生物制药工艺学第四章

1、一氨基酸类药物的基本知识一氨基酸类药物的基本知识第一节第一节 氨基酸类药物的基本概念氨基酸类药物的基本概念 H2NCHCOOHR-氨基酸表达通式氨基酸表达通式PrPr的基本组成单位（构成的基本组成单位（构成天然天然PrPr的的2020种种AaAa）均为均为L-L-氨基酸氨基酸(RH,NH(RH,NH2 2,COOH),COOH)GlyGly（R RH H）除外）除外不同不同AaAa即有共性又有个性即有共性又有个性具有立具有立体异构体异构现象现象H HN N H H3 3+ +C C O O O O- -C C H H3 3+ +H H3 3N NH HC C O O O O- -C C H H

2、3 3D-AlanineD-AlanineL-AlanineL-Alanine(Fischer projections)(Fischer projections)氨基酸的立体构型氨基酸的立体构型（丙氨酸）（丙氨酸）作为药物使用的主要是天然氨基酸作为药物使用的主要是天然氨基酸, ,即即L L氨基酸氨基酸D D氨基酸主要用于氨基酸主要用于: :1 1）新型抗生素、抗病毒药的中间体）新型抗生素、抗病毒药的中间体 2 2）食品、化妆品领域）食品、化妆品领域 3 3）生化试剂领域）生化试剂领域D-D-苯丙氨酸是苯丙氨酸是HIVHIV蛋白蛋白酶抑制药的关键中间体酶抑制药的关键中间体, ,也是抗肿瘤药（百士

3、欣）也是抗肿瘤药（百士欣）和糖尿病治疗药（纳格和糖尿病治疗药（纳格列那）的原料列那）的原料D-D-氨基酸构成氨基酸构成的二肽或者短的二肽或者短肽肽, ,它们甜度它们甜度高高, ,安全，无安全，无热量热量 1 1、分类（了解）、分类（了解）2 2、性质、性质( (熟悉）熟悉） H2NCHCOOHRR CH COO- NH3+R CH COO- NH2+ H+R CH COO- NH3+R CH COOH NH3+ H+含有酪氨酸的物质或其他酚类含有酪氨酸的物质或其他酚类化合物与米伦试剂（亚硝酸汞、化合物与米伦试剂（亚硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混合液硝酸汞及硝酸的混合液 ）一起）一起加热出现红色反应的

4、现象加热出现红色反应的现象 酚基将福林试剂酚基将福林试剂中的磷钼酸及磷中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色钨酸还原成蓝色化合物的反应化合物的反应 以以萘酚和次氯酸萘酚和次氯酸处理样品后处理样品后, ,精氨精氨酸出现的红色反应酸出现的红色反应 二、氨基酸及其衍生物在医药中的应用（了解）二、氨基酸及其衍生物在医药中的应用（了解）第二节第二节 氨基酸类药物的生产方法氨基酸类药物的生产方法1 1、氨基酸生产现状、氨基酸生产现状 20102010年我国年我国AaAa总产量总产量300300万吨万吨, ,其中谷氨酸其中谷氨酸200200万吨万吨, ,占世占世界谷氨酸产量的界谷氨酸产量的2/3.2/3.产量产量:

5、:谷氨酸谷氨酸 蛋氨酸蛋氨酸 赖氨酸赖氨酸 天门冬氨酸天门冬氨酸 苯丙氨酸苯丙氨酸 胱氨胱氨酸酸 ( (谷氨酸是全球产销量最大的谷氨酸是全球产销量最大的Aa,Aa,占占80%)80%)2 2、氨基酸的应用领域、氨基酸的应用领域（1 1）调味品及食品添加剂调味品及食品添加剂 约占约占50%50%（2 2）动物饲料动物饲料 约占约占30%30%（3 3）药用、保健品、化妆品及其他药用、保健品、化妆品及其他 约占约占20%20%概述概述天然蛋白（毛发、血粉、废蚕丝）天然蛋白（毛发、血粉、废蚕丝）（1 1）水解）水解多种氨基酸多种氨基酸混合物混合物（2 2）分离纯化（）分离纯化（3 3）精制）精制 （

6、结晶）（结晶）药用氨基酸药用氨基酸蛋白质原料蛋白质原料6 610mol/L HCL10mol/L HCL或或8mol8molL LH H2 2SOSO4 4 水解水解110110120120, ,121224h24h除酸除酸多种氨基多种氨基酸混合物酸混合物水解液水解液 特点分析特点分析 优点优点: :水解迅速、彻底水解迅速、彻底, ,产物均为产物均为L-L-氨基酸氨基酸, ,无消旋作用无消旋作用缺点缺点: :色氨酸色氨酸全部被破坏，全部被破坏，丝氨酸及酪氨酸丝氨酸及酪氨酸部分被破坏部分被破坏, ,有大有大量废酸产生，污染环境。量废酸产生，污染环境。色氨酸色氨酸丝氨酸丝氨酸蛋白质原料蛋白质原料6

