pUC19质粒DNA地提取、纯化及检测

1、大学实验报告 2013年_9_月19日至10月3日 系年级2011级生物技术组别四 科目分子实验 学号同组者_题目PUC19质粒dNA的提取，纯化及检测一、【实验题目】PUC19质粒DNA勺提取，纯化及检测二、【实验目的】1. 掌握碱变性提取法提取质粒的基本原理和方法，理解各种试剂的作用。2. 掌握质粒纯化的基本原理及各种试剂的作用。3. 掌握琼脂糖凝胶电泳进行质粒检测分离的原理。4. 掌握琼脂糖凝胶电泳的制备和电泳方法。5. 掌握琼脂糖凝胶电泳的观察方法及凝胶成像仪的操作方法。三、【实验试剂与器材】1. 材料大肠杆菌 DH5 （ E.COli DH5 ）2. 试剂LB液体培养基，氨苄青霉素（

2、Amp）母液（20mg/ml）,溶液I,溶液H,溶液叭 3MNaAc 溶液，无水乙醇，70比醇，TE溶液，Rnase A,苯酚/氯仿/异戊醇（25: 24： 1）,灭菌双蒸 水 ddHO, 1 x TAE 6X loading buffer , Supercoiled DNALadder Marker,入-Hind III digest DNA Marker，溴化乙锭（EB）3. 仪器培养皿，接种环，三角瓶（100ml、300ml）,酒精灯，恒温振荡培养箱，50ml离心管，1.5ml 塑料离心管（eppendorf 管）,高速离心机，漩涡振荡器，移液枪，不同型号枪头（10ul ,200ul ,

3、 1ml）,电泳仪，微波炉，灭菌锅，吸水纸，记号笔，移液管，洗耳球，PE手套，橡胶手套，滴管，天平，称量纸，冰箱，凝胶成像仪等 四、【实验原理】1. 碱变性法提取质粒及酚、酚 /氯仿、氯仿/异戊醇纯化质粒质粒由于分子小、能自主复制、携带抗性基因、便于分离和提取，经常用在DNA重组中， 携带目的基因进入细菌、 动物细胞或植物体进行扩增与表达，是基因工程中一种非常重要的载体。构建重组DNA分子需要首先从宿主细胞中提取高质量的质粒DNA提取和纯化质粒 DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和 Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和

4、常用， 适于不同量质粒 DNA勺提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。碱变性提取质粒 DNA 一般包括三个步骤：培养细菌以扩增质粒；收集和裂解细胞；分 离和纯化质粒DNA在细菌细胞中，染色体 DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体 DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性； 共价闭合环状质粒 DNA勺大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。 当用pH值4.6的KAc （或NaA

5、c）高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可以恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶 于溶液的质粒 DNA分离。溶于上清液的质粒 DNA可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成 沉淀。由于DNA与 RNA性质类似，乙醇沉淀 DNA的同时，也伴随着 RNA沉淀，可利用 RNase A将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通过酚 /氯仿抽提除去， 最后获得纯度较高的质粒 DNA。2. 琼脂糖凝胶电泳 电泳是带电物质在电场中

6、向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。各种生物大分子在一定pH 条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介 质，它具有分子筛效应。 含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的大小、 形态及电荷量的不同而有差异。 利用移动速度差异， 就可以区别各种 大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段，是分子生物学的核心技术之一。凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨围极广。此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭或SYBR Gold染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外激发下也能直接

7、检测到。需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。分子生物学实验中，常用的两种凝胶为琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。这两种凝胶能灌制 成各种形状、 大小和孔径， 也能以许多不同的构型和方位进行电泳。 选择上述提及的参数或 条件主要取决于被分离的 DNA片段的大小。聚丙烯酰胺凝胶分辨率高，适用于较小分子核酸(5500bp)的分离和蛋白质电泳。它的分辨率非常高，长度上相差1bp或质量上相差0.1%的DNA都可以彼此分离，这也是采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行DNA序列分析的分子基础。虽然它能很快地进行电泳，并能容纳较大的DNA羊量，但是与琼脂糖凝胶相比，在制备和操作上还是繁琐些。

