基因克隆05 基因克隆程第一章

1、基因克隆基因克隆 Gene Cloning 基 因 克 隆 第一章第一章 绪论绪论 第二章第二章 基因工程的工具酶基因工程的工具酶 第三章第三章 基因工程载体基因工程载体 第四章第四章 重组重组DNA导入受体细胞导入受体细胞 第五章第五章 目的基因的表达目的基因的表达 第六章第六章 基因文库技术基因文库技术 第七章第七章 目的基因的分离技术目的基因的分离技术 参考书 ?现代分子生物学与基因工程，李海英，现代分子生物学与基因工程，李海英，化学工业出版社化学工业出版社 基因工程原理，吴乃虎，科学出版社基因工程原理，吴乃虎，科学出版社 基因工程，楼士林，科学出版社（基因工程，楼士林，科学出版社（21

2、世世纪高等教材）纪高等教材） ?第一章第一章 绪绪 论论 一、基因工程的概念（genetic engineering) 1、基因操作、遗传工程、重组体DNA技术 2、嵌合DNA、DNA嵌合体（DNA chimera) 3、分子克隆（molecular cloning) 基因克隆 (gene cloning) 重组DNA (recombinant DNA) 4、基因工程的操作步骤 1、基因克隆的操作步骤：、基因克隆的操作步骤： 1）从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或）从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段

3、。片段。 2）在体外，将带有目的基因的外源）在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组组DNA分子。分子。 3）将重组）将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞、宿主细胞），并与之一起增殖。细胞、宿主细胞），并与之一起增殖。 4）从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组）从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。分子的受体细胞克隆。 5）从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到）从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出

4、已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用。扩增的目的基因，供进一步分析研究使用。 2、基因表达的操作步骤：、基因表达的操作步骤： 1）从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段。 2）将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。 二、基因工程发展简史 1972年年，Stanford University（ivy-covered campus)， Berg，第一个体外重组的人工，第一个体外重组的人工DNA分子（分子（EcoR ，SV40DNA，DNA） 1973年年，Cohen，完成了，完

5、成了DNADNA分子体外重组和扩增的全过分子体外重组和扩增的全过程，基因工程诞生之年，是基因工程的创始人程，基因工程诞生之年，是基因工程的创始人 Stanvard University 三、基因工程的巨大意义 （一）利用微生物制药 ?1、利用微生物生产胰岛素 2、重组微生物生产生长激素 3、重组微生物生产干扰素 利用微生物生产胰岛素 世界上有世界上有6000万糖尿病患者（胰脏产生的胰岛万糖尿病患者（胰脏产生的胰岛素不足），素不足），400万定期注射胰岛素万定期注射胰岛素 ?在美国，每年人口增长率在美国，每年人口增长率1%，糖尿病患者增，糖尿病患者增长率长率5%-6%。 ?每位患者每年需要每位患

6、者每年需要3-5kg的胰脏组织，的胰脏组织，40头牛头牛或或50头猪头猪 ?1978年，年，2000L大肠杆菌培养液获得了大肠杆菌培养液获得了100g 胰胰岛素，相当于从岛素，相当于从1t猪胰脏中提取的产量。猪胰脏中提取的产量。 ?1980年，英国伦敦年，英国伦敦17位志愿者接受了基因工程位志愿者接受了基因工程胰岛素的注射。胰岛素的注射。 ?1986年，基因工程生产的胰岛素正式进入市场年，基因工程生产的胰岛素正式进入市场 ?重组微生物生产生长激素 侏儒症 ?每个患者每年需要80个尸体的脑垂体，1%的病人能够接受治疗。 ?1979年，利用基因工程生产人生长激素 ?1987年，产品进入市场 ?19

7、98年，美国有3000名儿童接受了治疗 ? 从脑垂体细胞中分离人生长激素的 mRNA 通过逆转录酶 合成 cDNA（由于生长激素基 因前面有一段信号肽的DNA大肠杆菌不能识别，不能产生正确的有活性的生长激素） 用内切酶切去这个基因上的信号肽DNA序列 化学方法合成一段DNA 合成的基因插入到质粒中 导入大肠杆菌生产人生长激素。 重组微生物生产干扰素 1957年，被确定具有抗病毒的特性，分为三类 ?1980年，破译了干扰素的全部遗传密码，利用大肠杆菌进行生产，可以治疗肝炎和抑制肿瘤。 ?（二）克 隆 技 术 (clone technology) 克隆的概念 克隆是英文克隆是英文 “clone”的

8、音译，源于希腊文的音译，源于希腊文“klon”，原意是指植物幼苗或嫩枝以无性繁殖或营养繁殖原意是指植物幼苗或嫩枝以无性繁殖或营养繁殖的方式培育，也就是指用除种子之外的植物体的的方式培育，也就是指用除种子之外的植物体的任何一部分进行无性繁殖。任何一部分进行无性繁殖。 ?凡是没有精卵结合过程，而由同一个祖先细胞获凡是没有精卵结合过程，而由同一个祖先细胞获得的两个以上的细胞、细胞群或生物体，或是由得的两个以上的细胞、细胞群或生物体，或是由同一个亲本同一个亲本DNA序列产生子代序列产生子代DNA 的方式就是克的方式就是克隆，用这种方式分化发育得到的生物体与母体的隆，用这种方式分化发育得到的生物体与母体

