MSI诊断检测的方法和应用ppt课件

1、ppt课件课件.MSI诊断检测的方法和应用诊断检测的方法和应用ppt课件课件.主主 要要 内内 容容 微卫星不稳定的相关背景微卫星不稳定的相关背景MSI的检测意义的检测意义MSI检测方法检测方法MSI检测试剂盒检测试剂盒ppt课件课件.背背 景景 介介 绍绍 微卫星不稳定性微卫星不稳定性(microsatellite instability, (microsatellite instability, MSI)MSI)是指与正常组织相比，在肿瘤中某一微卫星由于重复是指与正常组织相比，在肿瘤中某一微卫星由于重复单位的插入或缺失而造成的微卫星长度的任何改变，出现单位的插入或缺失而造成的微卫星长度的任

2、何改变，出现新的微卫星等位基因现象。新的微卫星等位基因现象。 主要机制：主要机制： DNADNA多聚酶的滑动导致重复序列中多聚酶的滑动导致重复序列中1 1个或多个碱基的个或多个碱基的错配错配 MSMS同源重组导致碱基对的丢失和插入同源重组导致碱基对的丢失和插入ppt课件课件. 19931993年，年，AltonenAltonen等首次发现，在等首次发现，在HNPCCHNPCC细胞中存在高频率细胞中存在高频率的的MSIMSI。目前已发现。目前已发现MSIMSI的肿瘤主要有的肿瘤主要有3 3类：类： 一类为一类为HNPCCHNPCC病人发生的结直肠癌、子宫内膜癌以及卵巢病人发生的结直肠癌、子宫内膜

3、癌以及卵巢癌癌, ,这一类肿瘤几乎都表现为这一类肿瘤几乎都表现为MSIMSI； 另一类为散发性结直肠癌另一类为散发性结直肠癌, ,这一类肿瘤发生这一类肿瘤发生MSIMSI概率约概率约15 30； 第三类为包括肺癌、乳腺癌和胰腺癌在内的其它肿瘤第三类为包括肺癌、乳腺癌和胰腺癌在内的其它肿瘤, ,这这一类肿瘤一类肿瘤MSIMSI发生频率相对较低。发生频率相对较低。背背 景景 介介 绍绍ppt课件课件.结直肠癌是是常见的消化道恶性肿瘤，我们每结直肠癌是是常见的消化道恶性肿瘤，我们每年有年有1313万万-16-16万人罹患结直肠癌，其发病率占肿瘤万人罹患结直肠癌，其发病率占肿瘤发病率的第三位，仅次于肺

4、癌和胃癌。发病率的第三位，仅次于肺癌和胃癌。 HNPCCHNPCC是常见的遗传性肿瘤综合症，遗传性结是常见的遗传性肿瘤综合症，遗传性结直肠癌是一个常染色体遗传疾病直肠癌是一个常染色体遗传疾病, ,目前研究表明微目前研究表明微卫星不稳定性可能是遗传性结直肠癌发生的重要卫星不稳定性可能是遗传性结直肠癌发生的重要机制。机制。背背 景景 介介 绍绍ppt课件课件.具有具有MSI的散发性结直肠癌的散发性结直肠癌,具有不同的临床病理、具有不同的临床病理、分子生物学特征分子生物学特征,表现为表现为:发病年龄较小；对某些化疗发病年龄较小；对某些化疗药物药物(如如5-FU、顺铂等、顺铂等)有原发性耐药有原发性耐

5、药; 生物学行为较生物学行为较好。好。MSI-H是是期结肠癌预后良好的一个标志物，也期结肠癌预后良好的一个标志物，也是患者不能从氟尿嘧啶单药辅助化疗获益的疗效预是患者不能从氟尿嘧啶单药辅助化疗获益的疗效预测指标。测指标。背背 景景 介介 绍绍ppt课件课件.微卫星不稳定检测的意义微卫星不稳定检测的意义1. 1. 检测检测MSIMSI可以用于检测是否为可以用于检测是否为LynchLynch综合征综合征结直肠癌的遗传易感性包括一些研究较清楚的遗传性结直肠癌的遗传易感性包括一些研究较清楚的遗传性综合征，例如综合征，例如LynchLynch综合征（又称之为遗传性非息肉病综合征（又称之为遗传性非息肉病性

