8-DNA羟甲基化

1、分子机制研究套路（八）DNA （羟）甲基化课题：C因素激活A蛋白对B基因启动子DNA甲基化的调控对 D疾病的影响1 .概念介绍：表观遗传学是当今生命科学普遍关注的前沿，是一种可遗传的调节基因表达的机制，不同于经典遗传学，不涉及到基因序列的改变，而且表观遗传修饰是可逆的，在基因调控中起重要作用。DNA甲基化是表观遗传学主要调控机制之一，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚 胎发育、染色质结构改变以及人类疾病的发生、发展中起着重要作用。DNA甲基化是指由 S-腺昔甲硫氨酸（S-adenosyl methionine, SAM ）提供甲基、在 DNA甲 基转移酶（DNA methyltransferas

2、e, DNMT ）的催化下，在胞口密咤的 C5位上面加上一个甲基， 形成5-甲基胞喀咤（5-mC）的化学修饰过程。 DNA甲基转移酶（如DNMTs）与DNA去甲基化 酶（如TET蛋白等）调控基因组DNA序列甲基化的动态变化，一般来说，基因启动子区 CpG岛的甲基化可以使一些转录因子无法与DNA结合而抑制基因的转录，而该区域的去甲基化则可以激活基因的转录。DNA甲基化主要发生在 CpG异二核甘酸上面（如示意图 1）,而CpG在人类基因组中出现 的几率比较低，主要集中出现在CpG岛（CpG island）上面。CpG岛是指由200bp的碱基组成的DNA序列，其中GC含量占60%以上的一个区域，这个

3、区域主要位于某些基因的启 动子区域。CpG岛上DNA的甲基化是表观遗传学研究中的一个重点，其可改变染色体的结构、影响邻近基因的表达。高度甲基化的 DNA与组蛋白结合紧密并且能够招募转录抑制因 子、抑制转录激活因子与启动子区域的结合，从而达到抑制基因表达的目的；而DNA的低甲基化使得染色体结构松散，促进转录激活因子和RNA多聚酶与靶序列的结合，从而驱使相关基因的高表达。图1: DNA在CpG异二核甘酸上的甲基化示意图表观遗传学最先用于肿瘤的研究中。在许多肿瘤细胞中发现CpG岛高度甲基化，从而抑制抑癌基因的表达，诱发肿瘤的产生，因此 DNMT抑制剂5-氮胞昔(5-AZA )等被用于肿瘤的临床治疗。

4、2 .示意图:DNA甲基化循环的过程如图 2:通过SAM提供甲基，在DNMT的催化下完成甲基化过程，于此同时会产生副产物 S-腺昔高半胱氨酸(S-adenosyl homocysteine, SAH ), SAH进一步转化为高半胱氨酸，而高半胱氨酸是这个循环中的关键组分，研究表明升高的高半胱氨酸能够损伤DNA的修复机制，诱导氧化应激，导致细胞死亡和中枢神经系统功能的紊乱。从循环图中可以得知，高半胱氨酸具有2条去路，一方面可以形成甲硫氨酸重新参与甲基化循环，另一方面可以被分解代谢为半胱氨酸。高半胱氨酸转化为甲硫氨酸的过程是在甲硫氨酸合成酶的作用下完成的，但是需要维生素B12和5-甲基四氢叶酸的辅

5、助，而5-甲基四氢叶酸又需要通过食物中的叶酸转化而来；高半胱氨酸转化为半胱氨酸也需要维生素B6的参与。已经发现维生素B6、维生素B12和叶酸的缺乏与高半胱氨酸水平升高密切相关，因此，可以 通过食物疗法来保证维生素 B12、维生素B6和叶酸的供应，达到防止疾病的目的。DNA rnethylatron cycle图2: DNA甲基化循环过程3 .研究思路:3.1 D疾病中B基因启动子调控序列甲基化状态及其与B蛋白表达相关性分析 43.1.1 D疾病组与正常对照组细胞基因组DNA整体甲基化水平 43.1.2 D疾病和正常对照组细胞B基因启动子调控序列DNA甲基化水平 43.1.3 D疾病和正常对照组

6、细胞B蛋白表达水平及其与B基因启动子调控序列 DNA甲基化水平相关性分析43.2 补丁甲基化技术构建特殊报告载体检测DNA甲基化对B基因启动子转录活性的调控.53.2.1 成功构建B基因启动子调控序列PGL-3promoter荧光素报告载体53.2.2 质粒PCR大量扩增B基因启动子调控序列片段 53.2.3 体外人工甲基化及甲基化敏感性限制性内切酶酶切鉴定 53.2.4 检测CpG甲基化和未甲基化目的片段荧光素报告载体荧光素活性 53.3 A蛋白对B基因启动子DNA甲基化及转录活性调控的分子机制 63.3.1 A蛋白募集去甲基化酶 TET2结合至B基因启动子序列 63.3.2 A蛋白促进细胞

7、B基因启动子去甲基化 63.3.3 C因素促进细胞 B蛋白表达 63.1 D疾病中B基因启动子调控序列甲基化状态及其与B蛋白表达相关性分析3.1.1 D疾病组与正常对照组细胞基因组DNA整体甲基化水平用磁珠分选法分离 10例D疾病患者及正常对照细胞，提取基因组DNA ,用MethylampTM整体DNA甲基化检测试剂盒检测 D疾病与正常对照细胞基因组 DNA整体甲基化水平。结 果显示D疾病组细胞基因组 DNA整体甲基化较正常对照组明显 下降。注释：1）疾病组和对照组样品，如果可获得临床样本最好，如果没有，可用同一组织类型 的疾病细胞系和正常细胞系。2）如果是临床样本，细胞的分离方法不一定是磁珠

