伪狂犬检测报告共15资料

1、伪狂犬检测报告一例猪伪狂犬病毒病的诊治报告龙源期刊网一例猪伪狂犬病毒病的诊治报告作者：覃国喜来源：中国动物保健2019年第09期猪伪狂犬病的致病源为I型疱疹病毒，是一种急性传染病。多会 引起母猪的繁殖障碍，仔猪的急性死亡，侵害多种组织器官的恶 心疾病。怀孕母猪感染该猪伪狂犬病毒后，可导致母猪流产，临 床上常见的流产的胎儿有死胎、木乃伊胎及弱仔等；对已顺利降 生、母原抗体不高的仔猪可造成大批急性死亡，临床常见的症状 有呕吐、震颤、腹泻及运动失调等临床症状；耐受猪易产生免疫 抑制，增加了猪只感染其它疾病的风险，影响仔猪生长发育。研究表明，发病的猪、潜伏感染排毒的猪为本病重要传染源。除 此之外，实验

2、动物中兔、小鼠、大鼠、豚鼠等也是猪伪狂犬病毒 的贮存宿主，引起该病的发生与流行。笔者将成功治疗的一例猪 伪狂犬病诊疗过程记叙如下，旨在为广大兽医工作者提供借鉴。1发病情况介绍广西奥猪场，存栏猪 1 000余头。4月5日，猪场内由现新生仔 猪大量死亡，新生仔猪生生第一天表现正常，第二天开始发病， 体温41c以上，精神极度萎顿，身体发抖，运动不协调，死亡高 峰期由现在发病后的 35 d内。明显的神经症状是该病的主要临床症状，一旦发病，12 d内死亡。新生仔猪的发病死亡率可达100%。断奶仔猪也有发病，主要表现为神经症状、拉稀、呕吐等，死亡率在10%。怀孕母猪发生流产、产木乃伊胎儿。2病例变化及实验

3、室检测对病死猪及濒死猪进行了解剖，眼观病变主要有肾脏有针尖状由血点，脑膜明显充血，有些在肝、脾等脏器常可见灰白色坏死病灶。脑、脾、肝等器官取样进行实验室的细菌学和猪伪狂犬病毒（PRV）、猪乙型脑炎病毒（JEM、猪细小病毒（PPV）、猪蓝耳病 病毒（PRRSV、猪瘟病毒（CSFV的检测。无菌采取病料后直接涂片、革兰氏染色、镜检后未发现有细菌； 同时对病料在血琼脂平板培养，37 C培养24 h未见有细菌增殖，排除了该病由细菌引起。对所采取的病料进行RCR/RT-PCR佥测，在病猪的脑组织中检测到 PRV的核酸物质（见 图1）,而在其他组织均为检测到 PPM JEV PRRSV CSFV等病毒 的核

4、酸物质。3诊断结果根据疾病的临诊症状，流行病学及实验室检测结果，确定该猪场发生了由PRV病毒引起的猪伪狂犬病毒。4治疗及预防措施篇二：猪伪狂犬病野毒抗体不同检测单位的比对试验龙源期刊网猪伪狂犬病野毒抗体不同检测单位的比对试验作者：孙华宋忠旭曾德芳等来源：湖北农业科学2019年第24期摘要：在种猪群伪狂犬病野毒(gE)抗体监测的第一阶段，进行 了不同检测单位的比对试验。对来自71个个体间隔1周的两次血清样本进行检测，2个检测机构之间的gE抗体阳性符合率分别为 35.71%、 45.45%,总体检测符合率分另I为87.32%、 91.55%; 2个检测机构各自的gE抗体阳性符合率分别为40.00%

