12基因工程的基本操作程序

1、 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取一、目的基因的获取( (一一) )、目的基因主要是、目的基因主要是_编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因请举出三个以上的例子请举出三个以上的例子（二）、获取目的基因的常用方法有哪些（二）、获取目的基因的常用方法有哪些? ?1 1、从基因文库中获取、从基因文库中获取2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增技术扩增3 3、人工合成、人工合成请阅读请阅读P8P8、9 9第一和二两段第一和二两段一、目的基因的获取一、目的基因的获取（一）从基因文库中直接获取（一）从基因文库中直接获取1.1.基因文库：基因文库：概念见概念见P9P92.2.基因文库

2、的分类基因文库的分类: :按外源按外源DNADNA片段的来源分类片段的来源分类种种类类基因组基因组DNA文库：文库：含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因部分基因文库：部分基因文库：只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分部分基因，基因， 如：如：cDNA文库文库3.3.基因文库的目的基因文库的目的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。目的基因。4.4.获取目的基因的根据：获取目的基因的根据： 见课本见课本P9提取某生物提取某生物全部全部DNA用适当用适当限制酶切割限制酶切割许许 多多DNA片段片段与载体连接与载体连接导入受

3、体菌群导入受体菌群该生物基该生物基因组文库因组文库（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）与载体连接与载体连接导入受体菌群导入受体菌群mRNA逆转录酶逆转录酶杂交双链杂交双链核酸酶核酸酶H单链单链DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNA(cDNA)该生物该生物cDNA文库文库1 1、 概念概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 通过这项技术可在通过这项技术可在短时间内大量扩增目的基因短时间内大量扩增目的基因 因为整个过程是在体外进行，所以又叫做因为整个过程是在体外进行，所以又叫做体外体外DNADNA扩增技术。扩增技术。聚合酶链式反应聚

4、合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段2 2、原理：、原理： DNADNA复制复制二、利用二、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸( (dNTPdNTP) ) 一对引物一对引物：热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶( (TaqTaq酶）酶）模板模板DNA( DNA( 需需含有目的基因含有目的基因 ) ) 一对寡核苷酸序列：与目的基因一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补的起始段互补一段已知目的基因的核苷酸序列，以便一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物根据这一序列合成引物温度控制温度控制5 5/ /3 3/ /GGGGTCTC

5、3 3/ /5 5/ /GAGACCCC5 5/ /3 3/ /引物引物GGGG变性变性复性复性延伸延伸1、变性、变性(90-95度度)：目的基因：目的基因DNA受热变性，解链为单链；受热变性，解链为单链；2.复性（复性（55-60）：引物与两条单链通过碱基互补配对原则结合；）：引物与两条单链通过碱基互补配对原则结合；3.延伸（延伸（70-75）：在）：在DNA聚合酶（聚合酶（Taq酶）作用下，从酶）作用下，从5端端3端端进行延伸。进行延伸。5 5/ /3 3/ /AGAG引物引物5、扩增过程、扩增过程利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因PCRPCR技术扩增过程技术扩增过程a

6、a、DNADNA变性（变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下， 断裂，形成断裂，形成_ _ b b、复性（复性（55-6055-60）：系统温度降低，引物）：系统温度降低，引物 与与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、延伸（延伸（70-7570-75）：在）：在TaqDNATaqDNA聚合酶的作聚合酶的作用下，从引物的用下，从引物的_延伸，合成与延伸，合成与模板互补的模板互补的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链5端端3端端DNA合成仪合成仪推推测测推推测测合合成成质粒质粒目的基因目的基因限制酶限制

7、酶DNA连接酶连接酶重组重组DNA1.1.用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。2.2.用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。 核心核心3.3.将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处， 再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同( (二二) )基因表达载体的构建基因表达载体的构建基因表达载体的构建基因表达载体的构建核心核

8、心质粒质粒DNADNA分子分子一个一个切口切口两个两个黏性末端黏性末端两个两个切口切口获得目的基因获得目的基因DNA DNA 连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种 限制酶限制酶 科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能

9、力。 基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：目的：使目的基因在受体细胞中稳定存目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。的基因能够表达和发挥作用。a、目的基因、目的基因b、启动子、启动子c、终止子、终止子d、标记基因、标记基因知识点一：知识点一：1.1.原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构非非编码区编码区非非编码区编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子启动子：启动子：位于基因首端一段能与位于基因首端一段能与RNARN

10、A聚合酶结合并能起聚合酶结合并能起始始mRNAmRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。终止子：终止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片断，它能片断，它能阻碍阻碍RNARNA聚合酶的移动，并使其从聚合酶的移动，并使其从DNADNA模板链上脱离下来，模板链上脱离下来，使转录终止。使转录终止。RNARNA聚合酶聚合酶: :能够识别启动子上的结合位点并与其结合能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质的一种蛋白质.(.(以模板转录然后脱落以模板转录然后脱落) )不能转录为信使不能转录为信使RNARNA，不能不能 编

11、码蛋白质。编码蛋白质。：能转录相应的信使：能转录相应的信使RNARNA，能能 编码蛋白质编码蛋白质 编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞的的 基因基因结构结构有调控遗传信息表达的核有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中，苷酸序列，在该序列中， 最重要的是位于编码区上最重要的是位于编码区上 游的游的RNARNA聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。非非编码区编码区非非编码区编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 启动子启动子终止子终止子编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 能够编码蛋白质的

12、序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内不能够编码蛋白质的序列叫做内含子含子启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子：内含子： 外显子：外显子： 知识点一：知识点一：2.2.真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构真核真核细胞细胞的的 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显外显子：能编码蛋白质的序列子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的包括位于编码区上游的RNARNA 聚合酶结合位点等。聚合酶结合位点等。原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码