关于高级生物化学与分子生物学综合实验报告

1、高级生物化学与分子生物学综合实验报告一、实验目的以特定酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达和纯化为主线，进行基因操作、蛋白质表达、 亲和层析纯化等的训练，通过集中训练熟练生物化学和分子生物学实验操作，为独立开展研 究生课题研究奠定实验基础。二、实验原理利用基因重组技术，将目的基因与载体质粒DNA在体外进行重组，然后把这种重组DNA转化到感受态细胞，通过一定的诱导条件，使之在受体细胞内增值表达相应的目标蛋 白。为了得到相应的目标蛋白，需要通过亲和层析等手段纯化目标蛋白。三、实验内容一）内容一：重组质粒的分离、鉴定与转化实验1.重组质粒的分离、纯化及检测实验2.质粒的酶切及琼脂糖凝胶电泳回收实验3.感受

2、态细胞的制备、连接与转化二）内容二：重组蛋白在大肠杆菌中的表达实验4.细菌的大量培养及重组蛋白的诱导三）内容三：重组蛋白的提取、纯化与鉴定实验5.细菌的收集、破碎与目标蛋白的纯化实验6.目标蛋白的SDS-PAG鉴定实验1质粒DNA勺分离、纯化及检测材料、设备及试剂一、材料转化的细菌，1.5ml塑料离心管,离心管架。二、设备微量取液器（20仙1,2001,1000N1）,台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽灭菌锅，涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。三、试剂1. LB液体培养基（Luria-Bertani） :称取蛋白陈（Tryptone）5 g,酵母提取物（Yeast ex

3、tract） 2.5g , NaCl 5g,溶于800ml去离子水中，用 NaOHW pH至7.5,加去离子水至总 体积500 mL,高压下蒸气灭菌20分钟。2. LB固体培养基：液体培养基中每升加 12g琼脂粉，高压灭菌。3. 氨苇青霉素(Ampicillin, Amp) 母液：配成50mg/ml水溶液，-20 C保存备。4.质 粒提取试剂盒。操作步骤1 .细菌的培养和收集将含有质粒的菌种用无菌牙签挑取平板上的单菌落接种到2-5ml LB液体培养基(含50小g/ml Amp)中，37c振荡培养约12小时至对数生长后期。2 .取液体培养物1.2 mL于Eppendof 管中，然后6000 g/

4、min离心2 min ,弃上清。3 .质粒的提取，参照质粒提取试剂盒说明。4 . -20 C保存DNAiZ备电泳检测。实验2质粒的酶切及琼脂糖凝胶电泳回收材料、设备及试剂一、 材料质粒；Hindm酶及其酶切缓冲液；琼脂糖(Agarose)二、设备水平式电泳装置，电泳仪，台式高速离心机，恒温水浴锅，微量移液枪，微波炉或电炉， 紫外透射仪。三、试剂50 X TAE电泳缓冲液；6 X电泳载样缓冲液。 操作步骤DNA酶切反应1. 反应体系组成：10X Buffer5HindIII 1Plasmid20H2O24 p L2 .混匀反应体系后，将eppendorf管置于泡沫板上，37c水浴保温1小 时，使

5、酶切反应完全。3 .停止反应，置于冰箱中保存备用、琼脂糖凝胶电泳1 .取50X TAE缓冲液4ml加水至200ml,配制成1X TAE稀释缓冲液， 待用。2 .胶液的制备：称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml 1 乂 TAEffi释缓冲液， 轻轻摇匀，溶胀30min,放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化。3 .胶板的制备：将有机玻璃胶槽放好，插上样品梳子。将冷却至50-60 C的琼脂糖胶液小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。4 .加样：取10/酶解液与2（! l 6 X载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽 中。5 .电泳：加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持