5、、75.00%,总体检测符合率分别为 87.32%、97.18%。表明在猪群进行伪狂犬病野 毒感染鉴定的初期，有必要对检测单位进行筛选。关键词：伪狂犬病毒(Pseudorabies virus PRV);野毒抗体；对 比试验中图分类号：S828文献标识码：A文章编号：0439-8114 (2019) 24-6124-02伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus PRV)引起的多 种动物共患传染病，以发热、奇痒(猪除外)及脑脊髓炎为主要 症状1。猪感染伪狂犬病毒后主要表现为母猪流产、死胎等繁殖 障碍2,哺乳仔猪尖叫、腹泻和转圈、大量发病死亡，保育猪神 经症状，育肥猪呼吸道症状

6、、生长发育缓慢。猪伪狂犬病对养猪 生产的影响很大，给中国的养猪业特别是集约化养猪造成了巨大 经济损失3。国家生猪产业技术体系疫病控制研究室“十二五”重点任务“伪 狂犬病、猪瘟净化与蓝耳病综合防控”中要求，在伪狂犬病净化任务结束时，参与试验的种猪场（或生产线）应全部为野毒 gpI （gE）抗体阴性。根除和净化措施分为普查、强化免疫控制、检测淘汰、全群清群与引种、监测认证与维持等5个阶段，在实施过程中，检测结果将影响净化的具体方案和实施细节。本研究在 种猪群伪狂犬病野毒感染状况监测的第一阶段，进行了猪伪狂犬 病野毒抗体不同检测单位检测结果的比（转 载于：xIeLw写 论文网:伪狂犬检测报告）对试验

7、，现将试验情况及建议报告如下，以供养猪生产中猪群伪狂犬病等疾病检测、净化时参考。1材料与方法1.1试验动物与试剂试验猪为湖北省农业科学院实验原种猪育种场基础母猪520头，种公猪19头，自繁自养。gE基因缺失弱毒疫苗（K-61株自然缺 失基因苗），德国柏林格茵格翰公司。后备猪在70日龄和配种前各免疫1次，种母猪每年普免 3次，普免时避免在分娩前 7 d内 接种，以减少接种应激对分娩的影响，并在母猪分娩后补免；公 猪采用集中普免的方式，每年免疫3次。篇三：伪狂犬病检测方法十一、伪狂犬病检测方法伪狂犬病病毒分离鉴定1材料准备DMEM培养基、BHK-21细胞、新生犊牛血清、青霉素、链霉素 溶液、0.2

8、2川微孔滤膜、细胞培养瓶、CO2培养箱、倒置显微镜。溶液配制见附录 A（标准的附录）2操作步骤2.1 病料的采集对于刚死亡或活体送检并处死的动物，无菌采取肝、脾、肺、肾及其脑组织，尤其是三叉神经节、嗅球，4C送实验室检测。2.2 样品处理待检组织在灭菌乳钵内剪碎，加入灭菌玻璃砂研磨，用灭菌生理盐水或DME培养基制成1: 5孚齐，一70C反复冻融后，经 3000rpm离心30分钟后，取上清液经 0.22以m微 孔滤膜过滤后，加入青链霉素溶液至最终浓度为100U/mL , 一 70 c保存作为接种材料。2.3 病料接种 将病料滤液接种已长成单层的BHK-21细胞，接种量为培养基量的10%, 37c

9、恒温箱中吸附1小时后，加入含10% 新生犊牛血清（经过 56 c水溶灭活30分钟，过滤除菌，无支原 体）的DMEM培养基，置 37c温箱中培养。2.4 观察结果 接种后2448小时，BHK-21细胞应由现典型的 细胞病变效应（Cyto pathogenic effect, CPB ,表现为细胞变圆, 脱落。如第一次接种不由现CPE；应将细胞培养物冻融后盲传三代，如仍无CPE,则判为伪狂犬病病毒阴性。2.5 病毒的鉴定将由现CPE的细胞培养物反复冻融后，用聚合酶链式反应、荧光抗体试验等两种方法中任一方法作进一步鉴定。伪狂犬病聚合酶链式反应1材料准备：待检组织、组织匀浆器、蛋白酶K,十二烷基磺酸钠

