单克隆抗体制备试验过程

1、单克隆抗体制备实验过程一、 免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫 方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏 B 淋巴细胞。说明：FCA弗氏完全佐剂；FIA,弗氏不完全佐剂； Quickantibody ,北京康碧泉公司研制 的佐剂。上表中第四种免疫方法产生的抗体大部份都为IgM,存在亲和力弱等缺点，慎用。PS： 1、一般皮下注射每个注射点注射 30-50ul左右混有佐剂的抗原， 每只小鼠注射6-8个点为宜。2 、腹腔注射时，如果

2、抗原混有弗氏佐剂，建议注射在左侧腹 腔，如果采用右侧腹腔注射，则在免疫过程中，很容易导致小鼠脾脏 与腹膜粘连的情况，造成后期取出脾脏麻烦。3 、冲击免疫完成后，应在96小时内完成细胞融合，否则相应 的B细胞数量会下降到未冲击前的水平。二、细胞融合(Cell fusion )【材料和试剂】(1)骨髓瘤细胞悬液 选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生 长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞，制备细胞悬液。(2)免疫小鼠脾细胞悬液取3天前加强免疫的小鼠，眼眶放血，？分离血清冻存备用。拉颈处死小鼠，浸泡于75%酒精中35min。 无菌操作取出脾脏，置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤，剪去 周围的结缔组

3、织，将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿中的 钢网上，先用剪刀剪成35个小块，然后用注射器内芯研磨。将脾 脏细胞悬液移至50ml离心管中，加不完全培养液 50ml, 1000r/min 离心5min,弃上清，再以同法洗涤离心一次。然后将沉淀细胞重新 悬浮于10ml不完全培养液中，计活细胞数，一般一只小鼠可得0.5 2X 108个脾细胞。(3)饲养细胞 将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镣从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射 器注射10ml不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。右手固定注 射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1分钟，随后吸出注入的

4、培养液。1000r/min离心5-10分钟，弃上清。先用5ml HAT培养基将沉淀细胞悬浮，根据细胞计数结果，补加HAT培养基， 使细胞浓度为2X105/ml,备用。(4)主要试剂的配制细胞培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM(Dulberco Modified Eagles Medium )两种基础培养基，配好后过滤除菌 (0.22um),分装，4c保存。完全RPMI-1640或DMEMg养基:不完全RPMI-1640或DMEMf养基80ml小牛血清15-20mlHT或HA信养基:HI A口 4HAT土口加基完全RPMI-1640或DMEMf养基99ml98m

5、lHT贮存液1ml1mlA贮存液1ml氨基喋吟(A)贮存液(100X , 4X 10-5mol/L)称取1.76mg氨基喋吟(Aminopterin MW 440.4 ),溶于90ml超纯水或四蒸 水中，滴加1mol/L NaOH 0.5ml中和，再补加超纯水或四蒸水至 100ml。过滤除 菌，分装小瓶(2ml/瓶)，-20 C保存。次黄喋吟和胸腺喀呢核甘(HT)贮存液(100X, H: 10-2mol/L, T: 1.6 x 10-3mol/L)称取136.1mg次黄喋吟（Hypoxanthine , MW 136.1）和38.8mg胸腺喀呢核 昔（Thymidine, MW 2422,加超

6、纯水或四蒸水至 100ml,置45-50 C水浴中使 完全溶解，过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20 C冻存。用前可置37c加温助 溶。L-谷氨酰胺（L.G.）溶液（100X , 0.2mol/L ）称取2.92g L-谷氨酰胺（L-glutamine , MW 146.15,用100ml不完全培养 液或超纯水（或四蒸水）溶解，过滤除菌，分装小瓶（4-5ml/瓶），-20C冻存。青、链霉素（双抗）溶液（100X）取青霉素G （钠盐）100万单位和链霉素（硫酸盐）1g,溶于100ml灭菌超 纯水或四蒸水中，分装小瓶（4-5ml/瓶），-20 C冻存。 7.5% NaHCO§ 液称取