8、聚丙烯酰胺凝胶电泳是在恒定电场中垂直方位上进行的。琼脂糖是从海藻中提取的长链状多聚物，由B-D-吡喃半乳糖与1,4连接的3,6-脱水-L-吡喃半乳糖组成，相对分子质量为104105。当琼脂糖加热至90 C左右，即可熔化形成清亮、透明的液体，浇在 模板上冷却后固化形成凝胶，其凝固点为4045C。琼脂糖比聚丙烯酰胺凝胶的分辨率略低，但它的分离围更大(50至百万bp),小片段DNA( 5020000bp)最适合在恒定强度和方向的 电场中水平方向的琼脂糖凝胶电泳分离。 琼脂糖凝胶电泳易于操作， 适用于核酸电泳， 测定 DNA的相对分子质量，分离经限制酶水解的DNA片段，进一步纯化 DNA等。琼脂凝胶糖

9、电泳是一种常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基团而带负电荷，在 电场中向正极移动。 DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率主要取决于下面6个因素：(1) 样品DNA分子的大小：电泳时，线性双螺旋DNA分子是以头尾位向前迁移的，其 迁移速度与相对分子质量 (所含碱基) 的对数值成反比， 这是因为大分子有更大的摩擦阻力。(2) DNA分子的构象：相对分子质量相同而构象不同的DNA分子，其迁移速率不同。在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA的一条链断裂，变成开环 DNA如果两条链发生断裂，就转变为线状DNA分子。这三种构型的分子有不同的迁移率。 一般情况下，

10、超螺旋型迁移速度最快，其次为线状分子， 最慢的是 开环状分子。(3) 琼脂糖浓度：琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径，一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的泳动速度不同。通常凝胶浓度越低，则凝胶孔径越大，DNA电泳迁移速度越快，因此，相对分子质量越大，选用的凝胶浓度应越低。(4) 电泳所用电场：低电压条件下，线性DNA片段的迁移速率与所用电压成正比，电压越高，带电颗粒泳动越快，但随着电场强度的增加，不同长度DNA泳动的增加程度不同，因此凝胶电泳分离 DNA勺有效围随着电压上升而减少。为了获得DNA片段的最佳分离效果，电场强度应小于 5V/cm。（5）缓冲液：缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移

11、率。当电泳液为去离子水，溶液的导电性很少，带电颗粒泳动很慢，DNA几乎不移动；而在高离子强度下，导电性极高，带电颗粒泳动很快，产生大量的热，有时甚至熔化凝胶或使DNA变性。电泳时常用的缓冲液有乙酸盐（TAE）、硼酸盐（TBE和磷酸盐（TPE几种不同的电泳缓冲液，通常配成10X或5X的浓缩母液保存于室温下，用时稀释至工作浓度。电泳缓冲液的工作浓度约 50mmol/L,工作pH在7.57.8之间。TAE缓冲液缓冲能力弱，长时间电泳 缓冲能力逐渐丧失邙日极变碱性，阴极变酸性），长时间电泳需要更换缓冲液；TBE TPE缓冲液缓冲能力较强，可以重复使用数次。TAE缓冲液可以分离数 kb长度的DNA在精制

12、DNA片段以及染色体 DNA进行杂交时比较常用。相反，TBE缓冲液适于鉴定、分离短小的DNA片段。（6） 温度：琼脂糖凝胶电泳时，不同大小DNA片段的相对电泳迁移率在 430C无变化， 一般琼脂糖凝胶电泳多在室温下进行， 而当琼脂糖含量少于 0.5%时，凝胶很脆弱，最好在4C 下电泳以增加凝胶强度。3. 常用的DNA分子标准物的电泳图谱及分子大小LambdaBs/EH (kb>LambdaHindin (kb)PBR322SsfNI (kb)B 457 246.375 6923.1 39.426.564 363 682 32 1 *931.371.262322 031861.06.70.