10、（SDS）,苯酚、氯仿，异戊醇（分析纯）、TEN缓冲液。溶液配制 见附录C柝准的附录）引物：扩增伪狂犬病病毒基因中434651bp之间217bp基因片段，由上海生物工程公司合成。序歹U为，上游引物 P1: 5' -CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3 下游引物 P2: 5' -GTCCACGCCC-CGCTTGAAGCT-3仪器设备有：凝胶电泳紫外线检测仪，PCRT增仪，电泳仪2操作步骤：2. 1样品的采集：对于病死或扑杀动物，取脑组织；对于待检 活猪，用已灭菌的棉签，伸入猪鼻腔中，采取鼻粘液，即为鼻拭 子，冷藏条件送实验室检测。2.2 样品处理 所采病料经组织研磨器充

11、分研磨，按 1:5用TEN 缓冲液悬浮收集于离心管内，-70C反复冻融3次，7000r/min离心5min,如样品为鼻试子，则加入 2ml TEN缓冲液，充分挤压， 取由棉签，7000rpm,离心5分钟，取上清液。取上清液472.5以l,加入25以l 10%SDS和2.5以l的20mg/ml蛋白酶 K, 50 c水浴摇 床上放置2h后加入等量的饱和酚 500以l,涡旋20s。离心取上清 液，加等量的酚：氯仿：异戍醇（25:24:1）抽提一次，再用氯仿： 异戍醇（24: 1）抽提一次，最后用乙醇沉淀，真空抽干后加入 20以l双蒸水溶解，-20 C贮存备用。2.3 . PCR的操作程序 先将制备的

12、模板 DNA置100c水浴10分 钟作变性处理，,然后立即放于冰浴中。PCR反应体系为：总体积25 以 l,含有 50m ?mol/L KCl,10m mol/L Tris-HCl ( pH 9.0), 0.1 % Triton X-100? ?100?以 mol/L dNTPs, 0.35 以 mol/L 引物，2 m mol/L MgCl2,及 0.5U Taq 酶,1 以 l 模板 DNA。常用的反应体系组成如下10X缓冲液2.5以l15mM MgCl22.5 以 ldNTPs 2.0 以 l引物各2.0以lTaq聚合酶1.0以lDNA模板2.0以l灭菌去离子水 11.0以l矿物油约20

13、以l扩增条件为：94C变性3分钟，进入循环，94c 60秒，65c 60秒， 72c 60秒，40个循环后72c延伸5分钟。2.4 PCR产物的检测PCR扩增产物在1 %的琼脂糖凝胶上电泳， 澳 化乙锭染色，在紫外光下观察结果。为进一步进行PCR扩增产物的特异性鉴定，可取PCR产物用Sall酶切，酶切产物在 2%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外光下观察并与标准分子量比较， 可见产生的140bp和77bp两个片段。伪狂犬病荧光抗体试验1材料准备：碳酸盐缓冲甘油、磷酸盐缓冲液、丙酮(分析纯) ， 伪狂犬病荧光抗体、冰冻切片机，荧光显微镜。溶液配制见附录D（标准的附录）2操作步骤2. 1样品采集扑

14、杀可疑动物，取大脑、淋巴结、扁桃体迅速送 检实验室，如不能及时送生，必须冻结保存，避免腐败、自溶。本法也可用于对疑似伪狂犬病病毒的培养物进行鉴定。2. 2切片制备 将样品组织块切成 1cm x 1cm的面，不经任 何固定处理，直接贴于冰冻切片托上，进行切片，切片厚度要求57um,将切片展贴于 0.8mm x 1mm厚的洁净载 玻片上。2. 3固定：将切片置纯丙酮中固定15分钟，取由立即放入0.01mol/L, pH7.2 的磷酸盐缓冲液中，轻轻漂洗 34次，取由，自然干燥后尽快进行荧 光抗体染色。2. 4染色 将伪狂犬病荧光抗体滴加于切片表面，置温盒内于37 c作用30分钟，取由后放入磷酸盐缓