6、在60-80V,电流在40mAW上。当澳酚蓝条带移动到距凝胶前沿约 2cm时，停止电泳。6 .染色观察和拍照。7 .回收条带，用回收试剂盒。步骤参见试剂盒说明书。实验3 感受态细胞的制备、连接与转化材料、设备及试剂一、材料E. coli BL21/DE3 菌株：Amp-;无菌 eppendorf 管。二、试剂LB液体培养基、T4 DNA连接酶、氨苇青霉素、含 AmpB勺LB固体培养基 操作步骤一、 连接反应1 .取新的经灭菌处理的1.5ml eppendorf 管，编号。2. 体系组成：共10履Buffer1X回收的DNAt段100 ngT4 DNA ligase 1L去离子水3. 顺序：去离

7、子水、回收的 DNAt段、回收的DNA>t段、T4 DNA ligase 。4. 混匀后用小离心机将液体全部甩到管底，于16c保温8-24h 0二、E. coli感受态细胞转化3、 1.从4c冰箱中取200 n感受态细胞悬液，立即置冰上。4、 2.加入连接产物溶液（体积不超过10小），轻轻摇匀，冰上放置30分钟。3. 42 C水浴中热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。4 .向管中加入0.8ml LB液体培养基（不含Amp）,混匀后37c低转速振荡培养45min, 使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。5 .将上述菌液摇匀后取200（il涂布于含AmpW筛选平板

8、上，正面向上放置 5-10min , 待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37c培养16-24小时。同时做两个对照：对照组1:（-）感受态细胞，此组正常情况下应不产生菌落。对照组2:（+） 1/ 质粒，此组正常情况下应产生大量。实验四细菌的大量培养及外源蛋白的诱导操作步骤种子培养液的准备和外源蛋白的诱导表达1 .取冻存的菌种，接种入装有 5-10ml LB培养基的瓶中，37 C, 200rpm/min过夜培养后 接入100ml LB培养基，接种浓度为2%2 . 37 C, 200rpm/min培养3小时后，将摇床温度调节到诱导温度 20c并平衡30min,然 后加入IPTG至终浓度0.4mM继

9、续培养过夜。实验五细菌的收集、破碎与目标蛋白的纯化材料及试剂一、材料经诱导表达目的蛋白的大肠杆菌、Ni-NTA介质（Ni亲和介质）二、试剂1 .缓冲液：20mmol/L Tris-HCl , pH8.0;2,缓冲液配制 10mM 50 mM 100 mM 250 mM咪坐。操作步骤一（细菌破碎）1. 将菌液转入大离心瓶中，离心收菌，4000rpm, 10min；2 .倒掉上清，将菌体悬于10mLs冲液中，超声破碎细菌；3 . 将破菌产物离心，12000rpm, 15 min；4 .分别对上清和沉淀留样，通过 SD眯丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表达情况和蛋白操作步骤二（目标蛋白纯化）1 .处理介质：向柱

10、中加入0.5mL NiTA介质后，用5倍柱体积的去离子水洗涤介质；再用5倍柱体积的缓冲液洗涤介质；以下步骤根据蛋白性质在16c下进行操作；2 .加入蛋白样品：加入超声破菌后的蛋白上清样品；3 .洗涤杂蛋白：用5倍柱体积的10mMe口坐洗涤介质；4 .洗涤目标蛋白：用50 mM 100 mM 250 mM同浓度白咪唾各2.5ml,梯度洗脱介质 回收流出液，保存于4C,用SDS5丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。实验六 目标蛋白的SDS-PAG鉴定试齐I10%十二烷基硫酸钠（SDS贮存液、30%5烯酰胺单体液、浓缩胶缓冲液 1M pH6.8的Tris 缓冲液和分离胶缓冲液1.5M pH8.8的Tris缓冲

11、液、10%i硫酸俊、TEMEDTris-甘氨酸电 泳缓冲液、样品处理液、染色液、脱色液操作步骤一、蛋白电泳用胶的配制1. 安装玻璃板。2 .按表1中给出的数值在一小烧杯中配制分离胶溶液。表2-1 SDS不连续电泳凝胶配方贮液分离胶/12%浓缩胶/3%30%W烯酰胺单体贮液/mL4.00.85分离胶缓冲液 1.5M Tris/mL (pH8.8)2.5-浓缩胶缓冲液1M Tris /mL(pH6.8)-0.6双蒸水/mL3.43.510%的SDSS7限】仙L1005010%的过硫酸俊溶液 /卜L158TEMED/x L1083.迅速在玻璃板的间隙中灌注丙稀酰胺溶液，留出灌注浓缩胶所需的空间。再在