7、分析纯NaHC。.5g ,溶于100ml超纯水或四蒸水中，过滤除菌，分装 小瓶（4-5ml/瓶），盖紧瓶塞，4 c保存。HEPE豁液（1mol/L）称取 23.83g HEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N, -2-ethanesulfonicacid , N-2-羟乙基哌嗪-N, -2-乙基磺酸，MW238.3）溶于100ml超纯水或四蒸 水中，过滤除菌，分装小瓶（4-5ml/瓶），4c保存。8-氮鸟喋吟贮存液（100X）称取 200mg8-氮鸟喋吟（8-azaguanine , MW152.1 ）,力口入 4mol/L NaOHlml, 待其溶解后，加入超纯水

8、或四蒸水 99ml,过滤除菌；分装小瓶，-20 C冻存。使 用时按1麻度加入到培养液中（即终浓度为 20ug/ml）。 50% PEG称取PEG1000或4000 20-50g于三角瓶中，盖紧，60-80C水浴融化，0.6ml 分装于青霉素小瓶中，盖紧，8磅高压蒸汽15分钟，-20 C存放备用。临用前加 热融化，加等量不完全培养基，用少许 7.5% NaHCOM PH至8.0 ,或购买Sigma 或Gibco公司现成产品。（5） 24孔及96孔培养板等细胞培养所用材料和试剂。【操作步骤】（1）将准备好的骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按1: 51: 10比例混合，？加入2050ml RPMI-1640液

9、。（2） 1000r/min X610min离心弃上清，将上清尽量吸净。（3）用手指轻轻击打离心管底部，使沉淀细胞分散，将离心管 置37c水浴中。（4）吸取1ml 37c预温的50% PEG谖慢滴入离心管内，45秒 左右加完，边加边轻轻搅拌，37 c静置15min。（5）在5min内滴加不完全完全培养液（37C预温）20ml,第一分 钟内滴加1ml,第2分钟2ml,第3分钟5ml,第4和第5分钟各6ml, 同时应边加边轻轻地转动离心管，应沿管壁滴加，不应直接滴加在沉淀细胞上，以防将刚融合的细胞冲开。然后加1640液至50ml使PEG 作用终止。(6) 800r/minX510min 离心，弃上

10、清。(7) ?将沉淀细胞轻轻悬浮于所需容积的 HAT培养液中，接种 24孔板(每孔1.0-1.5ml)或96孔培养板(每孔0.10-0.15ml)。(8)接种完毕后，将培养板放入 37C 5%CO2温箱中培养。 PS：1、冻存的骨髓瘤细胞在复苏后要 2周时间才能处于适合于融合 的状态，培养目标是使处于对数生长的时间尽可能长。2 、饲养层细胞应在使的前一天制备好，这样才能分泌足够的细 胞因子。三、选择性培养原理：在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄喋吟 - 鸟喋吟-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNAB死亡。未融 合的淋巴细胞虽具有次黄喋吟-鸟喋吟-磷酸核糖转移酶，但其本身不 能

11、在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞 获得了次黄喋吟鸟喋吟磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增 殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。(1)接种24孔板或96孔板5天后，用HATW养基换出1/2培 养基。(2) 7-10天后用HT培养基换出HAT培养基；(第14天后可用 普通完全培养基)。PS:1、经常观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上 时吸出上清供抗体检测。四、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选，选用抗体检测方法的原 则是快速、敏感、特异、可靠、花费小和节省人力，通常根据所研究 的抗原和实验室的条件而定，一般制备单

12、抗的目的决定了筛选克隆所 用的方法。由于融合后，细胞上清份数多，但每份体积有限，因此 ELISA是最适合用于初步筛选的方法。经过 ELISA筛选出的阳性克 隆即可进行克隆化，因为如果不进行克隆化，当阳性孔有非抗体分泌 型的杂交瘤时，非抗体分泌型的杂交瘤由于生长速度更快，将会占主导生长，最终很难分离出目标杂交瘤以至丢失。另外杂交瘤细胞培养的初期是不稳定的，有的细胞丢失部分染色体，可能丧失产生抗体的 能力。通常在得到针对预定抗原的杂交瘤以后需连续进行2-3次克隆化，有时还需进行多次。克隆化的方法很多，如有限稀释法、软琼脂 法、单细胞显微操作法、单克隆细胞集团显微操作法和荧光激活细胞分类仪(FACS

