单元三遗传物质的分子基础

1、单元三、遗传物质的分子基础单元三、遗传物质的分子基础本单元重点本单元重点 1核酸的化学结构（DNA、RNA）； 2原核生物和真核生物染色体的分子结构； 3DNA的半保留复制和特点； 4三种RNA分子的合成、转录及加工； 5遗传密码与蛋白质翻译。3-1 核酸的分子组成及结构核酸的分子组成及结构3-2 基因的表达基因的表达3-3 基因工程基因工程3-1 核酸的分子组成及结构核酸的分子组成及结构一、核酸的分子组成及结构一、核酸的分子组成及结构( (一一) ) 两种核酸及其分布：两种核酸及其分布：1.1.核酸：核酸：以核苷酸为单元构成的多聚体，是一种高分子化合物。 五碳糖：脱氧核糖、核糖核苷酸 磷酸

2、鸟嘌呤G、腺嘌呤A 环状的含氮碱基 胞嘧啶C、胸腺嘧啶T 或尿嘧啶U核酸有两种：脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。两种核酸的主要区别如下：DNA通常是双链一般较长。RNA主要为单链，分子链较短。图图 构成核苷酸分子的碱基和核糖构成核苷酸分子的碱基和核糖DNA 核苷酸五碳糖：脱氧核糖碱基：A、T、C、GRNA 核苷酸五碳糖：核糖碱基：A、U、C、GDNA四种脱氧核苷酸DNA分子2 2分布：分布：高等植物：DNA存在于染色体，叶绿体、线粒体中；RNA在核（核仁、染色体）、细胞质中。细菌：DNA和RNA。噬菌体：多数只有DNA。植物病毒：多数只有RNA。动物病毒：有些含RNA、有些含DNA

3、。( (二二 )DNA)DNA的分子结构：的分子结构：1. DNA双螺旋结构：1953年，沃森（Watson J. D.）和克里克（CrickF. H. C.）提出DNA双螺旋结构模型。主要依据为：碱基互补配对的规律以及DNA分子的X射线衍射结果。沃森和克里克与维尔肯斯(Wilkins)一起获得诺贝尔奖(1962) 。双螺旋结构的发现双螺旋结构的发现(1953)(1953)模型建立者: James WATSON:生物学家Francis CRICK: 化学家双螺旋模型实验数据的重要贡献者：Rosalind FRANKLIN: Kings Collage London的MRC生物物理单位物理化学家

4、，首先 将磷酸原子定位于DNA外表面并发现了“B” 型DNAMaurice WILKINS: “A” 型DNA的发现者电子显微镜下的人类DNA特点：特点：(1) 两条互补多核酸链、在同一轴上互相盘旋；(2) 双链具有反向平行的特点；(3) 碱基配对原则为：A=T、G=C，双螺旋直径约20A，螺距为34A(10个碱基对)。遗传信息载体：遗传信息载体： 脱氧核糖核酸（脱氧核糖核酸（DNA）双螺旋分子；长度单位：碱基对）双螺旋分子；长度单位：碱基对 (bp)，千碱基对千碱基对 (Kb)，百万碱基对，百万碱基对 (Mb)(4) A-T、G-C排列方法有以下四种：A-T G-C G-C A-TC-G A

5、-TA-T C-G设某一段DNA分子链有1000对碱基,则有41000种不同排列组合，就可能有41000种不同性质的基因。(5) (5) 物种：物种：同物种中的DNA的碱基含量不同：a. DNA分子上的碱基顺序是一致的，一般保持不变才能保持该物种的遗传特性的稳定；b在特殊条件下，碱基顺序改变，出现遗传变异。物种物种GACTA+G/T+CG+C/A+T人人小麦小麦洋葱洋葱菜豆菜豆酵母酵母大肠杆菌大肠杆菌T2噬菌体噬菌体19.923.8 18.420.6 18.3 26.0 18.2 30.925.6 31.8 29.7 31.7 24.7 32.519.8 24.6 18.220.117.4 2

6、5.7 16.829.4 26.0 31.3 29.6 32.6 23.6 32.51.03 0.97 1.01 1.01 1.00 1.02 1.020.660.940.580.69 0.56 1.07 0.542. DNA2. DNA构型：构型：B-DNA：生理状态下，每螺圈10.4个碱基对，右手螺旋；A-DNA：高盐浓度下，每螺圈11个碱基对，右手螺旋；Z-DNA：序列富含GC，嘌呤和嘧啶交替出现，每螺圈12个碱基对，左手螺旋。( (三三) RNA) RNA分子结构：分子结构： U代替T；与DNA的区别 核糖代替脱氧核糖； 一般以单链存在。( (四四) ) DNADNA的复制的复制1.

