临床微生物试验室细菌鉴定指引设计上0001

1、临床微生物实验室细菌鉴定指南上录入时间:2010-11-22 10:40:51来源：某某医学院附属医院.细菌的鉴定步骤1 .鉴定的概念：将一个未知的菌株按其生物学特性，经过与所有菌种进展比拟后 划归到一个菌种的分析过程。2 .对待鉴定的菌种要明确已经获得纯化培养或者该菌种在血平板上生长良好，有 单个菌落可以进展生化试验。我们这里一般都是预先纯化培养3 .对待鉴定的菌种进展革兰染色，观察形态G+c, G b, G c, G+b，做触酶， 氧化酶实验，然后按科，属，种逐步鉴定。要注意对待鉴定的菌种选择一个适宜 的鉴定系统，临床常见细菌的快速简单的鉴定系统我们都已经设计好，参考鉴定质控单。4 .按鉴

2、定质控单的要求填写好病人某某，年龄，性别；标本类型，标本编号，送 检日期等。另外最重要的是要填写好该菌种的菌落形态以与有无溶血。5 .复习革兰染色，触酶实验，氧化酶实验。.革兰染色：是细菌鉴定过程中最常用最根本最重要的染色方法。首先要将待鉴定的细菌涂片，固定目的：杀死细菌，改变细菌对染料的通透性C第一步：以结晶紫初染染色液I第二步：以卢戈氏碘液媒染染色液H第三步：用95%乙醇脱色染色液田第四步：最后用稀释复红复染染色液IV.触酶实验（H2O2实验）：a原理：具有过氧化氢酶的细菌能催化双氧水生成水和初生态氧，继而形成 氧分子出现气泡。b.方法：一般用玻片法，就是挑取菌落在洁净的玻片上涂开，滴加3

3、%过氧化氢数滴，观察结果立即有大量气泡产生者为阳性，不产生气泡者为阴性。 要注意不能在血平板上进展实验， 这样易出现假阳性；另外陈旧菌落要是进展实 验可能会导致假阴性结果；还有不能在接种针或环上进展实验。c.阳性对照用金黄色葡萄球菌，阴性对照用链球菌；试剂要避光置4c冰箱保存。d.应用：绝大多数含细胞色素的需氧和兼性厌氧细菌触酶实验阳性，链球菌 属阴性。临床常见细菌鉴定实验中我们一般用于区别葡萄球菌属+，微球菌属+，链球菌属一。.氧化酶实验Kovac实验：a. 原理：氧化酶又称细胞色素酶，是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。酶并不 直接与试剂1%盐酸四甲基对苯二胺起反响，而是首先使细胞色素c氧化

4、，然后氧化型细胞色素c使对苯二胺氧化，出现深兰色反响。b. 方法滤纸法，菌落法，试剂纸片法：一般我们采用滤纸法，取白色洁净滤纸条，沾取菌落少许，加试剂一滴，阳性者立即呈粉红色，继而出现深兰色。结果读取在 10秒钟时为最优，60秒内读取可 靠。本实验防止接触含铁物质假阳性，也不能在含糖培养基上生长的菌落进 展实验假阴性。c. 阳性对照用铜绿假单胞菌，阴性对照用大肠埃希菌。d. 应用：奈瑟氏属的菌种均阳性，也用于区别假单胞菌属和肠杆菌，前者阳性， 后者阴性。二.葡萄球菌属的鉴定葡萄球菌属主要的种有金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，腐生葡萄球菌。1 . pm,菌体圆形，呈单个，成双以与不规簇状排列。染色

5、呈紫色，为革兰阳性球 菌。2 .与链球菌的区别：触酶实验为阳性，而链球菌阴性；菌体形态链球菌小于葡萄 球菌，呈成双和链状排列的卵圆形的革兰阳性球菌。3 .与微球菌的区别：触酶实验同为阳性，但微球菌的菌体呈四联状，要大于葡萄 球菌，微球菌葡萄糖氧化发酵实验操作方法同甘露醇OF试验为氧化型；而葡萄球菌为发酵型。另外吠喃哇酮即痢特灵50仙g/片敏感实验微球菌为耐药， 而金黄色葡萄球菌为敏感。4 .葡萄球菌属的种间鉴定：.菌落色素与溶血毒素：金黄色葡萄球菌在血平板上呈金黄色，柠檬色或者淡黄 色，而其他葡萄球菌如此在血平板上菌落大多数为白色，也有局部为柠檬色或深黄色。.溶血毒素：金黄色葡萄球菌有a、B、

