基因组测序与序列

1、基因组测序与序列组装主要内容:什么是基因组什么是基因DNA测序的方法DNA序列的组装人类基因组计划水稻基因组计划后基因组学1. 1. 什么是基因组 基因组就是一个物种中所有基因的整体组成。 基因组有两层意义：遗传物质和遗传信息。 要揭开生命的奥秘，就需要从整体水平研究基因的存在、基因的结构与功能、基因之间的相互关系。 Zea mays 8,000Homo sapiens 3,000Oryza sativa 400Drosophila melanogaster 165Arabidopsis thaliana 100Saccharomyces cerevisiae 12E.coli 4.6Geno

2、me Size (Mb)什么是C 值？C值悖理： 生物的复杂性与基因组的大小并不完全成比例增加细菌真菌等动物阴影部分为一个门内C-值的范围重复顺序高度重复顺序： 长度：几个几千个bp 拷贝数：几百个上百万个 首尾相连，串联排列 集中分布于染色体的特定区段（如端粒，着丝粒等） 也称卫星DNA中度重复顺序： 一般分散于整个基因组中； 长度和拷贝数差别很大单一顺序： 基因主要位于单一顺序 动物中单一顺序约占50 植物中单一顺序约占20 DNA 的复性 遵循二级反应动力学，可表述为：dCt / dt = -KC02 反应达 t 时，单链DNA浓度 = CtC0 = 单链 DNA起始浓度 K 复性速度常

3、数顺序复杂性Cot(1/2) = 1/K (mol. Sec / L) 常数 Ct/C0 0101C0t(1/2) C0t(1/2) C0t(1/2)值与基因组复杂性成正比。 是遗传信息的物理和功能单位，包含产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。 基因分类： 编码RNA的基因，如rRNA基因，snRNA基因等； 编码蛋白质的基因2. 什么是基因？基因的不连续性Intron 和Exon: 大多数真核生物蛋白质基因的编码顺序(Exon)都被或长或短的非编码顺序(Intron)隔开基因家族 一群具有一致的或相似顺序的基因, ,有的还担负类似的生物学功能, , 可以相互补偿, , 比如:E

4、2f :E2f transcription factor transcription factor Mouse symbolHuman OrthologE2f1E2F1 E2f2E2F2E2f3E2F3E2f4E2F4E2f5E2F5E2f6E2F6假基因(Pseudogene) 来源于功能基因 但已失去活性 的DNA序列产生假基因的原因有:1. 由重复产生的假基因;2. 加工的假基因, 由RNA反转录为cDNA 后再整合到基因组中;3. 残缺的基因(Truncated gene) 重迭基因有以下几种情况：*一个基因完全在另一个基因内部*部分重叠* 两个基因共用少数碱基对 *一个基因完全在另一

5、个基因内部如：B和A， E和D 其读码结构互不相同 -ATG-/-AATGCC -/-ATAACG-/-TAA-A*BATGCCN-NNATAA*部分重叠 如： K和C *两个基因共用少数碱基对 如： D和J-TAATG-D 终止密码子J 起始密码子3. DNA测序的方法链终止法测序化学降解法测序自动化测序非常规DNA测序3.1 链终止法测序(the chain termination method) 基本原理: 通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而来读取待测DNA分子的顺序。技术路线与要求制备单链模板 将单链模板

6、与一小段引物退火 加入DNA多聚酶 4种脱氧核苷酸分别加入少量4种双脱氧核苷酸 将4种反应产物分别在4条泳道电泳 根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列 A 克隆于质粒中DNA用碱或热变性B M13克隆单链DNAC 噬粒克隆DNAD PCR产生单链DNAA 高酶活性B 无53外切酶活性C 无35外切酶活性ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP 的3碳原子连接的是氢原子,不是羟基3.2 化学降解法测序 基本原理: 在选定的核苷酸碱基中引入化学集团,再用化合物处理,使DNA分子在被修饰的位置降解.技术路线 将双链DNA样品变为单链 每个单链的同一方向末端都用放射性同位素标记,以便显示

7、DNA条带 分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的降解DNA群体 电泳,读取DNA的核苷酸顺序Maxam-Gilbert Maxam-Gilbert 法所用的化学技术碱基特异修饰方法GPh8.0,用硫酸二甲酯对 N7进行甲基化,使 C8-C9键对碱基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0 哌啶甲酸可使嘌呤环的N原子化,从而导致脱嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键C+T肼可打开嘧啶环,后者重新环化成五元环后易除去C1.5mol/L NaCl存在时,可用肼除去胞嘧啶化学法测序实例哌啶3.3 3.3 自动化测序 基本原理 与链终止法测序原理相同,只是用不同的荧光色彩标记ddNTP,如ddATP标记红