7、DNA复制的一般特点：(1) 半保留复制： 瓦特森(Watson J. D.)等提出的DNA半保留复制方式。其方法为：a. 一端沿氢键逐渐断开；b. 以单链为模板，碱基互补；c. 氢键结合，聚合酶等连接；d. 形成新的互补链；e. 形成了两个新DNA分子。 DNA的这种复制方式对保持生物遗传的稳定性是非常重要的。(2)复制起点和复制方向： 真核生物每条染色体的DNA复制都是多起点，多个复制起点共同控制整个染色体的复制；每条染色体有多个复制子；且为双向复制；2. DNA2. DNA复制过程复制过程1）DNA双螺旋的解链* DNA解旋酶在ATP供能下，每分钟旋转3000次解开双螺旋；* 单链DNA

8、结合蛋白马上结合在分开的单链上，以避免产生单链内配对；* DNA拓扑异构酶来解决由于复制叉的推进而产生超螺旋的问题。2） DNA合成的开始合成DNA片段之前，先由RNA聚合酶合成一小段RNA引物(约有20个碱基对) DNA 聚合酶才开始起作用合成DNA片段。3）后随链的不连续复制DNA聚合酶，以5 3 方向发挥作用；从3 5 合成方向的一条链，就会遇到困难。考恩伯格( Kornberg A., 1967)提出不连续复制假说：在3 5方向链上，仍按从5 3的方向一段段地合成DNA单链小片段“冈崎片段”(10002000bp) 由连接酶连接这些片段形成一条连续的单链。Helicase:解旋酶 pr

9、imosme复制叉结构复制叉结构: :图图 DNADNA合合成成模模型型 基因作为遗传信息单位，位于染色体上，控制生物的性状发育。 DNA是携带生物遗传信息的载体，是遗传的分子基础。 基因表达就是将基因携带的生物信息释放出来，供细胞利用的过程，或将生物的遗传信息作为性状或特征表现出来的过程。 通常所说的基因表达 指基因指导蛋白质合成的过程。 原核生物或真核生物为了适应外界环境条件及自身的需要，都必须不断调控各种不同基因的表达方式。 一、基因的概念及其发展：一、基因的概念及其发展：、经典遗传关于基因的概念： 孟德尔：把控制性状的因子称为遗传因子。如：豌豆红花(C)、白花(c)、植株高(H)、矮(

10、h)。 约翰生：提出基因(gene)这个名词，取代遗传因子。 摩尔根：对果蝇、玉米等的大量遗传研究，建立了以基因和染色体为主体的经典遗传学。基因是化学实体，以念珠状直线排列在染色体上。基因的共性基因的共性（按照经典遗传学对基因的概念）：（按照经典遗传学对基因的概念）： 染色体特性：自我复制能力和相对稳定性，在分裂时有规律地进行分配。 交换单位：基因间能进重组，而且是交换的最小单位。 突变单位：一个基因能突变为另一个基因。 功能单位：控制有机体的性状。经典遗传学认为：基因是一个最小的单位，不能分割；既是结构单位，又是功能单位。 分子遗传学关于基因的概念：分子遗传学关于基因的概念： 揭示遗传密码的

11、秘密：基因 具体物质。具体内容：一个基因 DNA分子上一定区段，携带有特殊的遗传信息 转录成RNA(包括mRNA、tRNA、rRNA)或对其它基因的活动起调控作用( 如调节基因、启动基因、操纵基因)。 基因不是最小遗传单位 更复杂的遗传和变异单位：例如：在一个基因区域内，仍可以划分出若干起作用的小单位。 现代遗传学上认为：现代遗传学上认为：突变子：指性状突变时产生突变的最小单位，一个突变子可以小到一个核苷酸对。如移码突变。 重组子：指发生性状重组时，产生重组的最小单位，可小到只包含一个核苷酸对。顺反子：就是一个基因，是一个完整的不可分割的功能单位。包括与一个多肽链的合成相对应的一段DNA，平均

12、大小为5001500bp,可有若干交换子和突变子。 基因概念：基因概念： 可转录一条完整的RNA分子或编码一个多肽链； 功能上被顺反测验或互补测验所规定。分子遗传学保留了功能单位的解释，而抛弃了最小结构单位说法。基因：相当于一个顺反子， 包含许多突变子和 重组子。 紫外灯下的紫外灯下的DNADNA二、遗传密码：二、遗传密码： 密码子与氨基酸密码子与氨基酸DNA分子碱基只有4种，而蛋白质氨基酸有20种。 碱基与氨基酸之间不可能一一对应。141=4种：缺16种氨基酸；242=16种：比现存的20种氨基酸还缺4种；343=64种：由三个碱基一起组成的密码子能够形成64种组合，20种氨基酸多出44种。

13、简并：一个氨基酸由二个或二个以上的三联体密码所决定的现象。三联体或密码子：代表一个氨基酸的三个一组的核苷酸。 遗传密码字典遗传密码字典每一个三联体密码所翻译的氨基酸是什么呢?从1961年开始，在大量试验的基础上，分别利用64个已知三联体密码，找到了相对应的氨基酸。19661967年，完成了全部遗传密码表，如UGG为色氨酸。遗遗传传密密码码字字典典 遗传密码的基本特征：遗传密码的基本特征：1遗传密码为三联体：三个碱基决定一种氨基酸；61个为有意密码，起始密码为GUG、AUG(甲硫氨酸)；3个为无意密码，UAA、UAG、UGA为蛋白质合成终止信号。2. 遗传密码间不能重复:在一个mRNA上每个碱基