13、93225613381211t849 bp 10.085 bp 8,023 bp 6t133 bp5,026 bp3.997 bp 3,049 bp2,087 bp五、【实验步骤】1. 准备实验配制LB液体培养基，分装至 100ml三角瓶中20ml, 300ml的三角瓶中50ml，包扎。另配 LB固体培养基，包扎；准备 10ul、200ul、1ml枪尖各一盒，1.5ml离心管若干于 500ml三 角瓶中，50ml离心管2个，移液管，包扎、标记，连同 LB培养基一同灭菌。2. 菌体培养(1) 点燃酒精灯，将接种环在酒精灯上灼烧，冷却，灭菌(2) 向20ml液体LB培养中加入20ul氨苄青霉素，混

14、合均匀。(3) 在含有氨苄青霉素的LB平板上，用接种环挑取提前活化的含有有质粒pUC19的E.coliDH5单菌落，接种于(2)的培养基中，之一接种环的圆环处在液壁交界面研磨至菌苔分散 进入培养液。(4 )用棉塞塞住瓶口，用牛皮纸包住，并用绳子系紧。(5) 37 C, 200rpm振荡培养过夜，约 12h。3. 扩大培养吸取菌液0.8ml转接至含氨苄青霉素的 80ml LB液体培养基(Amp100ug/ml )中,37 C, 200rpm 振荡培养6h。4. 质粒提取(1 )称量一个50ml离心管的重量 w,记录为14.53g。(2) 将35ml菌液转入离心管，标记为 2-4-1。菌液应距管口

15、 1cm以防离心时菌液外溢，与 其它组同学配平后，于6000rpm离心5min,弃上清。(3) 加入5ml溶液I打散菌体洗涤，用漩涡振荡器混匀，于6000rpm离心5min,弃上清， 称重w为14.69g,所以菌泥重量为 0.16g.(4) 向离心管中加入 2.0ml溶液I ,充分涡旋振荡，冰浴 5min。(5) 向离心管中加入 4.0ml溶液n,悬滴快速加入，轻柔颠倒混匀，发现离心管中的溶液变得有一些粘稠，冰浴5min。(6) 向离心管中加入 3.0ml溶液川，缓慢轻柔上下颠倒混匀，发现离心管中出现了白色絮状沉淀物，冰浴5mi n。(7) 12000rpm离心15min，将上清液轻轻转入新的

16、离心管2,标记为2-4-2，记录上清液体积V为9ml.(8) 加入18ml冰乙醇，混匀，-20 C静置15-30min。(9) 12000rpm 离心 15min,弃上清。(10) 加入5ml 70%乙醇，12000rpm离心5min,弃上清。(11 )重复洗涤一次；吸弃上清， 37 C风干5-10min。(12 )分次加入1mlTE溶解沉淀并转移到 Ep管中，得到质粒 DNA粗提物，加入50ul RNase A, 37C静置1-2h,-20 C保存待用。5. 质粒纯化(1 )向上次得到的粗提物平均分装至两个Ep管中。(2) 用滴管悬滴加入 500ulTris 饱和酚溶液，振荡混匀，配平后于1

17、2000rpm离心5min, 观察到溶液分为三层，上层澄清，中间为白色的蛋白，下层淡黄色。(3) 将上清液转入新管，记录两管的体积均为450ul。(4) 用滴管分别向两管悬滴加入450ul苯酚：氯仿：异戊醇溶液，颠倒混匀，观察到溶液分为两层，两层均是透明无色，配平后于12000rpm离心5min。(5) 将上清液转入新管，其中1号管体积为400ul，2号管体积为360ul。(6) 用滴管向1号管悬滴加入400ul氯仿/异戊醇，向1号管悬滴加入360ul氯仿/异戊醇， 颠倒混匀，配平后于 12000rpm离心5min。(7) 将上清液转入新管，两管转移的液体的体积均为350ul。(8) 向上清液