8、色荧光,ddCTP标记蓝色荧光, ddGTP标记黄色荧光, ddTTP标记绿色荧光.由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而简化为由1个泳道同时判读4种碱基.3.4 非常规测序 毛细管电泳 用毛细管电泳取代聚丙烯凝胶平板电泳,节省时间,加快测序进程,其他程序同链终止法或化学测序法. 光点测序 脱氧三磷酸核苷酸连接到DNA 3-末端时会释放1个焦磷酸(PPi) ,焦磷酸在磷酸化酶的作用下转化为化学能,并发出光亮.由此,往反应液中每次只加入1种核苷酸,当加入的核苷酸结合时,反应液发出亮点,并记录核苷酸种类;当核苷酸未结合时,反应液中的核苷酸酶迅速分解此核苷酸,由此来测定DNA序列. DNA芯片

9、测序 基本原理 将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上, 每个点播的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置.待检测的DNA分子与芯片温浴,凡是能杂交的寡核苷酸都会在确定位置发出信号,然后根据获取的信息将寡核苷酸的顺序进行对比组装,拼接成完全的DNA顺序.1 ATACGTTA2 GTTAGATC3 ACGTTAGA4 CGTTAGAT5 GTTAGATCDNA 样品 TATGCAATCTAG与基因芯片上 65,000 种可能的八聚体进行杂交从而形成特定的结合图形计算机分析杂交图象并由探针的重叠情况推导样品的核酸序列1 ATACGTTA3 TACGTTAG4 ACGTTAGA2 CGTTAGAT5 G

10、TTAGATC3 TACGTTAG4 ACGTTAGA2 CGTTAGAT互补序列为：ATACGTTAGATC样品序列为：TATGCAATCTAG利用基因芯片进行杂交测序的原理4 4 序列的组装4.1 随机测序与序列组装 随机测序也称”鸟枪法”. 序列组装原理:直接从已测序的小片段中寻找彼此重叠的测序克隆,然后依次向两侧邻接的序列延伸. 优点:不需预先了解任何基因组的情况.ABCABCABCABC小片段测序计算机拼装ABC小片段测序计算机拼装鸟枪法(Shotgun)测序的问题 CAATGCATTAGCAGCCAATGCGAP错装实例:流感嗜血杆菌基因组的测序及顺序组装超声波打断纯化的基因组DN

11、A 琼脂糖电泳收集1.62.0Kb的区段、纯化 构建到质粒载体中 随机挑选19687个克隆,进行28643次测序,得到可读顺序为11 631 485 bp 组装成140个覆盖全基因组范围的独立的顺序重叠群, 各重叠群间仍有间隙 顺序间隙 物理间隙 解决办法:通过相邻已知顺序作为探针筛选已有的基因组文库解决办法:利用其它宿主菌与载体重新构建文库限制测序 限制测序：是指将一段染色体区段的DNA 顺序进行组装. 一些已绘制了遗传图与物理图的微生物基因组测序中也采用这一方法. 如高等植物拟南芥基因组的测序完全依据克隆重叠群,先进行各个BAC克隆的随机测序,再进行序列组装； 水稻基因组测序计划采取得策略

12、与此相同.4.34.3 指导测序与序列组装 建立在基因组图谱基础上的”鸟枪法”,即所谓”指导鸟枪法”或”指导测序”。 在人类基因组进入测序组装阶段就采用此方法，其基本步骤如下: A 构建平均为2Kb的人类基因组质粒文库,进行双向测序; B 构建平均10Kb的人类基因组质粒文库,进行双向测序,读取2个端部顺序; C 参考人类基因组图,特别是大量的STS位标作为基点,进行序列组装，排成重叠克隆群. 先将染色体打成比较大的片段(几十-几百Kb), 利用分子标记将这些大片段排成重叠的克隆群(Contig), 分别测序后拼装. 这种策略叫基于克隆群(contig-based)的策略.ABCABC大片段c

13、ontig小片段测序拼装两种策略的比较鸟枪法策略 指导测序策略不需背景信息 构建克隆群 (遗传、物理图谱)时间短 需要几年的时间 需要大型计算机得到的是草图(Draft) 得到精细图谱其他测序路线 重要区域优先测序 人们对感兴趣的基因或与疾病相关的基因优先测序.如:人类主要组织相容性复合区位于第6号染色体,与人类免疫系统有关，因而优先测序. EST (Expressed sequence tag) 测序 EST是一种重要的基因组图分子标记,以EST为探针很容易从 cDNA文库中筛选全基因,又可从BAC克隆中找到其基因组的基因序列. 优点: A mRNA 可直接反转录成cDNA,而且cDNA文库