14、只属于一个密码子；均以3个一组形成氨基酸密码。3.遗传密码间无逗号： AUG GUA CUG UCA 甲硫氨酸 缬氨酸 亮氨酸 丝氨酸 密码子与密码子之间无逗号，按三个三个的顺序一直阅读下去，不漏读不重复。 如果中间某个碱基增加或缺失后，阅读就会按新的顺序进行下去，最终形成的多肽链就与原先的完全不一样(称为移码突变)。 AUG （G） UAC UGU CA甲硫氨酸 酪氨酸 半胱氨酸4 4简并性：简并性： 简并现象：色氨酸(UGG)和甲硫氨酸(AUG)例外，仅一个三联体密码；其余氨基酸都有一种以上的密码子。 61个为有意密码，起始密码为GUG、AUG(甲硫氨酸)。3个为无意密码，UAA、UAG、

15、UGA为蛋白质合成终止信号。 简并现象的意义：同义的密码子越多，生物遗传的稳定性也越大。如：UCU 、UCC或UCA或UCG，均为丝氨酸。5 5遗传密码的有序性：遗传密码的有序性： 决定同一个氨基酸或性质相近的不同氨基酸的多个密码子中，第1个和第2个碱基的重要性大于第3个碱基，往往只是最后一个碱基发生变化。例如：脯氨酸（pro）：CCU、CCA、CCC、CCG。6 6通用性：通用性： 在整个生物界中，从病毒到人类，遗传密码通用。4个基本碱基符号所有氨基酸所有蛋白质 生物种类、生物体性状。 1980年以后发现：具有自我复制能力的线粒体tRNA(转移核糖核酸)在阅读个别密码子时有不同的翻译方式。如

16、：酵母、链孢霉与哺乳动物的线粒体。三、蛋白质的合成三、蛋白质的合成 DNA对性状的控制作用并不是直接的，遗对性状的控制作用并不是直接的，遗传密码到蛋白质的合成过程包括遗传密码的转传密码到蛋白质的合成过程包括遗传密码的转录和翻译两个步骤。录和翻译两个步骤。转录转录：就是以就是以DNADNA双链之一的遗传密码为模板，双链之一的遗传密码为模板，把遗传密码以互补的方式转录到把遗传密码以互补的方式转录到mRNAmRNA（信使核（信使核糖核酸）上。糖核酸）上。翻译：就是mRNA携带着转录的遗传密码，附着在核糖体上，把tRNA（转移核糖核酸）运来的各种氨基酸，按照mRNA的密码顺序，相互连接起来成为多肽链，

17、并进一步折叠起来成为立体蛋白质分子。 （一）（一）RNARNA的转录与的转录与RNARNA的种类的种类1.RNA1.RNA的种类的种类（1）信使RNA (messenger RNA，mRNA)（2）转移RNA (transfer RNA，tRNA)（3）核糖体RNA (ribosomal RNA，rRNA) 三种不同的RNA分子在基因的表达过程中起重要的作用。（1 1）信使）信使RNA (mRNA)RNA (mRNA)： mRNA的功能就是把DNA上的遗传信息精确无误地转录下来，然后，由mRNA的碱基顺序决定蛋白质的氨基酸顺序，是基因表达过程中遗传信息传递的中介。它起着传递信息的作用，因而称为

18、信使RNA (mRNA)。（2 2）转移）转移RNARNA（ tRNA) 如果说mRNA是合成蛋白质的蓝图，则核糖体是合成蛋白质的工厂。 由于合成蛋白质的原材料20种氨基酸与mRNA的碱基之间缺乏特殊的亲和力。 因此，必须用一种特殊的RNA转移RNA (tRNA)把氨基酸搬运到核糖体上，能根据mRNA的遗传密码依次准确地将它携带的氨基酸连结成多肽链。 每种氨基酸可与14种tRNA相结合，现在已知的tRNA的种类在40种以上。1969年以来，研究了来自各种不同生物，如：酵母、大肠杆菌、小麦、鼠等的十几种tRNA的结构，证明它们的碱基序列都能折叠成三叶草叶型(图)。tRNA是最小的RNA。其分子量

19、约为27000(2500030000)，由70到90个核苷酸组成。tRNAtRNA的结构的共性的结构的共性( (图图3 323)23)：(1)5端之末具有G(大部分)或C。(2) 3端之末都以ACC的顺序终结。(3) 有一个富有鸟嘌呤的环。(4)有一个反密码子环，其的顶端有三个暴露的碱基，称为反密码子。这一个反密码子可以与mRNA链上同自己互补的密码子配对。(5) 有一个胸腺嘧啶环。(3)(3) 核糖体核糖体RNARNA（rRNArRNA）核糖体RNA，它是组成核糖体的主要成分，而核糖体则是合成蛋白质的中心。原核生物的核糖体所含的rRNA，有5S、16S及23S等三种真核生物的核糖体，含有4种

