释浓度点（比如10, 5, ,pg/ml ） 。 当一些蛋白相对于背景（0 pg/ml） 没有信号的情况下，我们就可以在最后的样品分析中把这种蛋白排除掉。 在常规的免疫分析中， 血清和血浆中的一些细胞因子的含量低于检测的最低值以至于不能被检测到。 这是因为绝大部分的细胞因子在具有特殊的免疫活性的位点附近起作用， 它们的作用效率很高， 在许多情况下它们的半衰期很短， 而且它们在许多种类型的细胞上都起作用。 但是， 我们可以推测只有在异常的情况下， 它们在系统液体例如血清和血浆中的含量的测定值才会很高。一些作用范围很广的蛋白例如细胞催向因子、激素、生长因子等在血清和血浆中的含量很高，半衰期 很长和很容易检测到的情况