共聚焦显微镜 汇报模板

1、激光扫描共焦显微镜技术及应用激光扫描共焦显微镜技术及应用 The techniques and application of Confocal Laser Scanning Microscopy 汇报人：张杰 2015年3月16日 基本介绍基本介绍 ?中文名称：中文名称： ?英文名称：英文名称： ?定义：定义： 激光扫描共聚焦显微镜 Confocal Laser Scanning Microscopy;CLSM 利用激光点作为荧光的激发光并通过扫描装置对标本进行连续扫描，并通过空间共轭光阑（针孔）阻挡离焦平面光线而成像的一种显微镜。是当今世界最先进的细胞生物学分析仪器。 细胞生物学（一级学科）

2、；细胞生物学技术（二级学科） ?应用学科：应用学科： 共聚焦显微镜的原理简介 （ Confocal Laser Scan Microscope CLSM） 从某种意义上讲，共聚焦显微镜从某种意义上讲，共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜，它对传是一种现代化的光学显微镜，它对传统的光镜从以下几方面作了改进统的光镜从以下几方面作了改进 原理简介原理简介 ?在显微镜基础上配置激光光源激光光源，扫扫描装置描装置，共扼聚焦装置共扼聚焦装置和检测系统检测系统而形成的新型显微镜。 ? 利用共聚焦光路和激光扫描获得生物样品的显微断层图象，动态扫描记录、图像处理及三维立体构建、成份分析等软件。 激光共聚焦显微镜

3、构成激光共聚焦显微镜构成 显微镜 步近器 激光器 计算机 光电倍增管 电子图像 检测器 软件 共聚焦显微镜的特点共聚焦显微镜的特点 光源 ?共聚焦技术 ?点扫描技术 ?信号放大 电子图像 ?软件 ? 1 1、光源、光源 用激光做光源，从理论上消除了色差。因为激光的单色性强、光源波束集中、波长相同。 2 2、采用了共扼聚焦技术、采用了共扼聚焦技术 在物镜的焦平面上放置了一个小孔，将焦平面以外的杂散光挡住，消除了球差。 共扼聚焦原理图共扼聚焦原理图 样品 入射光 发射光 滤光片 激光器 扩光器 长通滤光片 针孔 检测器 样品 入射光 发射光 滤光片 激光器 扩光器 长通滤光片 针孔 检测器 样品

4、入射光 发射光 滤光片 激光器 扩光器 长通滤光片 针孔 检测器 普通光学显微镜与激光共聚焦显微镜的区别普通光学显微镜与激光共聚焦显微镜的区别 3、点与面扫描技术 共聚焦显微镜：将样品分解成二维或三共聚焦显微镜：将样品分解成二维或三维空间上的无数点，用十分细小的激光束维空间上的无数点，用十分细小的激光束（点光源）（点光源）逐点逐行扫瞄、成像逐点逐行扫瞄、成像，通过计，通过计算机软件组合，最后得到一个整体平面的算机软件组合，最后得到一个整体平面的或立体的像。或立体的像。 普通光镜：是在可见光源下一次性成像。普通光镜：是在可见光源下一次性成像。 4 4、图像信号及处理：、图像信号及处理： 光电倍增

5、管放大信号，计光电倍增管放大信号，计算机采集和处理光信号。算机采集和处理光信号。 计算机代替了人眼或照相计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像，得到的图机进行观察、摄像，得到的图象是数字化的，可以在电脑中象是数字化的，可以在电脑中进行处理，再一次提高图象的进行处理，再一次提高图象的清晰度。清晰度。 共聚焦显微镜的应用 1)2)3)4)5)6)7)高清晰成像 半定量荧光强度分析 荧光探针表达量测定 分层扫描 多种荧光标记同时检测 荧光标记物绝对定量分析 扩展应用 高清晰成像 ? 激光共聚焦显微镜因使用共扼光路使非焦平面的光线被抑制，减少了成像的干扰，以及使用光色较纯的激光，所以成像分辨率可达普通

6、光学显微镜的1.4倍。 ? 可以清晰的表现某些细微结构。 人眼分辨率：人眼分辨率： 0.2mm 0.2mm 光学显微镜分辨率：光学显微镜分辨率：0.25mm 0.25mm 电子显微镜分辨率：电子显微镜分辨率：0.2nm 0.2nm 共焦显微镜分辨率：共焦显微镜分辨率：0.18mm 0.18mm 高清晰成像高清晰成像 牛肺动脉内皮细胞 ，微管 高清晰成像高清晰成像 牛肺动脉内皮细胞 ，微管 高清晰成像高清晰成像 鼠成纤维细胞 单克隆anti -tubulin 标记 高清晰成像高清晰成像 检测人类癌细胞表皮生长因子 高清晰成像高清晰成像 培养的293细胞绿色荧光蛋白 高清晰成像高清晰成像 培养的人

7、肝癌细胞哑叮橙染色 透射光扫描（DIC） 利用激光透射扫描成像，用特殊滤光片达到相差显微镜的效果，可获得清晰的具有立体感的图片 树突状细胞树突状细胞 培养细胞培养细胞 荧光表达量测定 Sunil S et al., Extracellular polymeric substances and structural stability of aerobic granule, Water Research, 42(2008)16441650 分层扫描（切片扫描） ?按共扼聚焦的原理，通过调节针孔的大小，可控制样品扫描层面的厚度。即样品中相当薄的一层被探测到，而其他层面不影响成像。 分层扫描（切片扫