7、mol/L NaOH6mol/L NaOH或或4mol/L BaOH4mol/L BaOH 水解水解100100, , 6h6h多种氨基酸混合物多种氨基酸混合物 特点分析特点分析 优点优点: :水解迅速、彻底水解迅速、彻底, ,色氨酸不被破坏色氨酸不被破坏 缺点缺点: :羟基或巯基的氨基酸全部被破坏羟基或巯基的氨基酸全部被破坏, ,且且产生消旋作用产生消旋作用（工业上多不采用工业上多不采用）。）。酪氨酸酪氨酸蛋白质原料蛋白质原料 蛋白水解酶蛋白水解酶T T, ,pHpH氨基酸和小肽氨基酸和小肽工业上很少用该法生产氨基酸而主要用于生产工业上很少用该法生产氨基酸而主要用于生产水解蛋白水解蛋白及蛋白

8、胨及蛋白胨。指表面能发生吸附作用的指表面能发生吸附作用的固体固体, ,一般为多孔微粒或一般为多孔微粒或多孔膜多孔膜, ,具有较大比表面具有较大比表面积积物理吸附物理吸附化学吸附化学吸附离子交换吸附离子交换吸附静电相互作用力静电相互作用力差异差异离子交换树脂离子交换树脂通常用于氨基酸等小分子物质的分离通常用于氨基酸等小分子物质的分离离子交换纤维离子交换纤维, ,离子交换葡聚糖离子交换葡聚糖, ,离子交换树脂离子交换树脂离子交换树脂上所带的功能基团通常分为强酸离子交换树脂上所带的功能基团通常分为强酸性性(R-SOR-SO3 3H),H),弱酸性弱酸性(-COOH),(-COOH),强碱性强碱性(

9、(三甲胺基三甲胺基) )和弱碱性和弱碱性( (伯胺基伯胺基, ,仲胺基仲胺基, ,叔胺基叔胺基) )离子交换剂的结构组成离子交换剂的结构组成共价结合平衡离子Starting conditionsAdsorptions on sample substancesStart of desorptionEnd of desorptionregenerations苯丙氨酸粗品苯丙氨酸粗品( (含少量酪氨酸含少量酪氨酸) )1515倍体积热水倍体积热水调调pH4.0pH4.0溶解溶解脱色脱色过滤过滤滤液滤液浓缩浓缩浓缩液浓缩液9595乙醇乙醇, ,44结晶结晶9595乙醇乙醇 洗涤洗涤烘干烘干苯丙氨酸精品

10、苯丙氨酸精品除去大部分酪除去大部分酪氨酸氨酸水解水解: :110-120 110-120 回流水解回流水解赶酸赶酸: :减压浓缩至糊状减压浓缩至糊状, ,加水稀释加水稀释, ,重复赶酸三次重复赶酸三次吸附、脱色吸附、脱色: :颗粒活性炭柱，进样吸附至流出液出现苯丙氨酸为止，去颗粒活性炭柱，进样吸附至流出液出现苯丙氨酸为止，去离子水洗至流出液离子水洗至流出液pH4.0pH4.0为止，穿柱液与洗涤液合并为止，穿柱液与洗涤液合并沉淀：特殊试剂沉淀法（邻二甲苯沉淀：特殊试剂沉淀法（邻二甲苯4 4磺酸）磺酸）解析：沉淀水洗两次，抽滤，滤饼加去离子水，氨水调解析：沉淀水洗两次，抽滤，滤饼加去离子水，氨水调

11、pHpH至至6-86-8，70-70-8080保温搅拌保温搅拌1 1，冷却，过滤，沉淀再水洗两次，冷却，过滤，沉淀再水洗两次发酵法是一个从头合成的生物过程发酵法是一个从头合成的生物过程, ,涉及多种酶的参与涉及多种酶的参与, ,其原料主要是碳源、氮源、无机盐和微生物菌种其原料主要是碳源、氮源、无机盐和微生物菌种谷丙转氨酶可使谷丙转氨酶可使GluGlu氨氨基转移到丙酮酸上生成基转移到丙酮酸上生成L LAlaAla谷草转氨酶可使谷草转氨酶可使Glu的氨基转移到草酰乙的氨基转移到草酰乙酸上生成酸上生成LAspL-Asp是是L-Lys的的前体前体,LGlu是是LPro的前体的前体图图1 1微生物界糖代

