细胞融合操作规程1

1、 细胞融合 一、 实验材料 手术剪，镶子，离心机，蜡盘等。 二、 实验所配试剂 1640根底培养液：取一包 1640干粉，溶于1000 mL双蒸水中， 慢慢参加2.5 g NaHCOs,0.22叩滤膜过滤除菌，分装，4C冰箱保存 备用。 青链霉素溶液(100X)：取青霉素100万单位和链霉素1 g,无 菌溶于100mL已灭菌的三蒸水中，0.22 滤膜过滤除菌，1 mL/管 分装，-20 C冻存备用。 1640完全培养液：向1640根底培养液中参加10%的小牛血清和 1%青链霉素溶液(100X)(为养成良好的操作习惯，建议不加最好)， 摇匀，4C冰箱保存备用。 HT培养液：在100 mL含15%

2、血清的1640完全培养液中参加 1 mL 100X的HT溶液，摇匀，4 C冰箱保存备用。 HAT培养液：在100 mL含15%血清的1640完全培养液中参加 2 mL 50X的HAT溶液(使用前HAT有局部白色沉淀应充分混匀)，摇 匀，4 C冰箱保存备用。 GNK 溶 液 ： 准 确 称 取 KCL 0.4g , NaCL 8g , Na2HPO4 2H2O 1.77g(N&HPO412H2O 3.56g), NaJPO4 H2O 0.69g(NaH2PO4 2H2O 0.78g),酚红0.01g,葡萄糖2g,加DDW 定容至1000mL,调节pH值 至7.2, 115C高压灭菌，4C

3、保存备用。 三、实验步骤 1. 免疫小鼠 选择6-8周龄的Balb/c雌性小鼠进行免疫，免疫剂量 50 只， 皮下注射。免疫程序如下： 首次免疫：100 L抗原+100止弗氏完全佐剂/只 加强免疫：100 L抗原+100 gL弗氏不完全佐剂/只，于首免后2 周后进行。共免疫3次，每次间隔2周。第二次免疫后的第十天断尾 采血一般尾部采血4止，溶于200止PBS混匀备用检测效价，如 果效价很低或没有效价，建议直接放弃，不用继续再免疫。如果效价 可以，在二免后的2周进行三免，最后一次免疫10天后，断尾采血， 用适当的抗原进行包被，用间接 ELISA检测抗体效价，效价到达 1:1600以上即可进行细胞

4、融合。 超强免疫：最后一次加强免疫后 2周，细胞融合前35天，尾静 脉或腹腔注射50纯抗原。 2. 饲养细胞的制备 融合前1-2 d制备饲养细胞。取昆明鼠1只致死收集小鼠血清， 以供筛选时用该血清做阴性对照，75%酒精消毒体表，无菌手术剪 刀轻轻剥去小鼠的腹部皮肤，以防止剪破腹膜，暴露腹膜。然后用 5mL注射器和16号针头将5mL预冷的HAT打入小鼠腹腔，轻轻压挤 腹部，重新吸出注入的液体在吸取过程中为防止污染， 防止针头刺 破肠管，收取小鼠腹腔巨噬细胞。用 HATW释至40ml, 100uL/孔添 加到4块96孔细胞培养板中，置37C 5% CQ培养箱中培养，第二 天检查有无污染情况。 3.

5、 细胞计数 为保证NS0细胞在融合时到达最正确状态和局活力，建议在融合 时前一天给所需的每瓶 NS0细胞换液，以备融合时使用。 80%左右NS0的细胞计数(三次平均数)：(11.6X 105+9X 105+3.7 x 105) /3=8.1 x 105/mL 脾细胞计数6.5X 106/mL,大约是40mL有2.6 x 108个细胞，两次计 数相差不大，所以脾细胞数可固定为 2.6 x 108个/40mL。 NS0细胞计数： 3.7 x 105 个/mL (70% 9X 105个/mL (80% 11.6 x 105个/mL (90% 脾细胞计数: 4. 细胞融合 在40C水浴中预热 GNK溶

