代谢工程改造黄酒酿造用酵母低产氨基甲酸乙酯的研究

1、代谢工程改造黄酒酿造用酯母低产氨基甲酸乙酯的研究氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,简称EC)是存在于黄酒中的潜在致癌物，黄酒中EC含量偏高的问题由来已久，是我国黄酒的一个重要安全隐患。在黄酒发酵 过程中，受氮代谢阻遏效应(Nitrogen catabolite repression, 简称NC做应) 的影响,EC前体物一一尿素在发酵液中的过量积累是形成 EC的主要原因。因此，通过降低发酵液中的尿素含量，可以减少黄酒中EC的形成。本研究以 用于黄酒生产的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae N85为研究对象，通过代谢 工程改造敲除酿酒酵母精氨酸酶编码基因CAR1以

2、及高效表达月尿基酰胺酶编码基因DUR1,2,阻断了工程菌N85DUR1,2-由勺尿素生成途径并强化其尿素的降解途径， 减少了黄酒发酵过程中尿素的积累和EC的形成。在黄酒厂进行了工业化生产试验，并考察了工程菌的生长和发酵性能。此外， 本研究通过代谢工程改造研究了酿酒酵母瓜氨酸代谢途径对黄酒中瓜氨酸和EC含量的影响。(1)通过敲除工业黄酒酵母 S.cerevisiae N85 的HO基因以及单倍体抱子分 离，获得了不同结合型(a型和a型)的单倍体菌株，利用Cre/loxP系统切除了 HO 基因敲除组件带入单倍体基因组的抗性基因KanMX最终获得了不含外源抗性基因且不能发生接合型转变的酿酒酵母单倍体

3、菌株。并通过敲除URA3K因构建了尿喀噬缺陷型单倍体突变株，为后续的基因工程改造提供了出发菌株和筛选标记。利用“自克隆”代谢改造方法，构建了 CAR狱失的杂合工程菌N85-c1 和纯合工程菌N85-c20黄酒发酵实验表明，工程菌N85-c1与亲本菌株N85发酵 液中尿素和EC的含量相当，分别为35.8 ±1.5 mg - L-1和21.2 ± 0.6仙g L-1。而工程菌N85-c2黄酒发酵液中尿素和EC的含量分别为4.9 ±0.3 mg - L-1和10.3 ±0.4 g - L-1,较亲本菌株N85分别降低了 86.9% 50.5%。说明黄酒中绝大部

4、分的尿素是由酿酒酵母代谢精氨酸产生的，而且酿酒酵母的单个CAR1等 位基因表达的精氨酸酶足以降解精氨酸生成大量的尿素，形成数量可观的EG（3）分别以酿酒酵母N85和N85-C2的单倍体为出发菌株，通过高效表达 DUR1,2基因，构建了纯合工程菌 N85DUR1口 N85DUR1,2-g黄酒发酵实验表明， 纯合工程菌N85-C2、N85DUR1窗口 N85DUR1,2-c发酵液中尿素的含量较亲本菌株 N85分另I降彳氐了 86.9%、75.6%?口 89.1%,EC含量分另降彳氐了 50.5%、40.0%?口 55.3%。说明通过代谢工程改造降低黄酒发酵液中尿素含量的两条途径（敲除CAR1 基因

5、一一阻断尿素的生成或高效表达 DUR1,2-一强化尿素的降解）中，敲除CAR1 的策略更为有效，基结合两个代谢改造策略构建的工程菌一一N85DUR1,2-c降低 黄酒发酵液中尿素的含量并减少 EC形成的效果最佳，发酵液中尿素和EC的含量 仅为4.7 ± 0.5 mg - L-1和19.6 ± 2.0仙g L-1,而且遗传稳定性好，具有工业化 应用的潜力。（4）工程菌在偏好型氮源培养基中对尿素积累和代谢的研究表明，代谢工程改造不仅阻断了工程菌 N85DUR1,2-cft成尿素的途径，而且DUR1,2勺高 效表达也缓解了发酵液中谷氨酰胺、谷氨酸等偏好型氮源对其利用尿素的抑制作

6、用。所以在黄酒发酵过程中，工程菌N85DUR1,2-d勺DUR1,2®因的转录和表达不 受氮代谢阻遏效应的影响，能够有效地降低发酵液中尿素的含量，从而减缓了尿 素与乙醇反应生成EC的速率，达到减少EC形成的目的。（5）通过敲除鸟氨酸氨甲 酰转移酶编码基因ARG3及高效表达精氨基琥珀酸合成酶编码基因 ARG和精氨 酰琥珀酸裂解酶编码基因ARG4#察了酿酒酵母瓜氨酸代谢途径对发酵液中瓜 氨酸和EC含量的影响。黄酒发酵实验表明,敲除ARG3勺工程菌N85-arg3与亲本菌株N85发酵液中 瓜氨酸和EC的含量基本相同，说明酿酒酵母的瓜氨酸合成途径不是黄酒发酵液 中瓜氨酸的主要来源。高效表达

7、ARG体口 ARG4勺工程菌N85ARG1,琳口 N85ARG1,4-arg3发酵液中瓜氨酸的含量分别降低了 24.1喷口 20.4%,但是工程菌 N85ARG1,琳口 N85ARG1,4-arg3发酵液中EC的含量分别增加了 23.8喷口 28.5%。说明单纯通过强化酿酒酵母对瓜氨酸的利用来降低黄酒发酵液中EC含量的效果不明显。(6)通过单因素实验考察了黄酒发酵工艺对工程菌降低尿素和EC能力的影响，结果表明，酵母接种量、发酵温度以及麦曲添加量等工艺参数对工程 菌N85DUR1,2-c低产尿素和EC的性能没有明显的影响。500 L黄酒放大实验表明，工程菌N85DUR1,2-c与亲本菌株N85发

8、酵过程中 酒精度、总糖、氨基酸态氮以及总酸等理化指标含量的变化趋势基本相同，发酵结束时，发酵液中常规理化指标含量正常，说明工程菌N85DUR1,2-"E接近工厂 生产条件的情况下发酵正常。而 N85DUR1,2-c发酵液中尿素和EC的含量分别为 3.0mg - L-1 和 16.6 N g L-1,较亲本菌株 N85 降低了 91.5%?口 55.7%。(7)在工厂进行的50 kL生产试验表明，工程菌N85DUR1,2-c成品黄酒中酒精 度、总糖、总酸等理化指标含量正常，除异戊醇和异丁醇含量较低以外，其他风味 物质的含量与亲本菌株N85基本没有差异，符合黄酒国标的要求。工程菌 N85DUR1,2-c发酵液中尿素和 EC的含量分别为2.4 ±0.2 mg - L-1和14.9 ±0.6 g L-1,较N85菌株分别降低了 90.7%?口 54.6%,且贮存