18、中加入 35ul3M NaAc,混匀，加入770ul的冰无水乙醇混匀，-20 C沉淀30min。(9) 配平后于12000rpm离心15min.，弃上清。(10) 加入500ul 70%乙醇润洗沉淀表面一次，12000rpm离心2min，弃上清。(11) 重复洗涤一次，吸弃上清，37 C风干5min。(12) 向其中一管加入 30ul TE溶解沉淀，然后将溶液转移至另一管中，最终得到30ul纯 化的质粒DNA6. 琼脂糖凝胶电泳检测纯化的质粒(1 )配制缓冲液：将50 X TAE稀释至1X TAE缓冲液(2 )制胶：称取0.4g琼脂糖于300ml三角烧瓶中，加40ml 1 X TAE制成1%琼

19、脂糖凝胶。微 波炉加热至琼脂糖完全溶化，待冷却至60C左右，缓慢倒入架有梳子的电泳胶板中，勿产生气泡，静置冷却30min以上。待其完全凝固，垂直向上拔出梳子，将胶连同托盘一起放入电 泳槽中央，加入缓冲液，液面应高于胶面1-2mm,准备上样。(3) 上样：取 2.0ul 质粒 DNA样品、2.0ulddH 20及 1.0ul 6 X loading buffer 混匀，在加 样孔上方1-2mm处垂直点样，同时点样5.0ul超螺旋 marker，100ngpUC19 5.0ulpUC19/Hind III 、10ul 入 DNA 5ul 入 DNA/Hind III ，100-120V 电泳 30

20、-40min (实际时间根据电泳条带 的迁移情况判断)。(4) 染色及观察电泳完成后，将胶放入0.5ug/ml的EB染液中染色约10min，水洗，在凝 胶成像仪中观察电泳结果，摄片，剪辑，保存，分析结果。7. 菌株的验证(1) 配制加入氨苄青霉素和不加氨苄青霉素的麦康凯培养基，灭菌，分别倒一个平板，标 加入氨苄青霉素的标号为 1,没加氨苄青霉素的标号为 2。(2) 用记号笔将平板分别分为两部分，在酒精灯下分别将1号平板的左半部分接种 E.coliDH5，右半部分接种含 pUC19的 E.coli DH5 。（3）于37C培养箱中培养一天（4）观察大肠杆菌的生长情况，菌落的形态以及培养基的颜色变

21、化，并记录实验结果。六、【实验结果】1. 实验数据表1 pUC19质粒提取、纯化和检测实验数据记录实验步骤项目量质粒提取菌泥（g）0.16溶液1 (ml)2溶液II （ ml）4溶液 III （ ml）3质粒检测提取质粒上样量（ul）2纯 pUC19±样量（ul）5纯 pUC19含量（ng）1002. 实验现象表2 pUC19质粒提取、纯化和检测实验现象记录和分析实验步骤实验现象实验现象分析质粒提取向离心管1中加 入溶液II溶液变粘稠如蛋清状溶液II是强碱性溶液，染色 体DNA氢键断裂，双螺旋结 构解开而变性；质粒 DNA大 部分氢键断裂，但两条互补 链不完全分离，在溶液中不 溶解向

22、离心管1中加入溶液III出现白色絮状沉淀溶液III是高盐溶液，调节 碱性溶液至中性，此时变性 的质粒DNA可恢复到原来的 共价闭合环状超螺旋结构而 溶解在溶液中，染色体 DNA 不能复性，与不稳定的大分 子RNA蛋白质-SDS复合物 仪器形成缠绕、可见的白色 絮状沉淀加入冰无水乙 醇，沉淀30min后溶液出现少量白色沉 淀，肉眼可见DNA不溶于无水乙醇中，以沉 淀形式存在无水乙醇沉淀离心后管底部一侧壁上沉积有白色沉淀质粒在离心力作用下沉积在 外侧管壁粗提质粒质粒大部分呈透明 状，少部分地方发黄粗提质粒不纯净，含有蛋白 质等杂质向管中加入Tris饱和酚，溶液分为三层，中层 可见白色沉淀苯酚使蛋白