6、结直肠癌，性结直肠癌，HNPCCHNPCC）和家族性息肉病（）和家族性息肉病（FAPFAP）。）。在在HNPCC HNPCC 和散发性直肠癌中的微卫星不稳定性是遍布整和散发性直肠癌中的微卫星不稳定性是遍布整个基因组的现象，并且可能是导致癌症发生的普遍机个基因组的现象，并且可能是导致癌症发生的普遍机制。制。 ppt课件课件. 专家组推荐，专家组推荐， MMRMMR蛋白检测应强烈建议在所蛋白检测应强烈建议在所有有5050岁以下的结肠癌患者中开展，原因在于该岁以下的结肠癌患者中开展，原因在于该群体中患群体中患LynchLynch综合征的可能性增加。而且，在综合征的可能性增加。而且，在一些中心，现在对

7、所有的结直肠肿瘤组织进行一些中心，现在对所有的结直肠肿瘤组织进行免疫组化检测（有时分析免疫组化检测（有时分析MSIMSI）以来决定哪些患）以来决定哪些患者需要进行者需要进行LynchLynch综合征相关的基因检测综合征相关的基因检测. .微卫星不稳定检测的意微卫星不稳定检测的意义义ppt课件课件. 2. 检测检测MSI可以用于判断患者预后可以用于判断患者预后高危高危期患者，定义为预后较差者，包括：期患者，定义为预后较差者，包括：T4（B、C期）、组织学分化差（期）、组织学分化差（3/4级，不包级，不包括括MSI-H者），已经有大量证据表明者），已经有大量证据表明MMR蛋白蛋白表达缺失或表达缺失

8、或MSI-H是是期结肠癌预后良好的一个期结肠癌预后良好的一个标志物。具有标志物。具有MSI-H肿瘤的肿瘤的期结肠癌患者，期结肠癌患者，3/4级分化（低分化）不再认为是高危因素。级分化（低分化）不再认为是高危因素。微卫星不稳定检测的意义微卫星不稳定检测的意义ppt课件课件.3. 3. 检测检测MSIMSI以判断是否需要辅助化疗以判断是否需要辅助化疗对于对于期结肠癌是否需要辅助化疗，在做临床决期结肠癌是否需要辅助化疗，在做临床决策时需要考量的一个重要信息就是微卫星不稳定策时需要考量的一个重要信息就是微卫星不稳定性（性（MSIMSI）。）。研究认为研究认为MMR MMR 基因为基因为MSI-HMSI

9、-H（高度微卫星不稳定）（高度微卫星不稳定）会对顺铂、卡培他滨及会对顺铂、卡培他滨及5-FU 5-FU 产生耐药性，相反产生耐药性，相反MSI-LMSI-L、MSS MSS 的患者不会产生耐药。的患者不会产生耐药。微卫星不稳定检测的意义微卫星不稳定检测的意义ppt课件课件. 一项研究长期随访了一项研究长期随访了/期结肠癌期结肠癌患者后发现，患者后发现，MSI-LMSI-L或或MSSMSS者通过者通过5-FU5-FU辅助辅助化疗确实改善了预后；然而，化疗确实改善了预后；然而，MSI-HMSI-H者却者却不能从术后不能从术后5-FU5-FU辅助化疗中显著获益，与辅助化疗中显著获益，与单纯手术相比，