6、丫、6溶血毒素，各毒素的区别是对动 物红细胞的溶血X围、抗原性与溶血时的温度等。其中以a溶血毒素为主。而 其他葡萄球菌大多数不产生溶血毒素，只有表葡有极少能产生溶血毒素。.血浆凝固酶实验：用与区别金黄色葡萄球菌阳性，表皮葡萄球菌阴性， 腐生葡萄球菌阴性。血浆凝固酶是金葡菌所产生的，有结合凝固酶和游离凝 固酶两种。血浆凝固酶检测有两种方法，为玻片法和试管法，我们一般采用玻片法。a.操作方法：挑取少许金黄色葡萄球菌菌落在玻片上与血浆乳化， 结合凝固酶能 作用于血浆中的纤维蛋白原，从而在金黄色葡萄球菌外表发生凝集， 所以我们肉 眼能看见凝集颗粒。玻片法主要由结合凝固酶作用产生；游离凝固酶是金黄色葡

7、萄球菌产生的胞外酶，能与血浆中的血浆凝固反响因子类似凝血酶的一种物质 作用，形成复合物再使纤维蛋白原转化成纤维蛋白而发生凝集。 试管法主要由游 离凝固酶作用产生。b.须知事项：菌落不能太多，否如此会影响结果观察；凝固酶阳性要做自凝阴 性对照用生理盐水代替血浆，只有在阴性对照也不凝集才能认为是真正的阳 性，有一局部葡萄球菌有自凝现象。.新生霉素敏感实验：金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌对新生霉素纸片5pg/片敏感；而腐生葡萄球菌，微球菌如此对之耐药。抑菌环直径>16mm即为新生霉素敏感。.甘露醇氧化发酵实验：a.操作方法：取两支甘露醇微量生化管，在微量管内接种待检细菌，然后一支加 两滴石腊密封

8、，另外一支如此不加，放 37c孵箱内1824h后观察结果。b.结果观察：微量生化管变黄色为阳性，也就是能利用甘露醇。假如两管都变黄 色如此说明是发酵型；其中加石蜡管不变色，没加石蜡管变黄色如此为氧化型； 如果两管都不变色如此说明该细菌是不利用甘露醇产碱型。c.应用：金黄色葡萄球菌在需氧和厌氧的条件下都能利用甘露醇即两管都变黄 色；表皮葡萄球菌需氧局部产酸，厌氧条件下不利用甘露醇即没加石蜡管有 局部会变黄色，加石蜡管不变黄色；腐生葡萄球菌与表皮葡萄球菌类似。三.微球菌属的种间鉴定微球菌属主要的种有易变微球菌，藤黄微球菌，玫瑰微球菌。鉴定生化见下微球菌属的种间鉴定易变微球菌藤黄微球菌玫瑰微球菌色素

9、产生黄色黄色粉红色需氧葡稳糖产酸十十一硝酸盐复原十一一月尿素酶dd十氧化酶弱一十/ +新生霉素敏感S/RSRd:不定 S:敏感 R:耐药四.链球菌属1 . m,呈成双和链状排列的卵圆形革兰阳性球菌，菌体小于葡萄球菌，无鞭毛， 没有芽胞，但有些菌株会形成荚膜。肺炎链球菌呈矛头状，宽端相对，尖端向外。2 .根据链球菌在血平板上溶血现象的不同分为三种：甲型a-溶血，即菌落周围出现较窄的草绿色溶血环；乙型B -溶血，即菌落周围出现较宽的透 明溶血环；丙型丫 -溶血，即菌落周围无溶血环。3 .根据抗原结构C多糖抗原的不同可分为A、B、C、D、E、F、G、H、K、L 、M、N、O、P、Q、R、S、T等18