12、谢中间产物及氨基酸之间的转化关系微生物界糖代谢中间产物及氨基酸之间的转化关系培养基培养基配制与灭菌处理菌种菌种诱变与选育菌种培养、灭菌及接种发酵产品提取及分离纯化工业发酵培养基工业发酵培养基中碳源中碳源: :淀粉水解淀粉水解糖、糖蜜、甘薯糖、糖蜜、甘薯粉等粉等氮源一般为硫酸铵、氮源一般为硫酸铵、尿素或豆饼水解液尿素或豆饼水解液AaAa生产菌种主要生产菌种主要为细菌为细菌, ,其次是酵其次是酵母菌母菌1)1)野生型野生型2)2)诱变菌株诱变菌株3)3)杂种菌株杂种菌株 4)4)基因工程菌基因工程菌平板或斜面培养平板或斜面培养种子培养种子培养发酵培养发酵培养产谷氨酸棒状杆菌产谷氨酸棒状杆菌, ,短

13、杆菌短杆菌产缬氨酸棒状杆菌突变株产缬氨酸棒状杆菌突变株AS1.586AS1.586北京棒状杆菌和钝齿棒状杆菌原生质体融合北京棒状杆菌和钝齿棒状杆菌原生质体融合苏氨酸苏氨酸, ,色氨酸工程菌已工业化色氨酸工程菌已工业化摇瓶培养摇瓶培养发酵罐发酵罐 种子罐培养种子罐培养菌种筛选菌种筛选（2 2）工艺路线）工艺路线菌种培养菌种培养: :一级种子培养（斜面一级种子培养（斜面摇瓶摇瓶,30,30,16h,16h）二级种子培养（接种量二级种子培养（接种量3.53.5, ,8h)8h)接种接种: :5m5m3 3发酵罐发酵罐, ,发酵液装量发酵液装量3 3吨吨, ,接种量接种量1 1，发酵条件发酵条件: :

14、180rpm, 180rpm, 通气量通气量0.2vvm0.2vvm，30-3130-31,60h60h过滤过滤: :发酵液加热至发酵液加热至100100, ,维持维持10min,10min,冷却过滤（冷却过滤（1 1）, ,滤滤液，调液，调pH3.5pH3.5，过滤（，过滤（2 2）去沉淀）去沉淀纯化纯化: :H+H+732732阳离子交换法，滤液流速阳离子交换法，滤液流速: :树脂量的树脂量的1.51.5/min/min洗涤洗涤: :用用100L100L去离子水洗脱：用去离子水洗脱：用6060，0.5mol/0.5mol/氨水氨水3L/min3L/min洗脱洗脱一级种子培养(摇瓶）一级种子

15、罐扩大培养（二级发酵）二级种子罐扩大培养（三级发酵）种子罐接种方式:（1）降压法将茄子瓶接种针插入接种口,降低种子罐压力,菌悬液自动从茄子瓶注入种子罐（2）火焰封口接种法种子罐接种口周围设有沟槽，接种前向其中注入少量酒精，用火点燃，在接种口形成一圈火焰，在火焰圈中将种子液倒入即可二级种子培养（种子罐）注意培养基的优化注意培养基的优化Response surface methodology (RSM)Response surface methodology (RSM)响应面法响应面法(Response Surface Methodology, RSM) (Response Surface Met

16、hodology, RSM) 是一种寻找多因素系统是一种寻找多因素系统中最佳条件的数学统计方法中最佳条件的数学统计方法, ,也称回归设计。它能有效地结合数学方法和统也称回归设计。它能有效地结合数学方法和统计分析计分析, ,以最经济的方式，用很少的实验数量和时间对实验进行全面研究，以最经济的方式，用很少的实验数量和时间对实验进行全面研究，定向地优化响应因子定向地优化响应因子 Y = A0 + Ai Xi + AiiXii 2+ AijXiXj 工业发酵罐接种方式工业发酵罐接种方式: :通过装有阀门（隔膜通过装有阀门（隔膜阀或球心阀）的接种阀或球心阀）的接种管道接种管道接种, ,种子罐压种子罐压力

17、力 发酵罐压力发酵罐压力0.05MP0.05MP以上以上, ,利用压利用压差将种子液输入发酵差将种子液输入发酵罐罐注意发酵条件的优注意发酵条件的优化化等电点沉等电点沉淀淀预处理预处理: :热热沉淀沉淀离子交换树脂柱离子交换树脂柱氨基酸前体氨基酸前体相应底物相应底物固定化酶固定化酶或细胞或细胞AaAa反应液反应液分离纯化分离纯化AaAa成品成品反应器反应器延胡羧酸延胡羧酸+ +铵盐铵盐L-L-天冬氨酸天冬氨酸天冬氨酸酶天冬氨酸酶L-L-天冬氨酸天冬氨酸L-L-丙氨酸丙氨酸天冬氨酸天冬氨酸- -脱羧脱羧酶酶L-L-精氨酸精氨酸L-L-瓜氨酸瓜氨酸精氨酸脱亚胺酶精氨酸脱亚胺酶吲哚吲哚+L-+L-丝氨