14、也比较容易构建; B 对cDNA文库大量测序,即可获得大量EST的序列; C EST为基因的编码区,不包括内含子和基因间区域,一次测序的结果足以鉴定所代表的基因;5.人类基因组计划 人类基因组计划（Human genome project）于1990年启动，我国于1999年加入该计划，承担其中1%的任务，即人类3号染色体短臂上约30Mb的测序任务。 5.1 人类基因组计划的目的 阐明人类基因组30亿个碱基对的序列，发现所有人类基因，并搞清其在染色体上的位置; 破译人类全部遗传信息，使人类第一次在分子水平上全面地认识自我; 解码生命、了解生命的起源、了解生命体生长发育的规律; 认识种属之间和个体

15、之间存在差异的起因、认识疾病产生的机制以及长寿与衰老等生命现象、为疾病的诊治提供科学依据。5.2 人类基因组草图的完成 2000年6月26日是人类历史上值得纪念的一天。人类基因组的工作草图已经绘制完毕并于这天向全世界公布。最终完成图要求测序所用的克隆能忠实地代表常染色体的基因组结构，序列错误率低于万分之一。A. Celera Genomics 人类基因组的测序策略随机测序与序列组装方法和指导测序与序列组装方法相结合进行序列组装B 国际人类基因组测序策略构建BAC克隆 限制性酶处理获得指纹 根据指纹重叠方法组建BAC克隆重叠群 根据STS标记,将BAC克隆重叠群标定在物理图上 每个BAC克隆内部

16、采用鸟枪法测序,组装 将BAC插入顺序与BAC克隆指纹极重叠群对比,将已阅读的顺序锚定到物理图上5.4 人类基因组测序结果 基因数是3万、4万还是10万 人类遗传基因数量比原先估计的少很多。目前研究表明，人类基因组中约有3万至4万个蛋白编码基因，仅仅是果蝇基因数目的两倍，人有而鼠没有的基因只有300个。此结论是由两大科研小组的数据是从DNA水平上得出的；而“人类有10万多个基因”则是从RNA水平上得出的结论。所以，这些数据不能推翻“人类有10万个基因”的说法。人类基因组研究的惊人发现 19号染色体是含基因最丰富的染色体，而13号染色体含基因量最少目前已经发现和定位了26000多个功能基因，其中

17、尚有42%的基因尚不知道功能人类基因组中存在“热点”和大片“荒漠”。在染色体上有基因成簇密集分布的区域，也有大片的区域只有“无用DNA” 不包含或含有极少基因的成分。基因组上大约有14的区域没有基因的片段。 353的基因包含重复的序列。这说明那些原来被认为是“垃圾”的DNA也起重要作用，应该被进一步研究。什么是单核苷酸多态性 人类999的基因密码是相同的，而差异不到01，不同人群仅有140万个核苷酸差异。这些差异是由“单一核苷酸多样性”（SNP）产生的，它构成了不同个体的遗传基础，个体的多样性被认为是产生遗传疾病的原因。在整个基因组序列中，人与人之间的变异仅为万分之一，从而说明人类不同“种属”

18、之间并没有本质上的区别。 5.5 人类基因组计划的意义 随着人类基因组逐渐被破译，一张生命之图将被绘就，人们的生活也将发生巨大变化。人类基因研究的意义在于它可以支持和推动生命科学中一系列重要的基础性研究。如基因组遗传语言的破译，基因的结构与功能关系，生命的起源和进化，细胞发育、生产、分化的分子机理，疾病发生的机理等。5.6 人类基因组计划的论理学6. 后人类基因组计划 伴随着人类基因组计划的迅速进展，基因的全序列逐步被完整的测出，会出现大量的不知道任何功能信息的序列。因此，在HGP完成之后，即全部人类基因被定序之后，还需要： 破解贮存于基因组之中的遗传语言; 识别、分离、鉴定和克隆所有基因；

19、搞清每个基因的功能及基因之间的相互作用和相互关系。7 水稻的基因组 2002年我国科学家完成了水稻基因组定序和初步分析。出人意表的是，水稻的基因竟比人类基因还要多得多。人类基因大约有3-4万个，水稻有46022-55615个基因。因此水稻基因组可说是继人类基因组之后，完成定序的最大基因组，也是至今已知最大的植物基因组。由于水稻是全球半数以上人口的主食，对解决全球粮食问题具有重要意义。本章要点 链终止法测序 人类基因组计划 了解其他基因测序方法和基因拼接方法第二讲 基因组序列诠释问题 基因组序列所包含的全部遗传信息是什么？ 基因组作为一个整体如何行使其功能？ 用什么方法寻找基因，研究基因地功能呢