10、个群，对人类有致病者 90%属于A群，偶见其他群链球菌致病。4 .链球菌属的种间鉴定.乙型溶血链球菌的鉴定：a,对杆菌肽0.04U/片抑菌圈直径10mm敏感：A群链球菌主要为化脓 性链球菌。b.对杆菌肽不敏感，胆汁七叶甘实验阴性，但马尿酸钠水解实验、CAMP实验阳性：B群链球菌主要为无乳链球菌。c,对杆菌肽不敏感，胆汁七叶甘实验阴性，马尿酸钠水解实验阴性，CAMP实验阴性：主要为马链球菌、类马链球菌、兽疫链球菌； 对三者的区别实验要加做海 藻糖和山梨醇实验。d. CAMP实验：将能产生B -溶血的金黄色葡萄球菌在血平板上划一横线接种，再 将待鉴定菌于金黄色葡萄球菌 3mm处垂直种一短线，假如在

11、有 CO2条件下培养 56小时，或无CO2条件下培养1824小时，在两细菌连接处出现一个半月型 的加强溶血区即为CAMP实验阳性。.甲型溶血链球菌的鉴定：a.草绿色链球菌：对杆菌肽敏感，对奥普托欣Optochin不敏感，胆汁溶菌实验 阴性，胆汁七叶甘实验阴性，在高盐中不生长。主要有变异链球菌，轻型链球菌, 血链球菌，唾液链球菌等。b.肺炎链球菌：菌体呈矛头状，成双排列，钝端相对，尖端相背，较葡萄球菌， 其他链球菌略大；在血平板上菌落细小、圆形、外表光滑、灰白色、半透明， 开 始时菌落呈扁平状，以后中心塌陷，呈脐窝状。与草绿色链球菌的主要区别是胆 汁溶菌实验阳性，对奥普托欣Optochin敏感。

12、奥普托欣Optochin含量为 5 pg/片，抑菌环18mm为敏感，15mm为不敏感，1518mm应重复实验。.肠球菌D群链球菌的鉴定：溶血不定，主要是a -、丫-溶血；对杆菌肽不敏感，但其特异性实验是胆汁七叶 昔实验阳性；假如能在6.5%NaCl的心浸液肉汤中生长即为 D群肠球菌，不能生 长为D群非肠球菌。.链球菌属鉴定的系统生化结果判断a. 1%美兰牛乳b.胆汁七叶甘实验：变黑为阳性。c. PH9.6肉汤实验：变浑浊为能在碱性环境中生长阳性。d. 6.5%NaCl心浸液肉汤：由紫变黄为能在高盐环境中生长阳性。e.精氨酸双水解酶实验：变红色对照不变色，仍为黄色为阳性。临床微生物实验室细菌鉴定

13、指南下录入时间:2010-11-22 10:44:19来源：某某医学院附属医院五.奈瑟氏菌属和布兰汉菌属奈瑟氏菌属主要有脑膜炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟氏菌；布兰汉氏菌属只有卡他布兰 汉氏菌。两者系需氧革兰阴性球菌。 奈瑟氏菌的生物学特性：革兰阴性球菌，需氧，卵圆形或肾形，无动力，氧化 酶与触酶均阳性。培养时对营养要求高，能在巧克力平板或有丰富营养的血平板 上，在510%CO2环境中生长。.鉴定过程：a. DNA酶实验阳性为布兰汉氏菌，阴性如此为奈瑟氏菌。b.能在普通血平板上生长的为其他奈瑟氏菌，在巧克力平板上生长的主要为脑膜 炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟氏菌。c.能使麦芽糖氧化分解产酸的是脑膜炎奈瑟氏菌，不

14、利用麦芽糖的是淋病奈瑟氏 菌。.几种主要细菌对葡萄糖、麦芽糖、蔗糖的氧化分解产酸结果如下：氧化分解产酸葡锢糖麦芽糖淋病奈瑟氏菌十一一脑膜炎余瑟氏菌十十一粘液奈瑟氏菌+十卡他布兰汉菌一一一 DNA酶实验：a.方法：将待鉴定细菌点种于含0.2%DNA的DNA琼脂平板上，培养后用 1mmol/LHCl覆盖平板，菌落周围出现透明环者为阳性。b.原理：某些细菌能产生DNA酶，可使DNA长链水解成由几个单核甘酸组成的 寡核甘酸链；长链DNA可被酸沉淀，而水解后形成后的寡核甘酸链如此可溶于 酸，故在DNA琼脂平板加盐酸，可在菌落周围形成透明的溶血环。肠杆菌科 中只有沙雷氏菌和变形杆菌可产生 DNA酶，阳性球