10、单纯手术相比，5-5-年生存率反而更低。年生存率反而更低。微卫星不稳定检测的意义微卫星不稳定检测的意义ppt课件课件MSI 检检 测测 方方 法法1. 免疫组化方法免疫组化方法(IHC) 免疫组化方法仅用于与肿瘤细胞中的免疫组化方法仅用于与肿瘤细胞中的MLH1, MSH2, MSH6和和PMS2蛋白结蛋白结合。如果没有结合任何的蛋白，就证明发生了合。如果没有结合任何的蛋白，就证明发生了MSI。2. 直接测序法直接测序法 对对MMR基因各区域（基因各区域（MLH1、MSH2、MSH6等）的扩增产物直接测序。等）的扩增产物直接测序。3. 多重荧光多重荧光PCR 采用多重荧光采用多重荧光PCR的方法

11、对的方法对NCI建议的位点进行扩增，以确定建议的位点进行扩增，以确定MSI状态。状态。ppt课件课件.检检 测测 MSI 方方 法法 比比 较较 方法方法灵敏度灵敏度特异特异性性重现重现性性时间时间成本成本操作操作IHC90%低低低低3-5天天5001000复杂复杂直接测序直接测序法法80100%高高高高5-7天天10002000 简便简便多重荧光多重荧光PCR100%高高高高2-3天天5001000 简便简便ppt课件课件.Microread MSI 检检 测测 试试 剂剂 盒盒 阅微基因根据阅微基因根据NCCNNCCN指南，针对结直肠癌基因诊断领域研发了指南，针对结直肠癌基因诊断领域研发了

12、MSIMSI检测检测的试剂盒。的试剂盒。 微卫星不稳定（微卫星不稳定（microsatellite instabilitymicrosatellite instability，MSIMSI）检测试剂盒）检测试剂盒是一款以多重荧光是一款以多重荧光PCRPCR技术为基础的基因突变检测系统，一次扩增检技术为基础的基因突变检测系统，一次扩增检测测6 6个个MSIMSI位点，操作简便、快速。位点，操作简便、快速。ppt课件课件.扩扩 增增 检检 测测 位位 点点位点位点GenBankNumber重复序列重复序列产物范围产物范围1标记荧光类型标记荧光类型NR-27AF070674(A)2770-91HEX

13、NR-21XM_033393(A)2192-113FAMBAT-26U41210(A)26160-185FAMBAT-25L04143(A)25105-125HEXNR-24X60152(A)24119-139TMRMONO-27AC007684(A)27155-177TMRPenta CAL138752(AAAAG)3-15190-250FAMPenta DAC000014(AAAAG)2-17151-224HEXAmel-107/113TMRppt课件课件.MSI 检检 测测 送送 样样 要要 求求 若客户提供石蜡切片，则要求厚度若客户提供石蜡切片，则要求厚度5-20m的石蜡切片（切片的石

14、蜡切片（切片中确保含有中确保含有9mm2以上大小的组织块）以上大小的组织块）10片或以上，注明石蜡片或以上，注明石蜡包埋组织的保存年限，组织类型和包埋前处理方式等。包埋组织的保存年限，组织类型和包埋前处理方式等。若客户提供若客户提供DNA样品，则从新鲜组织提取的样品，则从新鲜组织提取的DNA最佳，最佳，20ng/l以上的以上的DNA 20l即可（需提供即可（需提供DNA浓度）；若为石蜡浓度）；若为石蜡包埋组织提取的包埋组织提取的DNA，除了提供，除了提供DNA的浓度（的浓度（20ng/l以上的以上的DNA至少至少20l）外，还需提供琼脂糖凝胶电泳图）外，还需提供琼脂糖凝胶电泳图ppt课件课件.