9、的基因是完全相同的。基因是完全相同的。 ?克隆是指生物体通过体细胞进行的无性繁殖，以克隆是指生物体通过体细胞进行的无性繁殖，以及由无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体及由无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群。组成的种群。 ? A羊 B羊 从雌性成年绵羊 从B羊取出卵子用电击 乳腺组织抽取细胞 法将细胞核除去 殖入载有A绵羊 遗传信息的细胞核 卵子 C绵羊 遗传特性上完全 与A相同的小绵羊 “多莉” 多莉与邦尼 器官移植 1954年，肾脏移植，通过器官移植存活的患者有40万 ?1969年，黑猩猩的肝脏移植进入人的体内 ?1992年，狒狒的肝脏移植，骨髓移植 受到野生动物保护委员会的

10、指责 对猪的器官进行了基因改造，培养出带有人类基因的猪 ?干细胞研究及人类伦理观念 ?干细胞（干细胞（stem cell）是指尚未分化的细胞，存在于早期）是指尚未分化的细胞，存在于早期胚胎、骨髓、脐带、胎盘和部分成年人细胞中，具有较胚胎、骨髓、脐带、胎盘和部分成年人细胞中，具有较强的再生能力，在干细胞因子和多种白细胞介素的联合强的再生能力，在干细胞因子和多种白细胞介素的联合作用下，可被培育成肌肉、骨骼和神经等人体组织和器作用下，可被培育成肌肉、骨骼和神经等人体组织和器官。官。 胚胎干细胞（胚胎干细胞（embryo stem cell.ES）是在人胚胎发育早）是在人胚胎发育早期期囊胚（受精后约囊

11、胚（受精后约5 7天）中未分化的细胞。天）中未分化的细胞。 外表是一层扁平细胞，称滋养层，可发育成胚胎的支外表是一层扁平细胞，称滋养层，可发育成胚胎的支持组织如胎盘等。中心的腔称囊胚腔，腔内一侧的细胞持组织如胎盘等。中心的腔称囊胚腔，腔内一侧的细胞群，称内细胞群，群，称内细胞群， 外胚层将分化为皮肤、眼睛和神经系统等外胚层将分化为皮肤、眼睛和神经系统等 中胚层将形成骨骼、血液和肌肉等组织，中胚层将形成骨骼、血液和肌肉等组织， 内胚层将分化为肝、肺和肠等。内胚层将分化为肝、肺和肠等。 “人的生命何时开始？”“成为人意味着什么？”“什么是胚胎，它在什么时候变成人？” 支持者认为干细胞的研究有利治疗

12、人类的疾病，支持者认为干细胞的研究有利治疗人类的疾病，造福于人类；造福于人类； ?反对者则称这一决定将造成滥用人类胚胎、造成反对者则称这一决定将造成滥用人类胚胎、造成人类研究资源的枯竭，扼杀人类的生命；还有的人类研究资源的枯竭，扼杀人类的生命；还有的则认为应当将是否允许进行干细胞研究交给法庭则认为应当将是否允许进行干细胞研究交给法庭决断。决断。 ?（三）（三） 基因工程育种基因工程育种 ?1、基因改造的农作物 ?2、转基因动物 基因改造的农作物基因改造的农作物 转基因植物的概念：转基因植物的概念： 在一个植物细胞中采用在一个植物细胞中采用微注射法、基因枪法以微注射法、基因枪法以及农杆菌介导的转

13、化方及农杆菌介导的转化方法导入新的基因，再分法导入新的基因，再分化成为遗传改变的个体，化成为遗传改变的个体，就能获得我们想要的新就能获得我们想要的新品种，也就是转基因植品种，也就是转基因植物。物。 转基因抗虫作物 ?转基因抗病毒作物 ?转基因抗除草剂作物 ?抗不良环境和抗衰老的转基因作物 ?改善农作物的品质 ?转基因抗虫作物 ?转基因抗虫作物的优点： DDT滴滴涕：二氯二苯三氯乙烷 1、成本较低，持续抗性 2、保护作用遍及全株 3、安全、可靠 4、具有高度特异性 转原毒素基因Bt的棉花 转基因抗除草剂作物 抗早熟的转基因番茄 ?多聚半乳糖醛酸酶多聚半乳糖醛酸酶（）（） 可以消化可以消化番茄细胞

14、壁的果胶，番茄细胞壁的果胶，引起番茄成熟、腐引起番茄成熟、腐烂。将编码此酶基烂。将编码此酶基因的反义基因转入因的反义基因转入植物中，反义植物中，反义mRNA与正义与正义mRNA分子结合，分子结合，PG不能产生，延迟不能产生，延迟果实的成熟过程。果实的成熟过程。 抗冻的转基因大豆 提高淀粉含量的转基因马铃薯 2、转基因动物 步骤：步骤： 1、将克隆的外源基因注射到一个受精卵的细胞、将克隆的外源基因注射到一个受精卵的细胞核中；核中； 2、接种后的受精卵移植到雌性受体的子宫，使、接种后的受精卵移植到雌性受体的子宫，使其顺利完成胚胎发育；其顺利完成胚胎发育； 3、移植后的受精卵发育生长为后代；、移植后的受精卵发育生长为后代； 4、利用这些能产生外源蛋白的动物作为种畜或、利用这些能产生外源蛋白的动物作为种畜或种禽，培育新的纯合系。种禽，培育新的纯合系。 转基因动物 四、基因工程的安全性问题 逃逸 GMO的安全性 GMO的安全性 GMO： Genetic Modification Organism ?1、转基因食品有毒性吗？、转基因食品有毒性吗？ 美国食品和药物