人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒说明书0001

1、人类EGFR基因突变荧光 PCR检测试剂盒说明书【产品名称】通用名称：人类 EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒英文名称：Shuwen ? Human EGFR Gene Mutation Detection Kit for Real-Time PCR【包装规格】7测试/盒【预期用途】EGFR是一种细胞膜表面的糖蛋白受体，具有酪氨酸激酶( Tyrosine Kinase , TK)活性，是原癌基 因c-erbB-1 ( HER-1 )的表达产物。EGFR 的主 要信号转导途径有：PI3K-PDK 通路， RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK 通路,PLC- 丫通路,JAK-STAT 通路。

2、通过这些途径，将胞外信号转化 为胞内信号，从而有效应对外界的信号刺激，调节细胞的生长、增殖、分化，抑制细胞的凋亡。EGFR异常调节通过多种机制促进细胞恶性转化，包括受体的过度表达、突变、生长因子-受体自分泌环的活化以及特定的磷酸酶失活，其中涉及肿瘤发生和进展的机制中最常见的是EGFR的基因突变和过度表达。EGFR基因位于7号染色体短臂7Pl2-14区，由28个外显子组成。其突变主要发生在EGFR酪氨酸激酶 的ATP结合位点的编码区(第18-20外显子)，研究表明，EGFR酪氨酸激酶抑制剂(例如吉非替尼、厄 洛替尼和埃可替尼等)疗效与EGFR基因的突变有密切的相关性。目前已经报道大约有30种突变

3、与吉非替尼的药物反应相关，主要是19外显子上的缺失突变和 21外显子上的L858R的点突变。外显子19上747-750 位氨基酸的大约20种缺失约占所有突变的 45% ,其中以两种delE746-A750(2235_2249del15 和 2236_2250del15)最为常见，占到外显子19缺失总数的75% ;外显子21上L858R的点突变占所有突变的45%左右；外显子18的3种点突变(G719X )约占5%;外显子20的突变占1%左右。另外研究发现外显子 20上的T790M突变与酪氨酸激酶抑制剂药物的耐药性相关。本试剂盒以肿瘤DNA为检测样本，提供EGFR基因突变的定性检测。本试剂盒仅为临

4、床医生肿瘤靶向 治疗药物的选择提供参考，具体临床应用时须结合实际情况进行判断，不能以本试剂盒检测结果作为临床 诊断的唯一依据。【检测原理】本试剂盒结合特异性引物和 TaqMan探针技术，用实时荧光 PCR方法检测DNA样品中的EGFR突变基 因。利用特异性引物对突变靶序列进行扩增，同时阻滞野生型的扩增，通过 TaqMan探针对扩增产物进行 检测，使得突变基因得到扩增而野生型基本不扩增，从而达到高检测特异性和高灵敏度。【主要组成成分】本试剂盒具体包含组分如表 1表1编号组分份数体积(l L)119-Del (1)检测反应液1150219-Del (2)检测反应液11503S768I检测反应液11

5、50420-Ins检测反应液11505T790M检测反应液11506L858R检测反应液11507L861Q检测反应液11508G719X检测反应液1150外控检测反应液1150r-Taq 酶130阳性对照DNA1100无菌超纯水1500【储存条件及有效期】避光，-20 C以下保存，避免反复冻融 （不要超过5次），有效期6个月。【适用仪器】ABI 7300 , ABI 7500 , ABI 7900 , ABI StepOne , ABI StepOne Plus , Rotor-Gene Q【样本要求】本试剂盒可以检测从新鲜组织及 FFPE组织中提取的DNA , DNA质量及浓度影响检测的特

6、异性和灵敏 度。DNA的质量与样本保存时间、样本组成、DNA提取方法密切相关；而且所采集的临床样本中正常组织细胞的混杂程度也不同，因此对样本做如下要求：1、新鲜标本的制备过程中，术后标本取下后应立即放入-20 C以下冰箱中保存；石蜡包埋组织制备过程中， 术后标本应在1个小时内放入10 %中性缓冲福尔马林溶液中固定，用量应为组织块的4-20倍，固定时间应在6-48 小时之间；2、新鲜组织样本，要确保含有肿瘤细胞大于1%,尽量减少正常组织、间质及坏死组织，推荐使用商业化试剂盒提取DNA（AXYGEN , QIAGEN等公司产品）。提取的DNA用分光光度计检测DNA纯度， A260/A280 在1.

7、6-2.0之间，如果不能立即检测请置于 -20 C保存。3、 FFPE组织样本，要确保含有肿瘤细胞，尽量去除坏死组织及石蜡边缘，推荐使用商业化试剂盒提取 DNA（QIAamp DNA FFPE Tissue Kit） 。提取的 DNA 用分光光度计检测 DNA 纯度，A260/A280 在 1.6-2.0之间，如果不能立即检测请置于 -20 C保存。FFPE组织样本保存年限尚未超过 3年。4、 样本切片规格要求为：横切面面积至少6m mx 6mm厚度10 v m, 3片，如果切片面积小请适当增加切片数。最终提取的DNA用100 gL-200 g L水溶解，分光光度计检测浓度后，稀释或浓缩成5-