15、冲液中充分漂洗，再用 0.5moL/L, pH9.09.5碳酸盐缓冲甘油封固盖片（0.1mm厚），染色后应尽快镜检，必要时可放置低温待检。2. 5观察将染色后的切片标本置激发光为蓝紫光或紫外光的 荧光显微镜下观察。2. 6判定：于荧光显微镜视野中，见细胞中由现明亮的黄绿色 荧光，判为伪狂犬病病毒感染阳性。伪狂犬病微量中和试验（固定病毒，稀释血清法）1材料准备0. 25%胰酶（配制见附录B）、BHK-21细胞，多道可调微量移液器，,96孔细胞培养板，CO2培养箱,倒置显微镜。2操作步骤2.1 病毒半数组织细胞感染量（TCID50）的测定：2.1.1 病毒培养和收获将伪狂犬病毒接种于长成单层的BH

16、K-21细胞，接种量为液体培养基量的10%,37c培养，待由现病变后，冻融，收获病毒。2.1.2 病毒的滴定用DMEM培养基将伪狂犬病病毒作连续 10倍 稀释，即101、102?强个稀释度取100以L加入96孔细胞培 养板中，随后加入经 0.25%胰酶消化的BHK-21细胞100以L （细胞 含量以105/mL左右 为宜），每个稀释度作8个重复，并设空白细 胞培养对照。置 37 C 5%CO2培养箱中。2.1.3 TCID50计算 逐日观察细胞病变，并记录细胞病变孔数， 直到对照细胞老化脱落为止。按照Reed-Muench法计算病毒的TCID50 （具体的计算示例见附录B） o2.2 中和试验

17、 将无菌采集的待检猪血清置 56c水溶灭活30分 钟。用DMEM培养基作倍比稀释，在细胞培养板各孔中加入50以L培养基，随后在第一孔中加入经待检猪血清 50以L混合后，用 微量移液器取由50以L,加到第二孔中，混匀后取由50以L再加入 第三孔中，依此类推。血清稀释度即为 1: 2、1: 4、1: 8?,每 份待检血清稀释度作 24个重复。将50以L含200个TCID50的病毒液加入到不同稀释度血清孔中，37 c作用1小时，每孔中再加入100以L经胰酶消化分散的 BHK-21细胞，同时设病毒对照、 阳性血清、阴性血清，待检血清、正常细胞对照。2.3 计算抗体中和效价逐日观察，直至细胞对照由现老化

18、脱落为 止，按Reed-Muench两氏法，计算抗体中和效价。如抗体效价为 1: 2及1: 2以上，则判为伪狂犬病抗体阳性。伪狂犬病酶联免疫吸附试验（间接法）1材料准备：抗原、酶标抗体，底物（OPr H2O2）,酶联免疫检测仪；溶液配制见附录F标准的附录）2操作步骤：2.4 包被 将PRV抗原加入酶标板孔内，每孔100uL, 37c作用1h后置4c冰箱过夜。2.5 洗涤 弃去孔内液体，用洗涤液洗3次，每次3min,用吸水 纸拍干2.6 封闭 各孔加入封闭液100uL 37c作用1h。按2.2步骤洗涤2. 4 加入待检血清 待检血清经56oC30分钟灭活将待检血清用 洗涤液稀释，每孔100uL,

19、 37c作用1h。重复2.2步骤。2. 5加入酶标抗体用洗涤液将酶标抗体按工作浓度稀释，每孔100uL, 37c作用1h。重复2.2步骤。2. 6 加入底物（OPD-H22）:每孔100uL,室温避光显色 25分 钟。2. 7 终止反应 每孔加入50uL终止液终止反应。2. 8测定OD值在酶联免疫检测仪上 490nm波长处读数。2.9血清阴阳性判定标准的确定取60份经中和试验检测为 PRV抗体阴性的猪血清，按1:20稀释后进行间接 ELISA试验，测定490nm波长处OD值，规定以60份血清的平均 OD值加上3倍标 准差作为判定阴阳性的临界值。伪狂犬病乳胶凝集试验1材料准备：伪狂犬病乳胶凝集抗