18、酸丝氨酸L-L-色氨酸色氨酸色氨酸合成酶色氨酸合成酶甘氨酸甘氨酸+ +甲醇甲醇L-L-丝氨酸丝氨酸丝氨酸转羟丝氨酸转羟甲基酶甲基酶甘氨酸甘氨酸+ +乙醛乙醛L-L-苏氨酸苏氨酸苏氨酸醛苏氨酸醛缩酶缩酶酶催化的手性拆分法酶催化的手性拆分法: :可拆分的外消旋体可拆分的外消旋体Aa:Aa: DL-DL-蛋氨酸、蛋氨酸、DL-DL-缬氨酸、缬氨酸、DL-DL-苯丙氨酸、苯丙氨酸、DL-DL-色氨酸、色氨酸、DL-DL-丙氨酸及丙氨酸及DL-DL-苏氨酸等苏氨酸等拆分用酶拆分用酶: :氨基酰化酶氨基酰化酶化学名化学名: :-氨基丁二酸或氨基琥珀酸氨基丁二酸或氨基琥珀酸外观外观: :纯品为白色菱形叶片状

19、结晶纯品为白色菱形叶片状结晶 酸性酸性AaAa理化性质理化性质 菱形结晶（水和乙醇）菱形结晶（水和乙醇）等电点等电点: :6.0,中性氨基酸中性氨基酸溶解性溶解性: : 易溶于水易溶于水, ,微溶于乙醇，不溶于丙酮及乙醚。微溶于乙醇，不溶于丙酮及乙醚。旋光性旋光性: : 2525D D =+18 =+18（C C0.50.52.02.0，在水中），在水中） 2525D D= =14.614.6(C(C0.50.52.02.0，在，在5mol/L HCl5mol/L HCl中）中） L-AlaL-AlaL-ASPL-ASP发酵培发酵培养液养液调调pH5.0pH5.04545保温保温1h,1h,室

20、温室温含天冬氨酸酶的菌体含天冬氨酸酶的菌体100010002000L2000L一级种子一级种子发酵法生产天冬氨酸酶的过程发酵法生产天冬氨酸酶的过程: :扩培发酵新鲜斜面发酵培发酵培养液养液调调pH4.75pH4.753030保温保温1h,1h,含含L-L-天冬氨酸天冬氨酸-脱羧酶的菌体脱羧酶的菌体100010002000L2000L一级种子一级种子30 30 8h 8h二级种子二级种子30 30 24h 24hL-L-天冬氨酸天冬氨酸-脱羧酶的发酵生产脱羧酶的发酵生产发酵发酵填充床反应器填充床反应器延胡索酸铵底物延胡索酸铵底物溶液溶液(37 pH8.5)pH8.5)生物反应堆生物反应堆1 1转

21、化液转化液L-AspL-Asp转化率转化率9595磷酸吡哆醛磷酸吡哆醛pH6.0pH6.037 37 生物反应堆生物反应堆2 2转化率转化率9595连续流连续流 转化液转化液L-AlaL-Ala分离分离L-L-天冬氨酸天冬氨酸- -脱羧酶脱羧酶L-AspL-Asp转化液转化液滤液滤液过滤过滤调调pH2.8pH2.855结晶过夜结晶过夜过滤过滤结晶结晶冷水洗涤冷水洗涤抽干抽干105105干燥干燥L-AspL-Asp粗品粗品稀氨水溶解稀氨水溶解活性炭脱色活性炭脱色滤液过滤过滤55结晶过夜结晶过夜过滤过滤结晶结晶真空干燥真空干燥药用药用L-Asp L-Asp L-AlaL-Ala的纯化与精制略的纯化与精制略必需氨基酸必需氨基酸外观外观: :白色叶片状晶体白色叶片状晶体, ,无臭无臭, ,微苦微苦pIpI为为5.485.48; ;溶解性溶解性: :在在2525水中溶解度为水中溶解度为2.962.96，在，在7575水中为水中为6.626.62，微溶于甲醇及乙醇，不溶于乙醚。微溶于甲醇及乙醇，不溶于乙醚。旋光性旋光性: :2525D D-4.47-4.47( (在在5mol/L