基因工程的基本操作程序-课件

1、专题1 基因工程1.DNA的分子结构基本组成元素：C H O N P基本组成物质：基本结构单位：4种脱氧核糖核苷酸脱氧核糖 + 含氮碱基 + 磷酸一级结构：脱氧核苷酸链空间结构：DNA双螺旋结构 DNA分子的结构腺嘌呤脱氧核糖核苷酸（A）鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸（G）胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸（T）胞嘧啶脱氧核糖核苷酸（C）2.DNA双螺旋结构特点一个DNA含有两条多核苷酸链，多核苷酸链是由很多个核苷酸聚合而成；两条多核苷酸链反向平行；脱氧核糖与磷酸交替连接，形成DNA分子多核苷酸链的骨架，排列在外侧，碱基排列在内测；DNA分子两条链上的碱基，遵循一定的规律形成碱基对，碱基对之间通过氢键连接。AGCT

2、DNA分子的平面结构分子的平面结构氢键ATGCAATTGCCTTAAG基础知识梳理基础知识梳理一、基因的概念、载体及功能一、基因的概念、载体及功能基础知识梳理基础知识梳理3染色体、染色体、DNA、基因的数目关系、基因的数目关系(1)一般来说，每条染色体上含一个一般来说，每条染色体上含一个DNA分子。分子。(2)每个每个DNA分子上有很多个基因。分子上有很多个基因。(3)每个基因中又含有成百上千每个基因中又含有成百上千个个 。脱氧核苷酸脱氧核苷酸一、有关概念间的相互关系一、有关概念间的相互关系1脱氧核苷酸、基因、脱氧核苷酸、基因、DNA、染色、染色体之间的关系体之间的关系基础知识梳理基础知识梳理

3、二、基因控制蛋白质的合成二、基因控制蛋白质的合成1合成过程合成过程一、基因工程诞生的基础一、基因工程诞生的基础2020世纪中叶，世纪中叶，基础理论基础理论取得了重大突破取得了重大突破1.DNA1.DNA是遗传物质的证明是遗传物质的证明2.DNA2.DNA双螺旋结构和中心法则的确立双螺旋结构和中心法则的确立3.3.遗传密码的破译遗传密码的破译技术发明使基因工程的实施成为可能：技术发明使基因工程的实施成为可能：1.1.基因转移载体的发现基因转移载体的发现 2.2.工具酶的发现工具酶的发现3.DNA3.DNA合成和测序技术的发明合成和测序技术的发明4.DNA4.DNA体外重组的实现体外重组的实现 5

4、.5.重组重组DNADNA表达实验的成功表达实验的成功6.6.第一例转基因动物问世第一例转基因动物问世 7.PCR7.PCR技术的发明技术的发明基础知识梳理基础知识梳理四、中心法则四、中心法则 基因工程又叫基因拼接技术或基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。该技术是在生重组技术。该技术是在生物体外，通过对物体外，通过对DNA分子进行人工分子进行人工“剪切剪切”和和“拼接拼接”，对生物，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的生物类型和使重组基因在受体细胞内表达，产

5、生出人类所需要的生物类型和生物产品。生物产品。二、基因工程的概念二、基因工程的概念基因工程的别名基因工程的别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程基本过程实质实质结果结果基因拼接技术或基因拼接技术或DNADNA重组技术重组技术生物体外生物体外基因基因DNADNA分子水平分子水平人类需要的生物类型和生物产品人类需要的生物类型和生物产品剪切剪切 拼接拼接 导入导入 表达表达基因重组基因重组基本工具：限制性核酸内切酶“分子手术刀”DNADNA连接酶“分子缝合针”基因进入受体细胞的载体“分子运输车”三、三、 DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具当限制酶从识别序列的中心轴

6、线处切开时，产生的是平末端。当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，产生的是黏性末端。识别双链DNADNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。( (6 6个, ,4 4、5 5、8 8个) )主要是从微生物中分离纯化出来的一种酶。40004000种。 （1 1）来源： （2 2）种类： （3 3）作用：（4 4）结果： 形成两种末端黏性末端平末端限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”（小结）（小结） 要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端，两

7、个（首尾）。要切两个切口，产生四个黏性末端，两个（首尾）。 如果把两种来源不同的DNADNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？ 会产生相同的黏性末端。会产生相同的黏性末端。 是不是把两者的黏性末端黏合起来，这样就真的合成 重组的DNADNA分子了? ? 实际还不够实际还不够, ,还需要还需要DNADNA连接酶进行连接。连接酶进行连接。思考题：思考题：1、种类：2、作用部位：Ecoli DNA连接酶（黏性末端）T4 DNA连接酶 （黏性末端和平末端）磷酸二酯键 DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一起来，即把梯子两边扶

8、手的断口连接起来，这样一个重组的个重组的DNA分子就形成了。分子就形成了。2.DNA2.DNA连接酶“分子缝合针”AATTGCCTTAAG3.3.基因进入受体细胞的运载体“分子运输车”（1 1）运载体的作用u作为运载工具，将外源基因( (抗虫基因) )转移到受体细胞( (棉花细胞) )中去。u利用运载体在受体细胞( (棉花细胞) )内，对外源基因( (抗虫基因) )进行大量复制。（随载体的复制而复制）（2）作为运载体必须具备的条件）作为运载体必须具备的条件u 能够在宿主细胞中自我复制并稳定地保存。能够在宿主细胞中自我复制并稳定地保存。u 具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。具有一个或