23、质变性而沉淀， 由于密度关系，出现上层酚、质粒纯化混匀离心后中层蛋白，下层水的现象向管中加入苯 酚/氯仿/异戊 醇，混匀离心溶液出现两个分层， 没有明显颜色差异苯酚使蛋白变性，氯仿溶解 苯酚、脂质，密度咼于水， 在上层，下层为水相向管中加入氯 仿/异戊醇，混 匀离心溶液出现两个分层， 没有明显颜色差异异戊醇帮助分层，氯仿不溶 于水，由于密度关系出现分 层加入冰无水乙 醇，静置至少30mi n理应可见沉淀，但是 没有看见沉淀沉淀量较少，肉眼不可见无水乙醇沉淀 后，离心管底部一侧壁上出现 白色沉淀质粒在离心力作用下沉淀下 来，得到纯化的质粒纯化质粒干燥 后基本呈无色透明状， 有极少部分仍有浅黄 色

24、纯质粒为无色，浅黄色说明 质粒中仍有蛋白等杂质的污 染3.琼脂糖凝胶电泳结果图一：碱裂解法 pUC1质粒提取、纯化和检测实验琼脂糖凝胶电泳图注释：电泳图从左至右为1-18号点样孔，其中1号孔为5.0ul超螺旋marker，2号孔为取 100ngpUC19 3 号孔为 5.0ulpUC19/Hind III ,10 号孔为 6.0ul 超螺旋 marker，17 号孔为 10ul入DNA 18号孔为5ul入DNA/Hind III ，我们组纯化的质粒在 7号孔。电泳结果图分析：(1) 超螺旋质粒pUC19大小约为2.7kb，应在超螺旋 marker 2kb和3kb条带之间。从图谱 分析，我们组提

25、取质粒大小正确。与标准pUC19质粒电泳条带对比，我们提取的质粒电泳条 带粗且亮，表明质粒浓度很高，且上样量较多，使条带出现“溢出”现象，属于正常现象。(2) 在超螺旋质粒 pUC19上方可以看见两条带，应为质粒的其它两种构型，其中开环的泳 动速度较慢，位于上方，线性构型位于下方。(3) 电泳图谱上方靠近点样孔的位置可见系列条带，根据入 -Hind III digest DNAMarker各条带的分子量大小判断，应为染色体DNA说明质粒中存在着少量的染色体 DNA说明质粒受到了染色体 DNA的污染。原因可能是加入溶液 II过程持续时间过长或者加入溶液 II混匀动作幅度过大，使染色体DNA发生断

26、裂。（4） 电泳图谱的最下方可见微弱的条带，该条带应为少量RNA残留，说明RNA酶未完全降 解RNA（5）如图1所示，点样孔附近有明显亮光，分析原因可能是质粒中仍有蛋白质、多糖等杂质污染，蛋白质域 DNA吉合滞留在点样孔，经EB染色会发出荧光（6） 2号孔标准pUC19上样含量100ng，我们加入的质粒 DNA为2ul，粗略估计我们提取的 质粒浓度约为100-150ng/ul之间。4. 菌株的验证图二：菌株的验证左边为含氨苄青霉素的麦康凯培养基，右边为不含氨苄青霉素的培养基，两个培养基均接种了 E.coli DH5 , E.coli DH5（pUC19）表三：菌株的验证实验现象项目加氨苄青霉素

27、的麦康凯培养基没加氨苄青霉素的麦康凯培养基E.coli DH5E.coliDH5(pUC19E.coli DH5E.coliDH5(pUC19生长与否否生长生长生长菌落的形态、大 小、数量鲜桃红色或微 红色，菌落中 心呈深桃红 色，圆形，扁 平，边缘整齐， 表面光滑，数 量较多菌落白色，圆 形，扁平，边 缘整齐，表面 光滑，菌落数量 稍微偏少菌落微红，圆 形，扁平，边 缘整齐，表面 光滑，菌落数 量较多培养基的颜色深红（西瓜 红）深红（西瓜红）橘黄色橘黄色上述实验现象说明：氨苄青霉素是有效的。E.coli DH5 （ pUC19有氨苄青霉素抗性。七、【注意事项】1. 在接菌时，将挑有菌体的接种