20、？主要内容： 寻找基因 获取基因的全长cDNA序列 确定DNA顺序中基因的位置 研究基因的功能 基因表达 蛋白质组学1. 寻找基因1.1 根据开放读码框预测基因A 起始密码子 ATG 第一个ATG的确定则依据Kozak规则; Kozak规则是基于已知数据的统计结果，所谓Kozak规则，即第一个ATG侧翼序列的碱基分布所满足的统计规律. 若将第一个ATG中的碱基A，T，G分别标为1,2，3位，则Kozak规则可描述如下：(1)第4位的偏好碱基为G；(2)ATG的5端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基T；(3)在-3，-6和-9位置，G是偏好碱基；(4)除-3，-6和-9位，在整个侧翼序列区，C是

21、偏好碱基。 信号肽分析 信号肽分析软件(SignalP http:/www.cbs.dtu.dk/services/signalP ) 把预测过程中证实含完整mRNA 5端的Contig翻译为蛋白序列; 然后用SignalP软件对前50个氨基酸序列(从第一个ATG对应的甲硫氨酸Met开始)进行评估，如果SignalP分析给出正面结果，则测试序列有可能为信号肽; 假如在该测试序列的第一个Met 5端存在终止密码子，该序列为信号肽的可能性更大。B 终止密码子 终止密码子: TAA, TAG,TGA GC% = 50% 终止密码子每 64 bp出现一次； GC% 50% 终止密码子每100200 b

22、p 出现一次； 由于多数基因 ORF 均多于50个密码子，因此最可能的选择应该是 ORF 不少于100 个密码子。C 3端的确认 3端的确认主要根据Poly(A)尾序列,若测试Contig不含Poly(A)序列，则根据加尾信号序列“AATAAA”和BLAST同源性比较结果共同判断。Contig 重叠群，sts：sequence tags site D 非编码序列、内含子 高等真核生物多数外显子长度不少于100 个密码子，有的不到50个密码子甚至更少；E 密码子偏爱性 编码同一氨基酸的不同密码子称为同义密码，其差别仅在密码子的第3位碱基不同。 不同种属间使用同义密码的频率有很大差异，如人类基因中

23、，丙氨酸（Ale）密码子多为GCA,GCC或GCT,而GCG很少使用。F 外显子内含子边界 外显子和内含子的边界有一些明显的特征，如： 内含子的5端或称供体位（donor site）常见的顺序为 5AGGTTAAGT-3； 3端又称受体位（acceptor site), 多为5PyPyPyPyPyPyCAG-3(“Py”嘧啶核苷酸，T或C)；G 上游控制顺序 几乎所有基因（或操纵子）上游都有调控序列，它们可与DNA结合蛋白作用，控制基因表达。 另外个别生物的基因组特有组成也可作为判别依据，如脊椎动物基因组许多基因的上游都有CpG岛。 H 软件预测 采用NCBI的ORF预测软件 ( ORF fi

24、nder: /gorf/orfig.cgi )判断ORF的可能范围。1.2 mRNA的5端即转录起始位点区 通过同源性比较来预测mRNA的5端，最常用的与转录起始位点相关的数据库是真核启动子数据库(The TRADAT Project , Eukaryotic Promoter Database, EPD. http:/www.epd.unil.ch/ )。1.3 同源查询途径 通过已存入数据库中的基因顺序与待查的基因组序列进行比较，从中查找可与之匹配的碱基顺序及其比例，用于界定基因的方法称为同源查询。 同源有如下几种情况： A DNA序列某

25、些片段完全相同；B 开放读码框（ORF）排列类似，如有长外显子；C 开放读码框翻译成氨基酸序列的相似性；D 模拟多肽高级结构相似1.4 试验分析A Northern 杂交确定DNA片段是表达序列： 注意事项： a 当某一基因的转录产物进行可变剪接时，由于连接的外显子不同，会产生好几条长度不一的杂交带，如果该基因是某一基因家族的成员也会出现多个信息； b 考虑组织专一性和发育阶段的问题； C 基因表达产物丰度的问题 如果丰度较低，用拟Northern 杂交和动物园杂交（Zoo-blotting）分析。种属间印迹 拟Northern 杂交 根据已知的DNA顺序设计引物，从mRNA群体中扩增基因产物，再以DNA为探针与之杂交。 动物园杂交 根据亲缘关系相似的物种，其基因的编码区相似性较高，而非编码区的同源性很低的原理。如果某一物种的DNA 顺序与来自另一亲缘物种的DNA片段杂交产