6、液、PEG和HAT溶液； 免疫小鼠采血并别离血清，然后致死浸泡到酒精中； 收集NS0细胞于50 mL离心管中为保证高融合率建议大于 4瓶 90%的NS0细胞，1000 r/min离心10 min,弃上清，用GNK洗一次； 5小鼠脾细胞的制备 依次剪开小鼠皮肤，腹膜暴露腹腔建议为防止污染，建议至少 用两套手术刀具，一套用于剥开小鼠外部皮肤和腹膜， 另一套用于取 出小鼠脾脏，取脾脏放置与尼龙纱布上充分研碎，并用 GNK洗下 去，收集脾细胞于50 mL离心管中，1000 r/min离心10 min,弃上清， 打散细胞团； 将脾细胞与NS0骨髓瘤细胞混合于50 mL离心管中，加GNK溶 液至40 mL

7、, 1000 r/min离心10 min,弃上清，打散细胞团充分打 散细胞团，以保证融合时的高融合率； 为保证融合时的温度可以事先将混匀好的细胞在 40 C水浴预热两 分钟，然后在另一刚取出的40C水浴烧杯中做融合，用1mL或大于 1mL吸管将预热的50%PEG pH8.0滴加到融合管中，边加边轻轻 摇动融合管， 1min或80s内加完，并继续在水浴中缓缓摇动融合管 1.5min。立即缓慢滴加37C预热的GNK溶液15mL。参加步骤为：1 mL/30s, 3 mL/30s , 11 mL/30s。然后慢慢补加 GNK 溶液至 40mL, 37C水浴静置 5min, 1000 r/min离心10

8、 min,弃上清。 打散细胞团，力口 40mL HAT完全培养具吹打混匀，加到含饲养细 胞的96孔细胞培养板上，每孔100L，置37C 5% CO2培养箱中培 养。 克隆细胞的筛选、转孔及亚克隆 一、 融合细胞的培养 1、 融合后的细胞置于 CO2培养箱中培养，次日检查有无污染， 如发现污染立即滴加1%的NaOH。 2、 一般2 3d可见小克隆；7d时于出现克隆的孔内半量换液注 意：37 C预热HAT培养基； 3、 10d左右可以吸取少量上清用于筛选一般吸取 50 100 L, 并补加等量的HAT培养基换液时应轻柔，以减少对克隆细胞的损 伤； 4、 14d左右对所筛选的阳性孔可半量更换 HT培

9、养基，同时对筛 选阳性孔的细胞转至24孔培养板中扩大培养，准备克隆化。在筛选 过程中将HAT培养基逐渐更换为完全培养基 RPMI1640/10。 二、 筛选 (1) 包被。将抗原以pH 9.6的NaCO3-NaHCO3包被，每块酶标板以 5-20ug抗原为宜(如果抗原为多肽或小分子物质，那么需要加大包被量， 如果是纯化病毒根据病毒的浓度做 1:400-1000倍稀释)。每孔的包被 体积为50ul。37C包被2h或4C包被过夜。 (2) 封闭。倒掉抗原，拍干酶标板孔内液体， 5%脱脂牛奶(PBST 溶解) 或其它无关物种血清于 37C封闭2h,封闭完后可立即使用， 也可以洗涤一次置于4C密封保存

10、以备后面使用。 (3) 一抗。封闭完后，弃去孔内液体，拍干，用封闭液 1:1稀释待 检测克隆孔上清，每孔 50ul为宜。同时做阳性(融合小鼠血清 1:500-1000倍稀释)和阴性(所制备饲养细胞小鼠血清1:200倍稀释) 及空白对照(所稀释抗体用封闭液) 和无克隆孔上清对照。在每块板 子上做好标记。37 C孵育30min。 (4) 二抗。孵育完一抗后，弃去孔内液体，拍干，以 PBST洗涤3 次，每次5min。根据二抗说明稀释二抗至适当比例，每孔参加 50ul, 37C 孵育 30min。 (5) 显色。孵育完二抗后，弃去孔内液体，拍干，参加显色剂，37C 显色5-10min,拍照记录检测结果