8、描） ?当观测较厚样品时，普通透射光不能透过样品，则可以通过切片扫描检测荧光的方法来观测。 入射光 发射光 被检测层面 整个样品 白光（不能透过） 分层扫描（切片扫描） 较厚层面 较薄层面 人血管内皮细胞PI标记观测损伤。标记细胞为损伤细胞。 分层扫描（切片扫描） 较厚层面 （平滑肌损伤可见） 较薄层面 兔动脉血管内皮细胞PI标记观测损伤。标记细胞为损伤细胞。 分层扫描（切片扫描） ?连续分层扫描，可得到CT片类似的效果，对样品Z轴的结构进行分析。经计算机数据重组，可观测空间结构，空间定位，三维重组。 ?利用专用图象处理软件图象处理软件，还可以实现其他许多数据分析。 植物切片三维重建 多色荧光

9、标记检测 普通荧光显微镜每次只能观测一种荧光，要观测多种荧光标记的样品需要多次观测，对样品损伤大。激光共聚焦显微镜可以多激光多通道同时扫描，多通道同时探测。 Mouse 3T3 cells 红色：ethidium homodimer1 ，染核 绿色：BODIPY FL phallacidin，染肌丝蛋白 牛肺动脉内皮细胞 蓝色：Hoechst 33342 染DNA 红色：PI，染核仁RNA 绿色：Alexa Fluor 488 染肌丝蛋白 藤黄微球菌 绿色：活菌 红色：死菌 染色：LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit DNA RNA 猴胚肾细胞内

10、弓形虫繁殖 吖叮橙染色绿色为红色为激光共聚焦显微镜的优势 在结构方面在结构方面 ?激光做光源，光色纯，波长固定，成像?效果好，分辨率高，图象清晰，荧光检测信噪比高 可实现分层扫描 可实现连续扫描，可动态记录变化 可多根激光管同时扫描，多色荧光同时成像 扫描速度快，对样品损伤小 激光共聚焦显微镜的优势 在应用方面在应用方面 ?形态观察-高清晰成像 ?半定量-荧光强度分析 ?荧光探针表达量测定 ?定位研究-分层扫描 ?多种荧光标记同时检测 ?荧光标记物绝对定量分析 ?扩展应用-如，FRAP法、细胞切割、细胞筛选等 激光共聚焦显微镜的优势 ?在效果方面 更灵敏： 共聚焦显微镜采用了光电倍增技术，可将

11、很微弱共聚焦显微镜采用了光电倍增技术，可将很微弱的荧光信号放大。只要有信号就能被检测到。的荧光信号放大。只要有信号就能被检测到。 定位更精确： 不仅可以定位到细胞水平，还可以定位到亚细胞不仅可以定位到细胞水平，还可以定位到亚细胞水平、和分子水平。这也是荧光标记的抗体被称为水平、和分子水平。这也是荧光标记的抗体被称为分子探针的原因分子探针的原因 激光共聚焦显微镜的优势 在效果方面 定量测量： 静态的定量测量静态的定量测量 对于不同组的样品，可以单纯比较一种成分，也可以同时比较两种甚至三种成分。也可以在同一张切片上比较不同成分含量。 动态的定量测量动态的定量测量 共聚焦显微镜还能对活细胞内的特定成

12、分活细胞内的特定成分（如：钙、钠、氢等）进行动态变化测量，并给出动态变化曲线；还可以同时测量几种成分，并给出含量比值。 激光共聚焦显微镜的优势 在效果方面 快速性：快速性： 由于利用光源光束点扫描，检测过程快，时间短，计算机精确控制激发光强度，光漂白和荧光淬灭作用很小。 数据图像可及时输出或长期储存：数据图像可及时输出或长期储存： 用计算机代替了普通的照相机，得到的图像是数字化的，不存在暴光方面及胶卷冲洗方面的问题（如荧光太弱，无法暴光；或曝光过程中荧光淬灭等）；而且图像可进一步加工处理。 共聚焦显微镜应用领域 ? （一）细胞生物学： 细胞结构：细胞骨架，细胞膜结构、流动性、受体，细胞器结构和

13、分布变化，细胞凋亡、细胞周期等。 ? （二）生物化学： 酶、核酸、荧光原位杂交、受体分析。 ? （三）药理学： 药物对细胞的作用及其动力学分析。 ? （四）生理学： 膜受体，离子通道，细胞内离子含量、分布及其动态分析。 共聚焦显微镜应用领域 ? （五）遗传学和胚胎学： 细胞生长、分化，细胞组织的三维结构，染色体分析，基因表达，基因诊断 ? （六）神经生物学： 神经组织、细胞结构，神经递质的成分、运输和传递，递质受体，离子内外流。 ? （七）微生物学和寄生虫学： 细菌、寄生虫形态结构（表面和内部结构）； ? （八）病理学研究及病理学临床诊断： 活检标本的快速诊断，肿瘤诊断，自身免疫性疾病的诊断，

14、宫颈上皮细胞涂片诊断 Bing-Jie Ni at al., Microbial and Physicochemical Characteristics of Compact Anaerobic Ammonium-Oxidizing Granules in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor, APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 76(2010) 26522656 CLSM imaging of activated sludge A (2 days of anaerobic starvation at 4 1C) (a) and sludge B (5 days of anaerobic starvation at 41C) (b). C. Lope