12、胶面上小心注入一层水（约23 mn）高，以阻止氧气进入凝胶溶液。4 .分离胶聚合完全后（约30分钟），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。5 .按表1中给出的浓缩胶配置方法制备浓缩胶。 注意一旦加入TEMED马上开始聚合, 故应快速操作。6 .在聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净梳子三、用考马斯亮蓝对SDS聚丙稀酰胺凝胶进行染色和脱色染色时间：现温度下不少于 2h。脱色需310小时，期间应多次更换脱色液直至背景清楚。为了永久性记录，应尽快对 凝胶进行拍照。四、实验结果与讨论1、质粒的提取、酶曙泳加图1-1 第四组电泳图谱图1-2 第三组电泳图谱1:酶切后的质粒 2 :质粒

13、M : Marker 1、2:质粒4、5:酶切后质粒观察结果：通过对比第三组和第四组电泳图谱， 可以发现酶切后的质粒条带在原质粒条带的 前面，并且质粒泳道条带比较多；电泳条带模糊，呈凹凸形状，拖尾现象比较严重，不能很 明显地观察结果。原因分析：(1)质粒泳道条带较多的原因可能是，质粒有的是超螺旋的，有的可能是开环质粒，还 有的形成各种聚合物，因此呈现多条条带。由于形成聚合物，分子量增大，因此条带在酶切 条带的后面，条带最亮说明呈聚合状态的质粒的量是最多的。(2) Marker条带模糊，拖尾现象严重可能的原因有：电泳缓冲液最好现用现配，可以提 高电泳效果；琼脂糖的浓度可能不是很适合，应尽可能摸索

14、出该质粒最适浓度；电泳时电压 不是最适电压，而且电压不是很稳，电泳时间太长，可能是电泳仪器太老化了；正确合适的上样量是条带清晰的保证，条带模糊可能是上样量太大；有时候可能是由于DNAK蛋白质或一些酶污染。2、转化结果（培养基）阳性薪睑八、3、目标蛋白的SDS-PAG鉴定图谱中性1）电泳检测样品包括：蛋白 Marker、洗液、100mhM 口坐冲洗液、250mMO冲洗液。阳性对照是将质粒转入感受态细 胞，此组正常情况下应产生大量菌落上样液国碟液科冲肥护NAW麴用50mMP坐冲标基因在细菌里不能表达，因此不能看 到菌落。2）各个小组将100mhM口坐冲洗液在一块胶上一起电泳。3）只有笫丁小组做了对

15、照电泳，将未加 身枉IPTG诱导的菌液进行了相应的电泳12345 M45kD33kDkDa94.0 66.2 :45©33.0 26.020.0图3-1目标蛋白的SDS-PAG鉴定图谱以Marker为临界线，右边是我们第四组的电泳图谱，左边是第三组的电泳图谱。1:破菌后的原液2: 50mM<坐冲洗液3: 100mM坐冲洗液4: 250mM*口坐冲洗液我们以第三组的穿柱液作为标本1:原液2 :穿透液3: 50mM>P坐洗脱液结2夕沛我们从图谱中可以看出目标蛋白在 50mM<n坐洗脱7颂1100mMM螂湎龈中被洗脱下的量曷上幽多SDS-PA,5EB> 3-150-10mMt«W «*适曲品50mMM娜招沏得到了 目 3WJ 3-21®® MOPT®W®W3ftSt t33kD-45kDKE间；原液中含有大量的目标蛋白，穿柱液中没有，说明目标蛋白被吸附到了层析柱中 通过第三组和第四组结果的比对、可以看到第四组在不同浓度咪唾洗脱液得到的目标 蛋白的量比第三组多，有可能是因为第四组加样量多于第三组， 或者是50mMS有完全33kD-45kD