9、多个限制酶切点，以便与外源基因连接。u 具有某些标记基因，便于进行筛选。具有某些标记基因，便于进行筛选。u 必需是安全的，不会对受体必需是安全的，不会对受体 细胞有害。细胞有害。u 大小应适合，便于提取和操作大小应适合，便于提取和操作（3）常用的运载体）常用的运载体 基因进入受体细胞的运载体“分子运输车”u细菌细胞质的质粒u噬菌体的衍生物u动植物病毒注意：真正用作运载体的质粒都是人工改造过的。 最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，其中常含有抗药基因，如四环素的如四环素的标记基因。标记基因。质粒的存在与否对宿主质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用

10、，但复制细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内成。只能在宿主细胞内成。质粒是质粒是一种裸露的、结构简单、独一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核立于细菌拟核DNADNA之外，之外，并且具有自我复制能力的双链环状并且具有自我复制能力的双链环状DNADNA分子。分子。质粒是基因工程最常用的运载体。质粒是基因工程最常用的运载体。四、基因工程基本操作的四个步骤四、基因工程基本操作的四个步骤1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定目的基因的获取目的基因

11、的获取1 1、目的基因主要是指、目的基因主要是指_编码蛋白质的结构基因，是人们所需要转移编码蛋白质的结构基因，是人们所需要转移或改造的基因。或改造的基因。2 2、获取目的基因的常用方法有哪些、获取目的基因的常用方法有哪些? ?（1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增（3 3）人工合成）人工合成请阅读请阅读P9P9第一和二两段第一和二两段（一）从基因文库中获取目的基因（一）从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库基因文库 基因组文库部分基因文库（如

12、:cDNA文库）基因文库基因文库基因组基因组文库与文库与部分基部分基因文库因文库的关系的关系怎样从基因文库中得怎样从基因文库中得到我们所需的目的基到我们所需的目的基因呢因呢? ?基因文库的构建方法基因文库的构建方法鸟枪法：鸟枪法：供体细胞中的供体细胞中的DNADNA许多许多DNADNA片段片段运载体运载体限制酶限制酶与载体连接与载体连接载入载入受体细胞受体细胞产生特定性状产生特定性状导入导入外源外源DNADNA扩增扩增目的基因目的基因分离分离( (直接分离法直接分离法) )反转录法：反转录法： 以目的基因转录成以目的基因转录成的信使的信使RNARNA为模板，反为模板，反转录成互补的单链转录成互

13、补的单链DNADNA，然后在酶的作用下合成然后在酶的作用下合成双链双链DNADNA，从而获得所，从而获得所需的基因。需的基因。目的基因的目的基因的mRNAmRNA单链单链DNADNA反转录酶反转录酶DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNADNA( (目的基因目的基因) )根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNADNA法法 ： 根据已知蛋白质根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测的氨基酸序列，推测出相应的信使出相应的信使RNARNA序序列，然后按照碱基互列，然后按照碱基互补配对原则，推测出补配对原则，推测出它的结构基因的核苷它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学酸序列，再通过化学方法，以单核

14、苷酸为方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点优点缺点缺点鸟枪法鸟枪法反转录法反转录法根据已知氨基根据已知氨基酸合成酸合成DNADNA法法操作简便操作简便广泛使用广泛使用工作量大，盲目，工作量大，盲目，分离出来的有时并分离出来的有时并非一个基因非一个基因专一性强专一性强操作过程麻烦，操作过程麻烦，mRNAmRNA很不稳定，要很不稳定，要求的

15、技术条件较高求的技术条件较高专一性最强专一性最强仅限于合成核苷酸仅限于合成核苷酸对较少的简单基因对较少的简单基因 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、 _ _、_ _ 、 _._.原理：原理：_方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增为扩增循循 环的次数）环的次数）结果：结果：聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使

16、目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增( (二二) )利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因过程：过程：a a、DNADNA变性（变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火（、退火（复性55-6555-65）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物与物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端端延伸，合成与模板互补延伸，合成

17、与模板互补 的的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链1.1.用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。2.2.用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。基因表达载体的构建基因表达载体的构建 核心3.3.将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_ _处，处， 再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNA DNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同质粒质粒DNAD

18、NA分子分子限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种4.4.过程过程: :5.5.基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：复制原点复制原点+ +目的基因目的基因+ +启动子启动子+ +终止子终止子+ +标记基因标记基因基因表达载体的构建基因表达载体的构建基因工程的核心基因工程的核心目的：所需物质：使目的基因在受体细胞中稳定存在，使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。基

19、因能够表达和发挥作用。它们各自的作用是什么?启动子启动子+ +目的基因目的基因+ +终止子终止子+ +标记基因标记基因将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞转化转化 方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法、

20、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法（1 1）农杆菌介绍：）农杆菌介绍：（2 2）原理及适用范围）原理及适用范围2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法）方法：显微注射法（2）程序：）程序：3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞（1）原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少）原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少（2）方法：）方法： 目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 新性状动物用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检查是否成功

21、检查是否成功检测检测鉴定鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）（注意与上不同之处）抗原抗体杂交抗原抗体杂交DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互

22、补子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。列的部位，仍然是两条游离的单链。 P P1515思考与探究思考与探究一、基因工程诞生的基础一、基因工程诞生的基础2020世纪中叶，世纪中叶，基础理论基础理论取得了重大突破取得了重大突破1.DNA1.DNA是遗传物质的证明是遗传物质的证明2.DNA2.DNA双螺旋结构和中心法则的确立双螺旋结构和中心法则的确立3.3.遗传密码的破译遗传密码的破译识别双链DNADNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。( (6 6个, ,4 4、5 5、8 8个) )主要是从微生物中分离纯化出来的一种酶。40004000种。 （1 1）来源： （2 2）种类： （3 3）作用：（4 4）结果： 形成两种末端黏性末端平末端限制性核酸内切酶限制