胞浆蛋白核蛋白膜蛋白抽提试剂盒(真核细胞)

1、胞浆蛋白 /核蛋白/膜蛋白抽提试剂盒 （真核细胞 ）(Catalog #DBI-1021 ; DBI-1022; Store kit at 4 C )描述 :本试剂盒提供了蛋白抽提试剂 A,蛋白抽提抽提试剂 B,蛋白抽提试剂C三种具有独特组分的缓冲液。所有试剂采用PIPES缓冲系统。通过实验,可以得到： 细胞胞浆蛋白（其中含有含有可溶性的骨架蛋白）； 细胞膜蛋白（其中包含细胞质膜蛋白和细胞器膜蛋白）； 细胞核蛋白；PAGE其最后剩余的沉淀为难溶性的胞质骨架和纤维蛋白。提取方法简单，可靠，快速。获得的各种部分蛋白纯度高，可用于 电泳、Western Blot、免疫共沉淀、EMS等后续研究。该试剂

2、盒所得到的蛋白溶液适合用 Bradeford法（DBI生物产品：DBI-1045,1046 ）蛋白定 量和BCA方法（DBI生物产品：DBI-1047,1048 ）进行定量。II 试剂盒组分 :III.蛋白质抽提步骤：A. 注意事项和试剂准备 : ? 打开试剂盒后，于 4度保存蛋白抽提液；于 -20度保存蛋白酶抑制剂，样品缓冲液（6 x）oA);加?使用前，加10ul的蛋白酶抑制剂于1ml蛋白抽提试剂A中，使成为蛋白抽提混合试剂 （该混合物被称为 Extraction Buffer Mix 2ul的蛋白酶抑制剂于200UI蛋白抽提试剂B中，使成为蛋白抽提混合试剂 ( 该混合物被称为 Extra

3、ction Buffer MixB);力口 2ul的蛋白酶抑制剂于200UI蛋白抽提试剂C中，使成为蛋白抽提混合试剂(该混C);合物被称为 Extraction Buffer Mix试剂盒组分DBI-1021 DBI-1022 包装50 次 100 次颜色蛋白抽提试剂蛋白抽提试剂A-1蛋白抽提试剂 蛋白抽提试剂 混合型蛋白酶抑制剂(100 X)SDS-PAGE样品缓冲液(6 X) 50ml500ul 50ml25ml 1支 5支 100ml 1000ul100ml 50ml 1支 10支棕色 棕色棕色 棕色 棕色 绿色? 在试验过程中确保抽提混合物始终保存在在碎冰中。? 需要自己提供的试剂：

4、90% acetone ， PBS抽提所使用的蛋白抽提试剂使用量 抽提步骤I. 准备细胞1. 将培养好的细胞用预冷的 PBS 清洗2-3 次。2. 选择合适的方法进行悬浮细胞和贴壁细胞的蛋白抽提： 如果样品为悬浮细胞；蛋白抽提试剂的使用量依赖于培养细胞的湿重或细 胞数量。a) 转移悬浮细胞培养液到一个预先称重的离心管中，简单的离心。b) 弃去上清培养基，称量其重量，计算出悬浮细胞的重量。c) 按照实验 II 进行下面的实验。如果样品为单层贴壁细胞：蛋白抽提试剂的使用量取决于培养细胞的器皿大小或细胞数量。a) 按照实验 III 进行下面实验。n.悬浮细胞蛋白抽提实验步骤 1. 吸取取 5 倍体积

5、细胞湿重的蛋白抽提试剂 A ，加入到已经清洗好的细胞 沉淀中。用移液器小心吹打，使细胞悬浮。2. 冰上孵育细胞，并且轻微振荡，时间为大约 10 分钟。使 95-100%的细胞胞浆流出细胞。注意：在实验过程中，每个步骤的时间要保持连贯性。3.以480g的离心速度，4度离心10分钟。4. 转移上清到一个干净的离心管中。记录上清的体积，此即为胞浆蛋白。（记为上清1）。于-70 C保存该样品。5.吸取取3倍体积细胞湿重的蛋白抽提试剂B，加入到沉淀中。用移液器小心吹打，使沉淀悬浮。6. 冰上孵育细胞，并且轻微振荡，时间为大约 30分钟。7.以5000g的离心速度，4度离心10分钟。8. 转移上清到一个干

6、净的离心管中。记录上清的体积，此即为细胞质膜蛋白。（标记为上清2）。于-70 C保存该样品。9. 吸取取 1.5 倍体积细胞湿重的蛋白抽提试剂 C，加入到沉淀中。用移液器小心吹打，使沉淀悬浮。. 漩涡混合器上高速振荡30 秒，或转移到玻璃匀浆器中高速匀浆 30 秒。10.以6780g的离心速度，4度离心10分钟。11. 转移上清到一个干净的离心管中。记录上清的体积，此即为细胞核蛋白。（标记为上清3）。于-70 C保存该样品。川.单层贴壁细胞的蛋白抽提对于贴壁细胞，用细胞刮将细胞刮掉，用PBS清洗细胞3次。600g，离心5分钟，收集细胞。下面实验适用于约5 X106个细胞。1.吸取取1ml的蛋白

7、抽提试剂A，加入到已经清洗好的细胞沉淀中。用移液器小心吹打，使细胞悬浮。2. 冰上孵育细胞，并且轻微振荡，时间为大约 10 分钟。使 95-100%的细胞胞浆流出细胞。注意：在实验过程中，每个步骤的时间要保持连贯性。3. 以480g的离心速度，4度离心10分钟。4. 转移上清到一个干净的离心管中。记录上清的体积，此即为胞浆蛋白。（ 记为上清1）。于-70 C保存该样品。5. 吸取取 500ul 蛋白抽提试剂 B ，加入到沉淀中。用移液器小心吹打，使沉 淀悬浮。6. 冰上孵育细胞，并且轻微振荡，时间为大约 30 分钟。7.以5000g的离心速度，4度离心10分钟。8. 转移上清到一个干净的离心管

8、中。记录上清的体积，此即为细胞质膜蛋白。（标记为上清2）。于-70 C保存该样品。9. 吸取250UI蛋白抽提试剂C,加入到沉淀中。用移液器小心吹打，使沉淀悬浮。悬浮。 . 漩涡混合器上高速振荡 30 秒，或转移到玻璃匀浆器中高速匀浆 30秒。10. 以6780g的离心速度，4度离心10分钟。11. 转移上清到一个干净的离心管中。记录上清的体积，此即为细胞核蛋白。（标记为上清3）。于-70 C保存该样品。W.蛋白浓度测定可使用BCA定量法（DBI-018 ）和Bradford（DBI-016） 进行蛋白浓度测定。具体程序请参照相关说明书。该试剂盒所获的的相关部分蛋白质是进行后续实验的最佳蛋白来源。1. 该试剂盒所获的的相关部分蛋白质浓度很高，可以用相关的缓冲液进行稀 释使用，