20、rRNA和约80种蛋白质。四种rRNA为5S、5.8S、18S和28S。S为沉降系数(sedimentation coefficient)，当用超速离心测定一个粒子的沉淀速度时，此速度与粒子的大小直接成比例。rRNA是单链，它包含不等量的A与U、G与C，但是有广泛的双链区域。在双链区，碱基因氢鍵相连，表现为发夹式螺旋。rRNA在蛋白质合成中的功能尚未完全明了。但16S的rRNA3端有一段核苷酸序列与mRNA的前导序列是互补的，这可能有助于mRNA与核糖体的结合。核糖体 ：蛋白质翻译的场所 2.RNA 2.RNA 的转录的转录 转录 ATGCCGGTACGGGCAAATATGCCCATGCTAC

21、GGCCATGCCCGT TTATACGGGTACG转录因子转录因子以一条以一条DNADNA链为模板合成链为模板合成RNARNA尿嘧啶（尿嘧啶（U U）取代了胸腺嘧啶（）取代了胸腺嘧啶（T T） 首先是以首先是以DNA的一条链为模板合成与它互补的一条链为模板合成与它互补的的mRNA ，根据碱基互补配对的规律，根据碱基互补配对的规律，在这条在这条mRNA链上，链上，A变为变为U，T变为变为A，C变为变为G，G变变为为C。 因此，这条因此，这条mRNA上的遗传密码与非模板上的遗传密码与非模板DNA链是一样的，所不同的只是链是一样的，所不同的只是U代替了代替了T。然。然后再由后再由mRNA上的遗传密

22、码翻译成多肽链中的氨上的遗传密码翻译成多肽链中的氨基酸序列。基酸序列。（四）蛋白质的合成过程（四）蛋白质的合成过程蛋白质是由20种不同的氨基酸组成的多肽链，每种蛋白质都有其特定的氨基酸序列。遗传信息贮存于DNA里，由DNA所含的碱基序列决定氨基酸序列的过程即蛋白质的合成过程，也就是基因的表达过程，实际上包括遗传信息的转录和翻译两个步骤。蛋白质的合成，也就是遗传信息的翻译过程。翻译就是mRNA携带着转录的遗传密码附着在核糖体(ribosome)上，把由tRNA运来的各种氨基酸，按照mRNA的密码顺序，相互联结起来成为多肽链，并进一步折叠成为立体的蛋白质分子的过程。蛋白质合成的过程概述： 在核内以

23、DNADNA的一条链作为模板合成的不均DNADNA穿过核膜孔，进入细胞质后被酶切割成mRNAmRNA。然后核糖体的大小两个亚单位在起始密码子AUGAUG部位结合成一个核糖体，细胞质中的tRNAtRNA在激活酶和ATPATP的作用下，携带各自的氨基酸进入核糖体。最先进入的是携带甲硫氨酸的tRNAtRNA。因为它的反密码子UAIUAI和mRNAmRNA的密码子AUGAUG是对应的。同时第二个进入的携带有苏氨酸的tRNAtRNA，在核糖体中甲硫氨酸和苏氨酸结合，第一个tRNAtRNA释放，核糖体向右移动一个密码子距离，第三个进入的是携带有亮氨酸的tRNAtRNA，之后亮氨酸和苏氨酸相结合，第二个tR

24、NAtRNA释放。核糖体又向右移动一个密码子距离以此类推。当一个核糖体在mRNAmRNA上移动时，氨基酸就一个个地结合起来形成肽链。最后这个核糖体在mRNAmRNA的停止信号处脱落下来，分解为大小两个亚单位。把合成的肽链释放到胞质中，以后几个肽链结合起来折叠，形成一个具有空间结构的蛋白质分子，而且具有一定的生物学的功能。必须指出：在mRNAmRNA上，同时有许多的核糖体结合上去进行着蛋白质的合成，当第一个核糖体沿着mRNAmRNA的5353方向移动后，第二个核糖体又结合到mRNAmRNA上，以后第三个、第四个顺序结合上去，这样一串念珠就构成了多核糖体。一个多核糖体的核糖体数目的多少和要读出的m

25、RNAmRNA长度有关，读出的信息越长，用于翻译的核糖体数越多。一般5-405-40个，每个成员距离为50-100A50-100A。从而可见蛋白质的合成过程即是遗传密码的转录及翻译过程。翻译是指：mRNAmRNA携带着转录来的遗传密码附着在核糖体上，把由转移核糖核酸（tRNAtRNA）运来的各种氨基酸按着mRNAmRNA的密码顺序，相互连接起来成为多肽链，并进一步的叠起来成为立体蛋白质分子。蛋白的合成过程是mRNAmRNA，tRNAtRNA、rRNArRNA和核糖体协同作用的结果。图图 蛋蛋白白质质合合成成的的起起始始 图图 蛋白质合成的肽链延伸蛋白质合成的肽链延伸 图图 蛋蛋白白质质合合成成