15、MSI 检检 测测 试试 剂剂 盒盒 使使 用用 方方 法法 DNA提取：根据样本不同，采用二甲苯或提取：根据样本不同，采用二甲苯或Chelex 100的方法提取的方法提取DNA； PCR扩增：扩增： 毛细管电泳检测：按照毛细管电泳检测：按照（0.5lROX500）样品数样品数+（8.5l甲酰甲酰胺）胺）样品数样品数制备好样品，制备好样品，RUN 3130 xl遗传分析仪。遗传分析仪。组分组分20 l体系体系(l)Master Mix无核酸酶超纯水无核酸酶超纯水6.02.5PCR Mix8.05MSI引物混合引物混合物物4.0模板模板DNA2.0反应总体积反应总体积20.0ppt课件课件.操操

16、 作作 流流 程程 示示 意意 图图ppt课件课件.数数 据据 分分 析析n 目的峰：目的峰：A. 单核苷酸标记的位点单核苷酸标记的位点NR21、Bat26、NR27、Bat25、NR24、Mono27的峰型均为类似五指的手掌峰，见图的峰型均为类似五指的手掌峰，见图2； 图图2 单核苷酸标记位点峰型示意图单核苷酸标记位点峰型示意图ppt课件课件.B. 五核苷酸重复的位点五核苷酸重复的位点Penta C、Penta D和性别位点和性别位点Amelogenin的峰型均为单峰型，见图的峰型均为单峰型，见图3。 图图3 五核苷酸标记和性别位点峰型示意图五核苷酸标记和性别位点峰型示意图n 非目的峰：非目

17、的峰：pull-up峰、峰、stutter峰、染料峰、加峰、染料峰、加A不完全峰等。不完全峰等。数数 据据 分分 析析ppt课件课件.MSI 判判 定定 结结 果果微卫星不稳定MSI-H型 根据根据NCI建议，与正常样本比较，有建议，与正常样本比较，有2个发生改变可称定为个发生改变可称定为MSI-H型，型，只有只有1个出现不稳定的为个出现不稳定的为MSI-L型，没有出现突变的情况为型，没有出现突变的情况为MSS型。型。ppt课件课件.微卫星不稳定MSI-L型MSI 判判 定定 结结 果果ppt课件课件.微卫星稳定MSS型MSI 判判 定定 结结 果果ppt课件课件.MSI 检检 测测 试试 剂

18、剂 盒盒 优优 点点 基于基于MSIMSI的的NCI panelNCI panel标准开发了适合中国人群的标准开发了适合中国人群的MSIMSI检测系统；检测系统； 采用多重荧光采用多重荧光PCRPCR技术，一次扩增和检测技术，一次扩增和检测6 6个准单态性单核苷酸个准单态性单核苷酸微卫星基因座，其中微卫星基因座，其中5 5个与国外检测相吻合，另外增加了一个适合个与国外检测相吻合，另外增加了一个适合中国人群的位点；中国人群的位点； 基于测序仪的基因分型研究领域拥有多年的经验和多项成果，基于测序仪的基因分型研究领域拥有多年的经验和多项成果，已经做了超过已经做了超过10001000例病例样本，积累了

19、丰富的经验和数据基础。例病例样本，积累了丰富的经验和数据基础。ppt课件课件.MSI 检检 测测 案案 例例XBH-XXBH-1* 接收委托方两份样本，正常组织接收委托方两份样本，正常组织XBH-X和肿瘤组织和肿瘤组织XBH-1，要求鉴定肿瘤组织的，要求鉴定肿瘤组织的MSI状态，状态，正常对照样本分型正确，肿瘤组织样品在正常对照样本分型正确，肿瘤组织样品在BAT-26、NR-27、BAT-25、NR-24和和MONO-27等等5个位点出现双峰。该肿瘤组织为个位点出现双峰。该肿瘤组织为MSI-H型。型。ppt课件课件.13MS6E13MS6C* 接收委托方两份检材，分别为肿瘤组织接收委托方两份检材，分别为肿瘤组织13MS6C和正常组织和正常组织13MS6E，要求检测该肿瘤组，要求检测该肿瘤组织的织的MSI状态，状态，6个单核苷酸位点均未出现个单核苷酸位点均未出现MSI，鉴定结果为，鉴定结果为MSS稳定状态。稳定状态。MSI 检检 测测 案案 例例ppt课件课件.阅阅 微微 基基 因因 诊诊 断断 试试 剂剂 简简 介介n 脆