11、，筛选出阳性较强的克隆进行特异 性检测。 三、特异性筛选 对筛选的强阳性克隆孔进行特异性筛选，如果是用大肠杆菌表达 的蛋白，可以用载体蛋白、正常大肠杆菌上清以及其它无关蛋白进行 包板检测；如果是细胞毒免疫的可以用正常细胞的裂解液包板检测； 如果是组织毒免疫的可以用正常动物组织包板检测。其检测方法同 上，注意设立对照组。同时对筛选的特异性较强的阳性孔转至 24孔 培养板中扩大培养，准备克隆化。 四、 阳性细胞的转孔 1、 为保证转孔成功，建议当 96孔板细胞长至80%时转孔。 2、 按常规方法转孔前一天制备饲养细胞， 24孔板每孔参加0.5-1ml 的饲养细胞悬液，第二天检查有无污染情况。 转孔

12、时所用培养基和 转孔前所用培养基应保持一致。 3、 收集待转孔的阳性细胞上清，做好标记保存备用，添加已预热的 HAT和HT培养基1:1混合因此时96孔板克隆已半量过度到 HT 培养基各100ul/孔。 4、 用200ul移液器轻轻吹下细胞，为减少对克隆细胞的刺激，吹打 过程应轻柔，然后将细胞悬液参加至 24孔板中，为保证细胞均匀分 布到板底，可以用振荡器轻轻混匀，做好标记。同时，对所转孔细胞 补加新的培养基，保存原始孔以防止转孔失败。 五、 转孔后的检测 当转孔后细胞长至50%时，用ELISA检测方法及时进行效价检 测和特异性检测，检测方法同上，筛选出效价高和特异性较强的准备 亚克隆。同时在筛

13、选过程中对24孔板的细胞逐步更换至1640完全培 养基。 六、 杂交瘤细胞的克隆 为保证克隆细胞的活性和数量，建议当待克隆的细胞孔长至80% 时进行有限稀释。提前一天制备饲养细胞，收集待转孔细胞的培养上 清保存备用，参加已预热1640不完全培养基1ml 其目的是该孔细 胞被有限稀释后可以冻存该孔细胞。冻存方法为：直接吸取 500 ul 该孔细胞悬液，再参加 400 ul胎牛血清和100 ulDMSO混匀，1ml/ 管，做好标记，按照正常程序冻存细胞，轻轻吹打混匀细胞，取出 少许细胞悬液 进行计数，采用有限稀释法对阳性孔的融合细胞进行克 隆化。其步骤如下： 1、 用10ul台盼蓝和10ul细胞悬

14、液于PCR管中等比例混合后， 在显微镜下进行活细胞计数根据公式：细胞数 /mL = N/4 x 103 X 10 X稀释倍数N为显微镜下四角4个大方格的活细胞总数来计算每 毫升细胞悬液所含的活细胞数，然后取适量的细胞悬液，用 1640培 养基此时24孔板克隆细胞过度到那种培养基就用那种培养基做有 限稀释稀释到10mL,并且要含有2X 103个活细胞稀释度I; 2、 取1mL稀释度I的细胞悬液加 9mL1640完全培养基 稀释 度II； 3、 取3mL稀释度n的细胞悬液加 7mL1640完全培养基 稀释 度m; 4、 用稀释度I的细胞悬液铺板半块 96孔板，100四孔，20个 细胞/孔；用稀释度n的细胞悬液铺板另半块 96孔板，100此/孔，2 个细胞/孔；用稀释度山的细胞悬液铺一块 96孔板，100 gL/孔，0.6 个细胞/孔； 5、 将上述培养板置于CO2培养箱中培养，培养7d后，对单克隆 孔进行标记并半