DNA测序-概述发展史原理

1、DNA测序-概述发展史，原理，方法，常见问题分析DNA测序技术-发展历史 1.70年代末，WalterGilbert发明化学法、FrederickSanger发明双脱氧终止法手动测序，同位素标记2.80年代中期，出现自动测序仪（应用双脱氧终止法原理）、荧光代替同位素，计算机图象识别3.90年代中期，测序仪重大改进、集束化的毛细管电泳代替凝胶电泳4.2001年完成人类基因组框架图DNA测序技术-测序原理1.化学修饰法测序原理2. Sanger法测序的原理化学修饰法测序原理 化学试剂处理末段DNA片段，造成碱基的特异性切割，产生一组具有各种不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳分离。化学切割反

2、应：包括碱基的修饰修饰的碱基从其糖环上转移出去在失去碱基的糖环处 DNA断裂。 Sanger法测序的原理 就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。 终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核

3、苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。 DNA测序技术-方法概述 生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起点，但却随机终止于特定的一种或者多种残基上。由于DNA上的每一个碱基出现在可变终止端的机会均等，因些上述每一组产物都是一些寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在原DNA全片段上的位置所决定。在可以区分长度仅差一个核苷酸的不同DNA分子的条件下，对各组寡核苷酸进行电泳分析，只要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道上，即可从凝胶的放射自影片上直接读出DNA上的核苷酸顺序

4、。DNA测序技术-常见问题分析测序无信号 处理办法：测序无信号的原因有很多，其中最大的可能性是引物与模板没有结合，这种情况下要先检查模板上是否有引物的位点，建议更换引物或者模板。质粒双克隆 处理办法：双克隆的现象主要发生在质粒测序中，载体序列的峰型比较单一，插入片段开始出现杂峰；PCR测序也可能出现这种情况，主要是因为有两个以上大小相差不多的片段引起的。对于质粒，出现这种情况有两种可能，一是挑克隆时不小心挑了两个以上的克隆，另外一个原因就是有两个片段同时插入同一个载体，对于前一种情况，重新挑克隆即可，后一种情况，一方面可以重新挑克隆，另外也可以将质粒转化后再挑单克隆，可能会改善。对于PCR 产

5、物，由于大小相差不多，无法用Agarose的方式分离，只有进行克隆后测序 PCR双克隆 POLY 结构 polyT poly C 处理办法：我们在测序结果中经常会出现连续的poly G.C.A.T之后有的中断，有的会出现峰型比较杂乱的情况，无可用序列。这种情况下只有从反向进行测序。 引物不纯或者发生降解 处理办法：测序对引物要求比较严格，要求纯度要达到99以上，如果引物不纯或者发生降解，测序峰图会比较杂乱，无可用序列，这种情况下只有更换引物引物与模板有多结合位点 处理办法：如果引物与模板有两个以上结合位点，就会出现峰型杂乱无章，无可用序列的现象，这种情况只有更换测序引物，如果是质粒，使用的是通

6、用引物测序，可用换另外的引物或者请客户提供插入片段的引物进行测序，如果是PCR测序，只有用反向引物测序，或者建议客户克隆后用通用引物进行测序重复序列 处理办法：样品中出现重复序列，目前来说没有好的办法，只有从反向测序，如果PCR产物中出现重复序列，装到载体里要比PCR产物直接测序要好一些，但对于较长的重复序列，测序还是一个难题，没有什么好的办法模板不纯 处理办法：主要发生在PCR产物上，一方面可能是产物没有纯化，另外就是纯化效果不好，一般情况下，我们建议客户对PCR产物尽量进行割胶纯化，如果片段相差不大，最好克隆后测序。 碱基发生缺失 缺失一个碱基 缺失两个碱基 处理办法：碱基缺失，主要发生在PCR产物测序中，遇到这种情况，克隆后测序会是一个比较好的解决方法。 测序发生中断 处理办法：这种情况通常是由于样品中存在特殊结构，DNA双链无法打开，PCR