28、环在三角瓶壁上靠近液面的地方轻轻碰触，然后轻轻摇动三角瓶，使液体LB培养基与菌体接触，当瓶壁接菌处有轻微浑浊现象时，说明接菌成功。轻 轻震荡三角瓶，使全部菌体进入培养基中。2. 在离心管本身已经有沉淀出现时，要在瓶壁上进行标记，以便在将离心管放入离心机时使沉淀朝外。另外使用离心机时要注意配平，取出离心管时注意小心轻拿，保持其倾斜状态，防止沉淀重新进入上清液中。3. 离心后，要去除上清液时，可以将离心管倒置在纸巾上除去残留的液体，但要注意观察沉淀是否稳定，防止不小心把沉淀也去掉了。4. 加入溶液I时可以剧烈震荡，因为此时细菌还没有与溶菌酶完全作用，染色体DNA还没有释放出来，不用担心其断裂。当加

29、入溶液II、III后，必须注意不能过度用力震荡，但是又必须保证溶液混合充分，可以上下颠倒离心管数次直至混匀。5. 进行沉淀干燥时要注意离心管管壁上有没有液珠，沉淀边缘2mm要干燥至透明才可以，不然会引入杂质。6. 用ImITE溶解沉淀时要注意吹气助溶，不要产生气泡。7. 苯酚试剂具有腐蚀性，使用时应该小心，皮肤如果不小心沾到酚，应该立即用碱性溶液、 肥皂或大量清水冲洗。8点样时要小心操作，可以用两只手点样，避免损坏凝胶，也不要快速挤出吸头的样品，避免挤出的空气将样品冲出样孔。9.使用溴化乙锭染色时一定要做好防护措施，应该多戴几层手套。八、【实验分析与讨论】1何为质粒？其大小？其拷贝数？质粒是附

30、加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子（即细胞附殖粒、又胞附殖粒）。大部分的质粒虽然都是环状构形，然而目前也发现有少数 的质粒属于线性构形， 它存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物的线粒体等胞器中。天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约1几个；松驰型质粒拷贝数较多， 可达几百2.pUC19的大小和质粒图谱？ECOO1O9轻刃哥 DRAIII?©/MT 11躍孟罚 _ S6PI<=5D<)"INI宙冏ampRCFfilOl 078q).,_-

31、egui pgpUC19zsee bp呷If!卑MAR I Q37)/eHEI(2 至'I3CZ S /尸匚Q刊严)/ I ?Ah| 11 (4CT)/；恨M斗I啊)/.严 I (407)f / y ：;!>SP7ie(aQ /ayAVAi 词加外I皆Pill (41奇皆司=兀IWM OF.气 '<-iyiAi(4iiqi珂V：；SXBAM HI (41 'l也粘皆.严0阳弊2书 SA LG (3® MCI (4S1) HINGII (4彌 IND II 43 '/pen <4gBSP lull (44>SPHI (4呵H IN

32、IDlll 址©l3cZ' promoterPMB1 ori图三：pUC19图谱3. 质粒在细胞的构型有哪些？有超螺旋质粒，环状，线型三种。4. E.COli DH5的菌株特性？E.coli DH5是大肠杆菌endA基因发生突变的菌株，在使用pUC系列质粒载体转化时，可 与载体编码的B-半乳糖苷酶氨基端实现a-互补，可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。菌株中很多重组酶、修饰酶等缺失，防止质粒的重组、修饰，能够保持携带质粒的稳定性。一般 常用于质粒的构建、扩增，较少用于蛋白表达。5. 如何将质粒DNA与染色体DNA分离？检测中如何判断？碱性条件下，染色体DNA双螺旋结构解开而变性，