13、)分离法。(1)包被 将抗原以pH 9.6的NaCO3-NaHCO3包被，每块酶 标板以5-20 ug抗原为宜(如果抗原为多肽或小分子物质，则需要加 大包被量)。每孔的包被体积为50-100 ulo 37 C包被2 h或4 C包被 过夜。(2)封闭 倒掉抗原，拍干酶标板孔内液体，以0.5-1% BSA (用 PBST溶解)或5%脱脂牛奶(PBST溶解)或1%明胶(PBST溶解) 于37 C封闭2 h或4 C封闭过夜，也可以使用10%小牛血清或其它 无关物种血清封闭。封闭完后可立即使用，也可以洗涤一次置于4 C 密封保存以备后面使用。(3) 一抗 封闭完后，弃去孔内液体，拍干，加入待检测细胞 上

14、清，每孔100 ul为宜。在每块板子上做好记号。37 C孵育1 ho(4)二抗 孵育完一抗后，弃去孔内液体，拍干，以 PBST洗 涤3次，每次5min。根据二抗说明稀释好二抗，每孔加入100 ul.37 C 孵育1 ho(5)显色 孵育完二抗后，弃去孔内液体，拍干，加入显色剂。 待颜色最深时用终止液终止反应。 用酶标仪读出各孔OD值，选择出 阳性孔。(1)有限稀释法从有限稀释的原理以及影响因素可以知道， 其克隆化结果应该是 一个修正的泊松分布：式中入在有限稀释里的意义是稀释时设计的每孔细胞的平均 数,k则代表可能出现的细胞个数。材料：a、96孔细胞培养板等；b、HT培养基；c、活力强的杂 交瘤

15、细胞；d、小鼠腹腔细胞。方法：a、制备饲养细胞(小鼠腹腔细胞)。b、制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含20%血清的HT培养基稀释至每毫升含2.5、15和50个细胞3中不同的稀释度。c、按每毫升加入5X 104-1 X 105细胞的比例，在上述杂交 瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬细胞。d、每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每个稀释度32孔, 每孔量为0.2ml,每孔的杂交瘤细胞数分别为 0.5、3和10。e、37C、7.5% CO2湿润培养7-10天，出现肉眼可见的 克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测。f、取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养，并冻存。g、本法中

16、（b）、（c）、（d）也可简化为将计数后的杂交瘤 细胞准确地进行系列稀释，直至每毫升含 10个细胞，按每孔接种 0.1ml细胞悬液，即每孔含1个细胞。（2）软琼脂法材料：a、HT培养基（双倍浓度）。b、用0.15mol/L NaCl配制的 2.0%琼脂糖：称取2.0g细胞培养用琼脂糖，悬浮于100ml 0.15mol/L NaCl, 121c高压灭菌15分钟，分装10ml小瓶，冷却后4c保存。 c、小鼠腹腔细胞。d、灭菌平皿。e、45 c水浴。f、活力很好的杂交 瘤细胞。方法：a、在培养皿中制备饲养细胞（小鼠腹腔细胞）单层。b、临用前将2.0%琼脂糖生理盐水溶液与等量双倍浓度的HT培养液混匀，

17、配成1%琼脂糖培养液，45 c水浴中温育。c、吸去平皿上层培养液，加入1%琼脂糖培养液3ml,室温10 分钟。d、取杂交瘤细胞悬液1ml,加入1%琼脂糖培养液1ml混匀， 铺于上层。e、37C、7.5%湿润培养7-14天；克隆生长至2mm时，用毛 细吸管吸出克隆，直接转种于含有饲养细胞的 24孔板，扩大培养。f、吸取上清，检测抗体，阳性孔可继续克隆化，或扩大培养、 冻存。PS： 1、细胞融合后，一旦鉴定可以产生目标抗体，就应立即进行 克隆化，确保能分离出单个细胞重新形成克隆。2、经多次尝试，确定修正公式中的 a值，为以后的实验提供 一个比较稳定的经验入值。3、应在克隆前1天制备好饲养细胞层。五