26、的的终终止止 DNA RNA PROTEIN 表型表型 代谢问题 中心法则中心法则 生长、分化 个体发育 表型变异 中心法则中心法则四、中心法则及其发展四、中心法则及其发展修改后的中心法则修改后的中心法则反转录(逆转录)：反转录酶；cDNA。RNA的自我复制。DNA指导蛋白质合成五、基因的作用与性状表达五、基因的作用与性状表达 由于大部分遗传性状的表现都是在直接或间接的通过蛋白质表现出来的，因此深入的揭示Gene在这方面的作用对于了解Gene的在性状形成过程中的作用将是更有意义的事情，gene对遗传性状的表现作用可以分为以下两种：1 1直接作用直接作用 如果gene能直接的影响到形成某种蛋白质

27、的结构gene的作用，那么gene的变异可以直接的影响蛋白质的特性，从而表现出不同的性状来，例如人类镰形细胞贫血症，可以作为这方面的实例，正常人的红细胞是圆形，患有此病的人的红细胞呈镰刀形，这是由于一个正常gene所产生的两个不同的突变体所引起的，即由：HbAHbs，HbAHbC，从而引起此病，HbA,HbS,HbC三个gene所决定的血红蛋白区别在于链中第六位上有一个氨基酸的不同：具体情况如下：链上的氨基酸的号 1 2 36146正常的血红蛋白的氨基酸 缬 组 亮 谷正常氨基酸的密码 GAAHbS氨基酸的密码 GUA（缬）HbC氨基酸的密码 AAA（赖）每个血红蛋白分子具有4条链，链具有2条

28、，每条具有141个氨基酸，链具有2条，每条有146个氨基酸，可见决定谷氨酸上mRNA的密码GAA改变成GUA只是第2个碱基由AU，从而基因由HbAHbS，同理由GAA改写为AAA只是第一个碱基发生变化，从而gene由HbAHbC，可见只要gene中的一个碱基发生变化，就能引起最后产物血红蛋白性状的变化，从而导致患病，以上关于异常血红蛋白的产生，表明gene控制肽链的形成，因此一个gene一个多肽链的假说是有事实依据的，这是gene对性状表现的直接作用。HbA 突变 HbsHbc 镰刀形红血球血红蛋白分子有四条多肽链：两条链(141个氨基酸/条)、两条链(146个氨基酸/条)。HbA、Hbs、H

29、bc氨基酸组成的差异在于链上第6位上氨基酸：HbA第6位为谷氨酸（GAA)；Hbs第6位为缬氨酸（GUA)； Hbc第6位为赖氨酸（AAA）。 红血球碟形2 2间接作用间接作用 生物的性状是由gene控制的，但gene不等于遗传性状，从基因到表现型要经过一系列发育过程，任何性状都是gene控制下通过一系列发育过程才能形成的，也就是说必须经过一系列的代谢过程，每一个代谢过程必须有酶的催化，而酶又是一种特殊的蛋白质，它的合成是受gene控制的，绝大多数情况下gene都是通过酶的合成间接的影响性状表现的，例如有一种饲料作物白三叶草的某些品种的叶含有氰酸（HCN）易使牲畜中毒，据分析表明，氰酸的产生是

30、受l和H两个显性gene的互作来控制的，H、l gene分别来控制两种酶的合成，因而控制两种物质的转化过程，以致最后控制氰酸的合成。 研究表明只有两个gene都为显性状时才能通过酶的作用而顺利的合成氰酸，如果其中有一个或两个基因都为隐性时，即iiHH、IIhh、iihh引起有关的酶丧失作用，引起代谢过程的中断，不能合成氰酸，不会表现中毒的性状，依据许多的类似的实验，有人提出“一个gene一个酶的假说”，一个gene控制一种酶，同时又进一步的控制一个生化过程，从而影响到某一物质的合成，而导致某一遗传性状的表现。从现代的观点来看，一个gene一个酶的假说过于简单化，因为一种酶和一种蛋白质可能受到几

31、个基因的作用，新近认为“一个顺反子一个mRNA一条多肽链”的假说所代替更合情理。应该指出的是酶的合成与停止并不永远与gene的突变发生有联系的，由于存在有控制基因的作用，必须考虑到酶的合成与停止还要受gene的调控系统的作用。广义遗传工程包括: :生化工程、蛋白质工程、细胞工程、染色体工程、细胞器工程、基因工程及酶工程等。狭义遗传工程是指: :基因工程( (重组DNADNA技术) )。 一、基因工程概述一、基因工程概述: :2-32-3基因工程基因工程. .概念：概念：基因工程：在分子水平上，采取工程建设方式 按照预先设计的蓝图 借助于实验室技术将某种生物的基因或基因组转移到另一种生物中去 使