33、质粒DNA的氢键断裂但两条互补链彼此缠 绕。恢复中性时，染色体 DNA难以复性，质粒DNA分子很快复性，离心时染色体 DNA与细胞 碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中，由于染色体DNA片段的大小比质粒 DNA大，电泳时染色体 DNA的迁移速率比质粒 DNA的小，距点样孔的距离短，由此可以将质粒 DNA与染色体DNA分离。6. 如何将质粒DNA与细胞RNA组分分离？检测中如何判断？纯化质粒时加入 RNA酶将RNA消化，从而将质粒DNA与细胞RNA分离，纯化的质粒中残留的 RNA也是经RNA酶消化的小片段的 RNA电泳时迁移速率较快，距点样孔的距离比质粒DNA远。7. 如何将质粒DNA

34、与细胞蛋白质组分分离？检测中如何判断？Tris饱和酚使蛋白质变性而去除蛋白质，电泳时蛋白质不移动，依然滞留在点样孔，点样ATCC 37254孔附近有明显亮光，分析原因可能是质粒中仍有蛋白质、多糖等杂质污染，蛋白质域 DNA 结合滞留在点样孔，经 EB 染色会发出荧光。8. 琼脂糖凝胶电泳的缓冲液选择原则？缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。 当电泳液为去离子水， 溶液的导电性很少， 带电颗粒泳动很慢，DNA几乎不移动；而在高离子强度下，导电性极高，带电颗粒泳动很快， 产生大量的热，有时甚至熔化凝胶或使DNA变性。根据所鉴定的分子的大小选择缓冲液。电泳时常用的缓冲液有乙酸盐（ TAE、硼酸盐（

35、TB日和磷酸盐（TPE几种不同的电泳缓冲 液，通常配成10X或5 X的浓缩母液保存于室温下，用时稀释至工作浓度。电泳缓冲液的工作浓度约50mmol/L,工作pH在7.57.8之间。TAE缓冲液缓冲能力弱，长时间电泳缓冲能 力逐渐丧失邙日极变碱性，阴极变酸性），长时间电泳需要更换缓冲液；TBE、TPE缓冲液缓冲能力较强，可以重复使用数次。TAE缓冲液可以分离数 kb长度的DNA在精制DNA片段以 及染色体DNA进行杂交时比较常用。相反，TBE缓冲液适于鉴定、分离短小的DNA片段。注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低， PH 值上升，缓冲性能下降，可能使 DNA 电泳 产生条带模糊和不规则的 D

36、NA 带迁移的现象 .9. 琼脂糖凝胶电泳的浓度选择原则？琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径，一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的泳动速 度不同。通常凝胶浓度越低，则凝胶孔径越大，DNA电泳迁移速度越快，因此，相对分子质量越大，选用的凝胶浓度应越低。11. 同一质粒的不同构型，在电泳中的迁移速率的差异？在凝胶上的表现行为如何？相对分子质量相同而构象不同的DNA分子，其迁移速率不同。在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA的条链断裂，变成开环 DNA如果两条链发生断裂，就转变为线状DNA分子。这三种构型的分子有不同的迁移率。一般情况下， 超螺旋型迁移

37、速度最快， 其次为线状分子， 最慢的是开环状分子。在凝胶上表现为距 点样孔的距离为超螺旋型 线状分子 开环状分子 .12. 同一构型的不同大小的质粒或者片段在电泳时的迁移率差异？在凝胶上的表现行为如何？同一构型的不同大小的质粒或者片段分子越大， 摩擦阻力越大， 迁移越慢在凝胶上表现为分 子越大的距点样孔的距离越小。13. 溶液 I 的作用溶液 I：50mmol/L 葡萄糖， 25mmol/L Tris-HCl （pH8.0）， 10mmol/LEDTA。葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力作用而降解。EDTA整合Mg+、Ca2+等金属离子，抑制 DNase对DNA的降解作用。另外，EDTA的存在，有 利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。14. 溶液 II 的作用溶液 II : 0.2mol/L NaOH , 1%SD（临用前用 10mol/L NaOH 和 20%SDS母液配制）。NaOH DNA在 pH大于5、小于9的溶液中是稳定的。但当 pH 12或pHv 3时，就会引起双 链之间的