20、原、伪狂犬病阳性血清、阴性 血清、稀释液，玻片，溶液配制见附录E（标准的附录）2操作步骤：2. 1待检血清不须经热灭活或其它方式的灭活处理2. 2将待检血清用稀释液作倍比稀释后， 各取15以L与等量乳胶 凝集抗原在洁净干燥的玻片上用竹签搅拌充分混合，在35分钟内观察结果；可能由现以下几种凝集结果，即：100%凝集：混合液透亮，曲现大的凝集块75%凝集：混合液几乎透明，曲现大的凝集块50%凝集：约50%乳胶凝集，凝集颗粒较细25%凝集；混合液浑浊，有少量凝集颗粒0%凝集：混合液浑浊，无凝集颗粒由现如由现50%凝集程度以上的（含 50%凝集程度），判为伪狂犬病 抗体阳性，否则判为抗体阴性。如为阴性

21、，可用微量中和试验进一步检测。 伪狂犬病琼脂扩散试验1材料准备琼脂扩散抗原、阴性血清和阳性血清； 优质琼脂粉、平皿2操作步骤2. 1 0.8%琼脂板的制作将1克琼脂粉溶于100毫升Tris-盐酸缓冲液（Tris 6.5 克，NaCl2.9克，NaN3 0.2克，蒸储水 1000毫升，用HCl调pH值至7.2）中， 趁热倾倒于玻璃平皿上，厚度为23mm,待冷却凝集后，打孔，中央一孔，周围 6孔，孔径为2mm,周围孔之间距离 2mm,周 围孔与中央孔间距为 4mm 6mm,用酒精灯微热封底。2. 2加样 将琼脂扩散抗原加到中央孔中，周围孔加经热灭活 的待检血清，设阴性血清和阳性血清对照。置温盒37

22、c作用，24一48小时后观察结果。2. 3结果判定 在抗原孔与待检血清孔之间由现白色沉淀线， 抗体可判为阳性；如待检血清抗体水平较低，可以观察到与待检 血清相邻的阳性血清沉淀线末端略向抗原抗弯曲。阴性血清与抗 原孔之间则没有沉淀线。伪狂犬病区分强弱毒感染鉴别乳胶凝集试验1 .猪伪狂犬病gG鉴别诊断乳胶凝集试验伪狂犬病gG鉴别诊断乳胶凝集试验是用伪狂犬病毒gG基因的基因工程表达产物致敏乳胶抗原来检测动物血清、全血或乳汁中抗gG蛋白的抗体。用于伪狂犬病毒感染猪与gG基因缺失疫苗注苗猪的免疫学鉴别诊断。1. 1材料准备：伪狂犬病毒 gG蛋白致敏乳胶抗原、伪狂犬病毒致敏乳胶抗原、伪狂犬病毒阳性血清和注

23、射 gG基因缺失疫苗血清、玻片、吸头等。1. 2操作步骤1. 2. 1对照试验检测之前应做对照试验，由现如下结果试验方 可成立，否则应重试，如重试仍不由现如下结果则停止使用：伪 狂犬病毒阳性血清加 gG蛋白致敏乳胶抗原呈阳性凝集；注射 gG 基因缺失疫苗血清加 gG蛋白致敏乳胶抗原呈阴性凝集； 伪狂犬病 毒阳性血清与注射 gG基因缺失疫苗血清加伪狂犬病毒致敏乳胶 抗原均呈阳性凝集。1.2. 2检测试验1. 2. 2. 1待检血清不须经热灭活或其它方式的灭活处理1 . 2. 2. 2待检血清一滴，置于玻片上。加 gG蛋白致敏乳胶抗 原一滴，用牙签混匀，搅拌并摇动 1-2分钟，于3-5分钟内观察结 果（注：gG蛋白致敏乳胶抗原与血清反应