32、后者定向获得新遗传性状的一门技术。基因工程是采用分子生物学、核酸生物化学以及微生物遗传学的现代方法和手段建立起来的综合技术。 基因工程技术的建立，使所有实验生物学领域产生巨大的变革。 2. 2. 发展：发展：19711971年，SmithSmith等人从细菌中分离出的一种限制性酶，酶切病毒DNADNA分子，标志着DNADNA重组时代的开始。19721972年，BergBerg等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和l l噬菌体DNADNA，将两种DNADNA分子用连接酶连接起来 得到新的DNADNA分子。19731973年， CohenCohen等进一步将酶切后的DNADNA分子与质粒DNADNA连接起

33、来，并将重组质粒转入E. cloiE. cloi细胞中。19821982年，美国食品卫生和医药管理局批准，用基因工程在细菌中生产人的胰岛素投放市场。19851985年，转基因植物获得成功。19941994年，延熟保鲜的转基因番茄商品生产。19961996年，克隆羊诞生。19961996年全世界转基因植物种植面积为170170万公顷，19971997年为11001100万公顷，19981998年为27802780万公顷，19991999年达到39903990万公顷，20002000年达到44204420万公顷，20012001年达到52605260万公顷，20022002年达到50005000万

34、公顷。20012001年种植面积已超过年种植面积已超过100100万公顷的作物有：万公顷的作物有：大豆（33303330万hm2hm2，占全世界转基因作物的63%63%，均为抗除草剂大豆）、玉米（980980万hm2 hm2 ，占19% 19% ）、棉花（680680万hm2 hm2 ，占13% 13% ）、油菜（270270万hm2 hm2 ，5% 5% ）；其它还有水稻、小麦、花生、向日葵、亚麻、甘蓝、马铃薯等，番茄、烟草、南瓜和木瓜等5050多种转基因作物已实现商品化。主要分布在美国（35703570万hm2hm2）、阿根廷（11801180万hm2hm2）、加拿大（320320万hm2

35、hm2）和中国（150150万hm2hm2）等国。20012001年全世界转基因作物占相应种植总面积的百分率年全世界转基因作物占相应种植总面积的百分率 20012001年我国的转基因农作物和林木已达2222种，其中转基因棉花、大豆、马铃薯、烟草、玉米、花生、菠菜、甜椒、小麦等进行了田间试验，转基因棉花已经大规模商品化生产。3 3内容：内容： 从细胞和组织中分离DNADNA； 限制性内切酶酶切DNADNA分子，制备DNADNA片段； 将酶切DNADNA分子与载体DNADNA连接构建能在宿主细胞内自我复制的重组DNADNA分子； 把重组DNADNA分子引入宿主受体细胞复制； 重组DNADNA随宿主

36、细胞的分裂而分配到子细胞建立无性繁殖系(Clone)(Clone)或发育成个体； 从细胞群体中选出所需要的无性繁殖系并使外源基因在受体细胞中正常表达，翻译成蛋白质等基因产物、回收；或筛选出获得定向的性状变异的个体。4. 4. 基因工程的操作过程基因工程的操作过程 基因工程技术包括三个基本要素：载体、工具酶和表达系统（原核或真核宿主细胞），其技术路线大致包括以下几个操作程序：准备材料。包括载体和工具酶的准备以及目的基因的分离和制备；构建重组DNADNA分子。把目的基因与载体结合成重组DNADNA分子，即进行基因的体外重构；外源DNADNA导入受体细胞。把含外源DNADNA片段的重组DNADNA分

37、子引入宿主受体细胞，建立分子无性繁殖系；筛选重组DNADNA分子、鉴定目的基因表达。从细胞群体中选出所需要的无性繁殖系，并使外源基因在受体细胞中正确表达。( (一一) )准备材料准备材料1.1.工具酶工具酶工具酶指在重组DNADNA技术中用于切割、连接、修饰DNADNA或RNARNA的一系列酶。它们是基因工程中的基本工具，其中最重要的是限制性核酸内切酶和DNADNA连接酶，其它常用工具酶包括DNADNA多聚酶、反转录酶、核酸酶H H、碱性磷酸酶等。下面扼要介绍限制性核酸内切酶。 DNADNA是巨大分子，进行DNADNA操作时，必须加以切割，这就需要限制性核酸内切酶把DNADNA链在特定部位切断

38、。19701970年开始分离得到的限制性核酸内切酶，是开拓基因操作新领域的关键。限制性核酸内切酶能识别DNADNA的特定碱基序列，并把DNADNA链在特定位点切断。限制性内切酶的类别：限制性内切酶的类别：第类酶: :每隔一段DNADNA序列随机切割双链DNADNA分子，没有序列特异性, ,酶切位点不定。如EcoB(EcoB(大肠杆菌B B株) )、EcoK(EcoK(大肠杆菌K K株) )分子量较大( (约300000)300000)，作用时需ATPATP、Mg+Mg+等辅助因子。第类酶: :能识别一段特异的DNADNA序列，准确地酶切双链DNADNA的特异序列。如EcoRI(EcoRI(大肠