18、、单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生腹水法和体外培 养法。1 .用20G或22G的注射针，小鼠腹膜内注射降植烷，每只鼠0.5 1 ml, 1周后接种细胞。2 .在175 cm2培养瓶中加完全 DMEM-10/HEPES/丙酮酸钠培养 液，进行杂交瘤细胞的培养，使细胞生长至对数期。3 .将培养液转入50 ml锥形离心管中，室温下500 g离心5 min。4 .细胞重悬于50 ml无菌的PBS或HBSS （不含FBS）中洗涤。 然后室温下500 g离心5 min,弃上清。重复2次，然后细胞重悬于 5 ml 的 PBS或 HBSS 中。5 .计数细胞，通过台盼蓝染色法确定细

19、胞活力。6 .用不含FBS的HBSS或PBS调整细胞浓度至2.5X102细胞 /ml。7 .用一个10 ml的无菌的带22G针头的注射器，对裸鼠进行腹 膜内注射2 ml细胞，等待腹水形成（12周）。8 .收获腹水。（1） 一只手抓住并固定小鼠，使其腹部皮肤绷紧。（2）另一只手将一只18G的计头插入小鼠腹腔12 cm深。（3）进针部位为左下腹或右下腹，以避免刺入鼠上腹部的重要器官， 以及腹中线处的主要大血管。（4）令腹水滴入一只无菌的15 ml聚丙烯锥形离心管中。9 .于室温下，1 500 g离心腹水10 min,收集上清，弃沉淀，将 腹水存放于4C,直到收集腹水的工作完成（在 1周内）。10

20、.再次收获腹水前，让小鼠再次积累腹水（23天），具体操作 同步骤8,腹水的加工处理操作同步骤 9。重复这个过程直到再没有 腹水产生可供收集，或者小鼠健康状况不佳。11 .把在几天内收集到的腹水汇集到一起， 于56c水浴45 min进 行热处理，如果凝块形成，可用牙签挑出除之，然后再离心。12 .采用适当的方法检测腹水中的 MAb的效价。13 .按大于1: 10的比例稀释MAb,并进行滤过除菌，滤膜孔径 为0.45 m,分装并冻存于-70C,避免反复冻融，可冻存数年之久。 PS： 1、腹水含有大量的油脂、巨噬细胞、杂交瘤细胞、腹腔内的 上皮细胞、血液中的细胞成份等杂质，应先离心除去这些成份。2、

21、油脂的密度比较小，一般都漂浮在腹水表面，用枪吸出丢 掉即可。六、辛酸-硫酸镂两步沉淀法纯化单抗1、原理在酸性条件下（pH4.5）,非IgG的蛋白成份（包括白蛋白，部分Ig）, 能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为 IgG,再用硫 酸镂沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。辛酸/硫酸镂法比硫酸镂法 能够获得更高纯度的IgG。2、方法（1）将腹水用0.06 M醋酸钠（pH4.0）按1:3稀释，用1mol/L NaOH 调至血清稀释液为pH4.5。(2)室温下边搅拌(磁力搅拌器 或电功搅拌器)，边缓慢滴加辛酸 (一般按每毫升稀释前的腹水加入 40 ul正辛酸)，滴加完后继续搅拌 30min

22、。(3) 4 C 静置 2 ho(4) 4 C 10000 g离心20min,可见辛酸因温度低而从系统中结晶 析出漂浮在腹水上层，用多层纱布过滤，弃去此结晶以及底部沉淀， 收集上清夜。(5)向上清中加入1/10体积的10XPBS (0.1M, pH 7.4)。(6) 4 C条件下，向其中加入饱和硫酸镂溶液，使终浓度为45%饱和度，静置1h以上。(3) 10000 g离心10-20min;弃上清，将沉淀溶于适量1XPBS中， 再将其装入透析袋用10mM的tris或PBS透析(透析液应为抗体体 积的100倍以上，最好搅拌)，4 C过夜。(4)收集透析好的抗体，直接现用或加入保护剂和防腐剂长期保存(-20 C保存或冻干保存)。用这种方法纯化出来的抗体纯度可达80-90%左右，损失较少，对抗体的活性损失也较少，试剂成本低，但是操作比较费时。3、蛋白含量测定紫外分光光度法测样品在波长260nm, 280nm处的I及收光度(A 260, A 280),蛋白含量按以下公式计算蛋白量(g/L) =(1.4