15、菌中只有金葡菌能产生 DNA酶。六.肠杆菌科肠杆菌科是一大群生物学性状相似的革兰阴性杆菌，其中对人致病性较强 的鼠疫耶尔森菌现已根本没有流行和伤寒沙门菌；4类常引起腹泻和肠道感染的细菌埃希氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌、耶尔森氏菌和8种常导致院内感染的细菌枸檬酸杆菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属、多源菌属、沙雷菌属、变形 杆菌属、普罗威登菌属和摩根菌属o另外还有很多细菌是肠道的正常菌群， 但 在一定条件下也可致病条件致病菌。实验过程中对于革兰阴性杆菌首先要做氧化酶实验， 阴性为肠杆菌科细菌； 阳性的为非发酵菌我们实验室还没有简单的系统鉴定方法， 一般要仪器上卡检 测或弧菌科细菌。1.肠杆菌科的系统生化.K

16、IA试验克氏双糖铁组成：乳糖/葡萄糖=10/1斜面/高层，其长度最好是都是 2CM结果判断：斜面或高层变黄色：阳性；不变色红色：阴性高层中出现裂隙：产气阳性高层中出现黑色FeS：产H2s阳性.苯丙氨酸脱竣酶试验细菌产生的苯丙氨酸脱竣酶使苯丙氨酸氧化脱竣后生成苯丙酮酸，再与10%的FeCl3试剂产成深绿色反响。变形杆菌属、普罗威登菌属和摩根菌属为阳性， 其他为阴性枸檬酸盐试验碳源利用实验在枸檬酸盐培养基中细菌能利用的碳源只有枸檬酸盐，分解后生成碳酸钠，使培养基变碱性，pH指示剂澳麝香草酚蓝由淡绿色变为深兰色，即为枸檬酸盐试验 阳性。埃希氏菌属，志贺氏菌属，爱德华菌属为阴性，其他为阳性注意：接种时

17、不能被糖，蛋白陈污染，要单独接种.甲基红MR试验细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步分解为甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸等, 使培养基的pH下降至4.5以下时，参加甲基红指示剂由桔黄色变桔红色为弱阳 性；变红色为阳性。培养基成分：葡萄糖蛋白陈水试剂：甲基红0.1g,酒精300ml,水200ml主要用于大肠埃希菌+和产气肠杆菌的鉴别；常与V-P实验联合使用, 一般情况下两者结果正好相反，但也有例外如奇变两者同为阳性。.MIU动力靛基质尿素试验 .动力：在半固体培养基中穿刺接种细菌培养后，假如穿刺线周围有细菌扩散生 长，如此为动力+；清晰如此为动力一。 .靛基质试验呷深试验：某些细菌有色氨酸酶，能分解

18、培养基中的色氨酸生 成呷咪。呷咪再与试剂对位二氨基苯甲醛作用形成玫瑰呷珠而呈红色。 .尿素试验：某些细菌能产生尿素酶，分解尿素产生大量的氨，使培养基变碱， 再使培养基中的指示剂0.4%酚红变红色即为阳性。.硝酸盐复原试验NO3 鹏O2 -大肠NO3 NH4+NO3 -N2沙雷氏菌属试剂甲：对氨基苯磺酸试剂乙：a -蔡胺观察结果时甲液和乙液要等量参加， 立即或10min内出现红色为阳性。假如不变 色，如此要参加锌粉：变红色，说明硝还试验为真阴性仍不变色，说明硝还 试验真阳性，但原先复原产物不是 NO2 - 0阴性结果出现时有三种可能：细菌不能复原硝酸盐亚硝酸盐继续分解生成氨 或氮培养基不适合细菌