39、杆菌) )、Hind(Hind(嗜血杆菌) )，分子量较小( (约20000-100000)20000-100000)，作用时需MgMg2+2+存在。 2.2.载体载体载体（vectorvector）是指能将目的基因的DNADNA片段带入宿主细胞并能进行扩增的一类DNADNA分子。可作为DNADNA载体的有质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体（BACBAC、YACYAC）等。 作为运载工具，载体必须具备以下条件：在宿主细胞中能自我复制，并能稳定地保存；有多种限制性内切酶的切点，每种酶的切点最好只有一个，且酶切后并不损坏其复制能力及选择标志基因（gene markergene marker

40、）的能力，并能嵌入外源DNADNA片段；能较自由地进入受体细胞，实现转化； 具有可作为重组DNADNA分子选择的遗传标志。 目前作为转入原核细胞宿主的载体主要有两大类：-噬菌体和细菌质粒。而作为转入真核细胞宿主的载体，在动物方面主要有类人猿病毒SV40SV40（Simian Virus Simian Virus 4040），在植物方面主要有农杆菌的TiTi质粒。 质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNADNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体

41、。 （二）目的基因的分离：（二）目的基因的分离： 工具酶和载体备好了，下一步就是要获取目的基因。目的基因（targettarget）是指准备导入受体细胞内的、以研究或应用为目的所需要的外源基因。获得目的基因是进行DNADNA重组最重要的一步，也是十分困难的一步。 获得目的基因的方法很多， （1）可采用从生物基因组群体中分离目的基因。一般用限制性核酸内切酶把一个基因组DNADNA分成很多片段。原核生物基因组较小，基因容易定位，用限制性内切酶将基因组切成若干段后，直接用带有标记的核酸探针，从中选出目的基因。对于基因组较大的真核生物，则可先制作基因文库，然后钓取所需要的带有目的基因的DNADNA片段

42、而获得目的基因。 （2 2）人工合成目的基因DNADNA片段。人工合成目的基因DNADNA片段有化学合成法和酶促合成法两条途径。一般是采用DNADNA合成仪来合成长度不是很大的DNADNA片段。（3 3）PCRPCR技术合成DNADNA。聚合酶链式反应（polymerase polymerase chain reactionchain reaction，PCRPCR）是一种简单的酶促反应，它以DNADNA变性、复制的某些特性为原理设计的。通过PCRPCR技术获取所需要的特异DNADNA片段在实际应用用得非常多，但是前提条件是必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物。 现代分子生物学发展到今天，

43、人类基因组全序列已经测出，并且越来越多的模式生物的基因组全序列正在被测出，PCRPCR法已经成为分离目的基因的主要手段。 （三）构建重组（三）构建重组DNADNA分子分子 外源基因（DNADNA片段）很难直接透过受体细胞的细胞膜进入受体细胞，即使进入，也会受到细胞内限制性酶的作用而分解。要将外源DNADNA片段导入受体细胞，选择适当的载体是关键步骤之一。 含有目的基因的DNADNA片段和载体DNADNA的连接技术即DNADNA重组技术，其核心步骤是DNADNA片段之间的体外连接，其本质是涉及限制酶、连接酶等工具酶的酶促反应过程。重组DNADNA即将载体DNADNA与引入的DNADNA连接，把目

44、的基因连接到载体上去。根据DNADNA末端性质不同，形成重组体DNADNA分子的方法也有所不同。 1.1.黏性末端的连接。用同一种限制性内切酶或者用能够产生相同黏性末端的两种限制性内切酶分别消化外源DNADNA分子和载体，所形成的DNADNA末端彼此互补，用DNADNA连接酶共价连接起来，形成重组体DNADNA分子。2.2.平齐末端的连接。可先生成黏性末端，在带平头末端的DNADNA片段的3-3-末端加上多聚核苷酸的尾巴，在载体上加上互补的尾巴，然后用DNADNA连接酶连接。 ( (四四) ) 重组体的转化重组体的转化( (五五) )克隆子的鉴定克隆子的鉴定( (六六) ) 目的基因的表达目的

45、基因的表达二、基因工程的应用：二、基因工程的应用： 目前，基因工程研究发展迅速基因工程研究发展迅速，已取得一系列重大突破。基因工程技术已广泛用于工业、农业、畜牧业、医学、法学等领域，为人类创造了巨大的财富。具有生长激素的转基因鼠转基因的方法和技术 ： 基因工程工业：基因工程工业： 最早应用基因工程生产人的蛋白质的方法是在细菌中表达人的胰岛素在细菌中表达人的胰岛素(1982)(1982)。 胰岛素是一种控制糖代谢的蛋白质激素。不能产生胰岛素的患者会有糖尿病，患者必须每天注射胰岛素。 现已在细菌中生产1010多种医药产品医药产品，如表皮生长因子、人生长激素因子、干扰素、乙型肝类工程疫苗等。 有些真