8、分选法，还可以用流式细胞仪分选等，需根据疾病类型的不同进行调整。3）疾病组DNA整体甲基化水平降低还是升高，关键取决于B基因对疾病的贡献，若促进疾病，则大多甲基化水平降低；若抑制疾病，则大多甲基化水平升高。3.1.2 D疾病和正常对照组细胞 B基因启动子调控序列 DNA甲基化水平.首先确定B基因启动子中CpG岛的位置，然后在 CpG岛内确定CpG位点，检测所有 CpG 位点DNA甲基化水平。亚硫酸盐处理基因组 DNA ,巢式PCR扩增DNA产物，T载体克隆 测序检测调控序列 CpG岛甲基化水平。结果显示 D疾病组细胞B基因启动子区所有 CpG 位点整体DNA甲基化水平较正常对照组明显 降低。3

9、.1.3 D疾病和正常对照组细胞 B蛋白表达水平及其与 B基因启动子调控序列 DNA甲基化 水平相关性分析用实时定量PCR检测D疾病和正常对照组单核细胞 B蛋白mRNA表达水平，结果显示 D 疾病组细胞B蛋白mRNA水平较正常对照组明显升高。用Western blot法检测D疾病和正常对照组细胞 B蛋白表达水平，结果显示D疾病组细胞B 蛋白水平较正常对照组明显升高。D疾病与正常对照组细胞 B基因启动子DNA甲基化水平与B蛋白表达呈负相关性。3.2 补丁甲基化技术构建特殊报告载体检测DNA甲基化对B基因启动子转录活性的调控3.2.1 成功建B基因启动子调控序列PGL-3promoter荧光素报告

10、载体用T4连接酶将B基因启动子调控序列片段（用体外甲基化技术使目的片段CpG甲基化，并用未甲基化作阴性对照）与酶切处理线状报告载体连接，用DH5 “大肠杆菌感受态转化纯化载体质粒。用双酶切鉴定，质粒基因组测序及Pubmed BLAST序列对比鉴定获得含有 B基因启动子调控序列PGL-3promoter突光素报告载体。注释:双酶切时具体选择何种酶取决于质粒载体上的多克隆位点，且插入序列中不可含有所用酶的酶切序列。3.2.2 质粒PCR大量扩增B基因启动子调控序列片段为了获得大量纯化的 B基因启动子调控序列片断，利用报告载体为模板，运用质粒 PCR技 术，大量扩增目的片段，利用胶回收技术纯化回收目

11、的片段。3.2.3 体外人工甲基化及甲基化敏感性限制性内切酶酶切鉴定利用甲基化敏感性限制性内切酶 Aci I酶切鉴定体外甲基化程度， Aci I酶切位点为5 -CAC GC-3'或3'-GGQAG- 5'而如果酶切位点受 CpG甲基化保护不被酶切；体外人工甲基化使 CpG 甲基化组目的片段完全甲基化不被酶切为完整的片段，而模拟甲基化组目的片段未甲基化，被Aci I酶切为两个片段，证实体外人工甲基化成功，获得完全CpG甲基化/模拟甲基化目的片段。3.2.4 检测CpG甲基化和未甲基化目的片段荧光素报告载体荧光素活性将CpG甲基化和未甲基化目的片段荧光素报告载体与pRL家族

12、海肾荧光素酶（Rluc）对照报告基因载体共转染至细胞株培养48小时，利用双荧光素酶报告载体检测系统检测荧光素酶活性，比较CpG甲基化和模拟甲基化目的片段荧光素报告载体荧光素酶活性。结果显示B基因启动子调控序列是甲基化敏感位点，B基因启动子受DNA甲基化调控。3.3 A蛋白对B基因启动子DNA甲基化及转录活性调控的分子机制3.3.1 A蛋白募集去甲基化酶TET2结合至B基因启动子序列分离3例健康志愿者细胞，用 C因素激活A蛋白，用免疫共沉淀(IP)法证实A蛋白募集去 甲基化酶TET2蛋白；用染色质免疫共沉淀 (CHIP)-qPCR证实A蛋白结合至单核细胞 B基 因启动子CpG序列。3.3.2 A

13、蛋白促进细胞B基因启动子去甲基化为了证实A蛋白募集的TET2蛋白是否引起B基因启动子去甲基化，用亚硫酸盐测序法检测C因素处理组及对照组单核细胞 B基因启动子CpG岛上CpG位点DNA甲基化水平。结 果显示，C因素处理组B基因启动子DNA甲基化水平较对照组明显下降， 提示A蛋白募集 TET2蛋白导致单核细胞B基因启动子去甲基化。3.3.3 C因素促进细胞B蛋白表达在3.2部分已用补丁甲基化荧光素报告载体技术证实B基因转录受DNA甲基化调控，为阐明C因素通过A蛋白/TET2通路引起的B基因启动子去甲基化是否促进细胞 B蛋白表达， 通过流式细胞仪检测 C因素处理组及对照组单核细胞 B蛋白表达，发现C因素促进单核细 胞B蛋白的表达。4.应用案例：1. Liang Y