19、生长肠杆菌科细菌均能复原硝酸盐为亚硝酸盐。.氨基酸脱竣试验细菌产生脱竣酶分解氨基酸使其脱竣生成胺和 CO2,虽然各种细菌所产生的脱竣酶不 一定一样，但最后都能生成胺赖氨酸一尸胺，鸟氨酸一腐胺，精氨酸一精胺 和CO2。然后胺能使培养基变碱性，通过指示剂澳甲酚紫由黄变紫即为阳性。 对照管无氨基酸为黄色。注意：微量管接种好后要加石蜡，使培养基造成厌氧环境。生成的胺更稳定，还 能诱导氨基酸脱竣酶的产生对照管如果不显黄色，如此结果不能判断。用：除伤寒沙门氏菌，鸡沙门氏菌外，其他沙门氏菌鸟AA,赖AA均为阳性；除宋氏和鲍氏志贺菌外其他志贺菌也菌为阳性。葡萄糖酸盐试验微量管在培养1824h后，加班氏试剂，水

20、浴煮沸10min,由兰色变黄绿色到砖红色 即为阳性，不变为阴性。1 .肠杆菌的鉴定流程(1) .根据苯丙氨酸脱竣酶实验：+：变形杆菌属，普罗威登斯菌属，摩根氏菌属：埃希氏菌属，志贺氏菌属，沙门氏菌属，枸檬酸杆菌属，爱德华菌属；克雷伯 菌属，肠杆菌属，沙雷氏菌属，哈夫尼亚菌属。.苯丙氨酸脱竣酶实验阴性，加做葡萄糖酸盐实验+：克雷伯菌属，肠杆菌属，沙雷氏菌属，哈夫尼亚菌属a.动力一：克雷伯菌属，属内种的鉴定主要根据呷咪试验肺克呷深实验阴 性，二个亚种鉴别试验IMViC :肺炎1,臭鼻I d,鼻硬结Ib.动力+，DNA酶+：沙雷氏菌属动力+，DNA酶，枸檬酸盐+：肠杆菌属主要是阴沟肠杆菌和产气肠杆菌

21、，前者赖氨酸阴性，而后中为阳性动力+，DNA酶一，枸檬酸盐一：哈夫尼亚菌属：加做IMViC靛基质-甲基红-VP-枸檬酸盐试验a. IMViC + + ：大肠埃希菌H2S-或爱德华菌属H2S+。b. IMViC一/ + + +：枸檬酸杆菌属.苯丙氨酸脱竣酶实验阳性，根据产 H2s可分+：变形杆菌属属内主要鉴定试验如下普艾奇变产粘变潘尼氏尿素酶十十十十鸟氨酸一十一一靛基质十一一一麦芽糖一一十十木糖十十一十一：普罗威登氏菌属，摩根氏菌属普罗威登氏菌属：鸟氨酸：-；枸檬酸盐：+属内鉴定尿素酶与一些碳水化合物 的产酸试验，如甘露醇、阿拉伯糖、海藻糖等摩根氏菌属：鸟氨酸：+;枸檬酸盐：只有一个种：摩氏摩根

22、氏菌.志贺氏菌属和沙门氏菌属这两种菌属在肠道选择性培养基SS、麦康凯形成不发酵乳糖的透明或半 透明的无色菌落，但一些沙门氏能产H2s就会形成中心黑色的菌落，鉴定时在选 择性培养基上挑选可疑菌落进展鉴定。a.志贺氏菌属主要系统生化：KIA : K/A只有福氏6型能产气，H2s； MIU : -+/-苯丙：；枸檬酸盐：。报告结果时要根据其血清学的结果鉴定到种，即 A群痢疾志贺氏菌、B群 福氏志贺氏菌、C群鲍氏志贺氏菌、D群宋氏志贺氏菌；我国主要以B群和D群为主。b.沙门氏菌属主要系统生化：KIA : K/AG , H2s+/一； MIU:苯丙：；枸檬酸盐: 一O伤寒沙门氏菌的抗原结构：菌体抗原O抗原，鞭毛抗原H抗原，包膜抗 原主要是Vi抗原根据系统生化鉴定到沙门氏菌属后，在根据其抗原结构的特点，用血清学凝集分 到种即可报告结果。血清凝集步骤如下：A-F 多价 O 十：O2, Ha +： A群甲型副伤寒沙门氏菌O4, Hb +： B群乙型副伤寒沙门氏菌O6 7, Hc, Vi +： C群内型副伤寒沙门氏菌O9, Hd, Vi +： D群伤寒沙门氏菌。3、10, Heh 十： E群Oi