46、核细胞真核细胞的蛋白质需要糖基化等修饰加工糖基化等修饰加工以后才具有活性，而细菌细胞缺少真核细胞的这些修饰系统真核生物细胞更适合于表达真核生物蛋白质基因。目前，酵母菌酵母菌、植物悬浮细植物悬浮细胞胞、植株和动物培养细胞植株和动物培养细胞成功地均应用于表达表达外源蛋白。 基因工程应用大肠杆菌生产人类生长激素 植物基因工程：植物基因工程：植物基因转化植物基因转化是指将外源基因转移到植物细胞内、并整合到植物基因组中稳定遗传和表达的过程。 许多植物基因已经被分离、克隆。植物基因转化技术也得到不断发展和完善。应用最多的为农杆菌转化法农杆菌转化法和和基因枪转化法。基因枪转化法。抗虫稻对照1.1.根癌农杆菌

47、转化技术：根癌农杆菌转化技术： 根癌农杆菌介导的植物转化是应用得最早而广泛的植物转化方法（双子叶植物、单子叶植物）。过程：将目的基因与启动子（花椰菜病毒35S35S）及终止子组成嵌合DNADNA分子插入到TiTi衍生质粒RBRB与LBLB内构成重组质粒 再转化到农杆菌细胞 将重组农杆菌去感染植物细胞 使质粒的部分DNADNA包括目的基因，整合到植物染色体，实现遗传转化。利用从抗草甘磷(glyphosate) (glyphosate) E. coliE. coli中分离克隆的EPSPEPSP合成酶基因，已培育出高抗除草剂转基因植物。 2. 2. 基因枪转化技术：基因枪转化技术： 基因枪介导的植物

48、转化是通过高压气体为动力，高速发射包裹有重组DNADNA的金属颗粒将目的基因直接导入植物细胞，并整合到染色体上的方法。 转化的载体多数是以pUCpUC系列质粒为基础构建的。它们通常具有细菌复制原点及抗性选择标记，具有可在植物中表达的启动子终止子及调控序列，以及植物抗性选择标记( (如除草剂、潮霉素等抗性) )。 几种基因枪类型的共同特点：共同特点：是用一种动力系统动力系统将金属微粒和包被DNADNA导入受体细胞或组织进行转化。1.1.位于高压气体桶底部的爆破片爆破片；2.2.载有重组DNADNA和金属微粒的大载体大载体；3.3.阻挡板阻挡板； 4.4.包裹有重组DNADNA的金金属微粒属微粒；

49、5.5.被轰击样品样品。 转基因动物转基因动物: : 与转基因植物相比，转基因动物的发展要慢些。转基因动物：转基因动物：目的基因+ +载体重组DNADNA微量注射法将重组DNADNA导入受体合子细胞核中遗传转化。如：利用转基因羊，大量表达人类的抗胰蛋白酶。抗胰蛋白酶。可分泌人类生长因子的转基因羊“PollyPolly”( (下图) )。(Wilmut(Wilmut等，Nature Nature 385, 1997)385, 1997)受精卵细胞注射受精卵细胞注射法法转基因牛：受精卵注射法转基因牛：受精卵注射法人类生长激素人类生长激素转基因猪转基因猪同胞鼠对照同胞鼠对照转移有人类生长激转移有人类

50、生长激素转基因鼠素转基因鼠 遗传疾病诊断：遗传疾病诊断：利用重组DNADNA技术进行遗传疾病诊断，是直接从DNADNA即基因水平进行诊断准确度高，速度快。如：镰刀性贫血病的诊断进行产前诊断，分析胎儿是否有遗传疾病。 基因治疗：基因治疗： 利用基因工程技术，将利用基因工程技术，将特异基因导入并整合到特异基因导入并整合到有遗传缺陷患者的基因组中有遗传缺陷患者的基因组中治疗遗传疾病，通治疗遗传疾病，通常叫做基因治疗常叫做基因治疗(gene therapy)(gene therapy)。方法：方法：利用利用减毒的病毒减毒的病毒DNADNA作载体作载体(retro virus (retro virus

51、DNA)DNA)构建重组构建重组DNADNA分子分子用病毒包装物包装后用病毒包装物包装后形成的减毒病毒感染患者的细胞形成的减毒病毒感染患者的细胞将正常基因整将正常基因整合到染色体上。合到染色体上。例如，例如，用漠洛尼氏鼠漠洛尼氏鼠白血病病毒(MLV)(MLV)改造而成的retro virus载体，已用于治疗严重综合免疫缺陷(SCID)(SCID)。SCIDSCID是由于腺苷脱氢酶基因腺苷脱氢酶基因( (adenosine deaminase，ADA)突变引起的，患者无任何免疫功能。方法：方法：将ADAADA基因导入到MLV retrovirus 载体中取代该病毒DNADNA中的三个基因结构(gag(gag、polpol、env)env)将重组后的病毒去感染T T细胞，使ADAADA基因整合到T T细胞的染色体中实现基因治疗的目的。20002000年