8、 10ng/ l Lo【检验方法】本试剂盒可以进行5人份的检测反应，并为每个样本额外提供一个参照基因扩增反应，用于估测样本实际DNA的浓度。建议每批次实验都检测一个阳性对照（positive control） 和一个无模板阴性对照（NTC）。建议根据实验条件进行分区操作，如样品处理区，反应液配制区等。具体操作步骤如下： 1.将试剂盒中所有组分冰上融化，涡旋混匀并短暂离心，放置于冰上。注意：试剂盒中的所有试管在开盖前均应短暂离心，以免粘在管口或管盖上的试剂在开盖时被污染。2. 每批实验根据待检测样本数、一个阳性对照、一个阴性对照，同时计算并分别配制1-8号反应液。每个反应液所需反应数 =待测样本

9、数 +2 （一个阳性对照、一个阴性对照），而每个反应所需反应液19.7 l L,需r-Taq酶0.3 l L,即从1-8号反应液中分别取（19.7 X反应数）l L于对应编号的1.5EP管, 再分别加入（ 0.3 X反应数）g r-TLq勺酶。注意：由于取样误差，请根据情况适当多配置 0.3个反应 即可。3. 将配制好的混合液轻轻充分混匀,并按照每管20 g L分装到每伸CR反应管中。4. 然后向每个反应管中加入 5VL待检狈DNA、或阳性参照、或水（试剂盒提供）。待检测样本最佳浓度范围为5ng/ gi10ng/ g L,即每个反应管中有效DNA总量为25-50ng 。5. 短暂离心消除反应管

10、中的气泡，将PCR反应管放入PCR仪。样本在PCR反应板中的布局可参见表 2表2 建议布局突变19-del(1)19-del(2)S768I20-InsT790ML858RL861QG719X外控1样品1样品1样品1样品1样品1样品1样品1样品1样品12样品2样品2样品2样品2样品2样品2样品2样品2样品23样品3样品3样品3样品3样品3样品3样品3样品3样品34样品4样品4样品4样品4样品4样品4样品4样品4样品45样品5样品5样品5样品5样品5样品5样品5样品5样品56STDSTDSTDSTDSTDSTDSTDSTDSTD7NTCNTCNTCNTCNTCNTCNTCNTCNTC6. 打开操

11、作软件，设置PCR扩增程序为Stagel : 95 5minStage2 : 95 20s , 57 C 2s , 5个循环Stage3 : 95 C 20s , 60 C 2S , 40 个循环 收集 FAM 信号注：如果使用 ABI定量PCR仪，将"Passive Reference "设置为" None" ,"reporter ”设置为“FAM' , " quencher ” 设置为 “ TAMRA'【参考值】检测结果19-del(1)19-del(2)S768I20-In sT790ML858RL861QG71

12、9X阳性CT<28CT<28CT<3CT<2CT<2CT<2CT<2CT<2808889阴性CT> 28CT> 28CT>CT>CT> 2CT>CT>CT >230288282981. 当样品CT值大于或等于阴性临界值时，则该样品为阴性或低于本试剂盒的检测下限。2. 当样品CT值小于阴性临界值时，则该样品为阳性。表3结果判定【实验结果的解释】1. 阈值设定：针对ABI7500机型，对以上9种检测分别设定阈值，其中 19-del(1) ,19-del(2)和G719X阈值设定为12000 ,其他为30

13、0002. 阴性无模板空白对照(NTC)应无扩增曲线升起；否则表明此次实验结果无效，建议更换操作环境或反应试剂，重新试验。(若只稍稍升起，但对结果判断无显著影响，则结果依然有效)3. 阳性对照Ct值一般小于25,参照基因体系的阳性对照 CT值一般小于23 ,但须根据仪器型号等情况进 行判断。4. CT值确定：建议对于一个突变检测体系应同时选择参照基因反应管，STD反应管，NTC和样品反应管，一并划定阈值，从而得到外控 CT值和样品的突变CT值。5. 参照基因CT值应控制在23之前，以用于评估反应体系中的 DNA模板量。若外控CT值大于23 ,说明 加入的DNA含有PCR抑制剂或DNA加入量太少

14、，需重新提取或增大 DNA加入量再做。(仅对全阴性结 果而言；若已经判断为阳性，结果仍然可靠)附表:突变外显子碱基变化Cosmic ID对应检测体系E746-_A750del(1)192235-2249 del 1562231号反应体系19-Del E746-_A750del(2)192236-2250 del 156225L747_P753>S192240-2257 del 1812370E746_T751>I192235-2252>AAT del 1813551E746_T751>A192237-2251 del 1512678E746_S752>D19223

15、8-2255 del 186220L747_A750>P192238-2248>GC del 1112422L747_T751>Q192238-2252>GCA del 1512419L747_E749del192239-2247 del 96218L747_T751del192239-2253 del 156254L747_S752del192239-2256 del 186255L747_A750>P192239-2248>C del 1012382L747_P753>Q192239-2258>CA del 2012387L747_T751&

16、gt;S192240-2251 del 126210L747_T751del192240-2254 del 1512369L747_T751>P192239-2251>C del 1312383E746_T751del192236-2253 del 18127282号反应体系19-Del(2)E746_S752>A192237-2254 del 1812367E746_S752>V192237-2255>T del 1912384S768I202303G>T62413号反应体系S768IH773_V771insH202319-2320 ins CAC123774号反应体系20-I