PCR技术原理及心得.

1、PCR 技术原理与心得体会PCR 产物的电泳检测时间一般为 48h 以内，有些最好于当日电泳检测，大于 48h 后带型不规则甚致消失。一 假阴性，不出现扩增条带PCR 反应的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量 及活性 PCR 循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板:模板中含有杂蛋白质，模板中含有 Taq 酶抑制剂,模板中蛋白质没有 消化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理,模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固 定不

2、宜随意更改。酶失活:需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够 而导致假阴性。需注意的是有时忘加 Taq 酶或溴乙锭。引物:引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是 PCR 失败或扩增条 带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为:选定一个好的引物合成单 位。引物的浓度不仅要看 0D 值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有 引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做 PCR 有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮

3、度 低,在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长 期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不够，引 物之间形成二聚体等。Mg2+浓度:Mg2+离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大，浓度过高可降低 PCR 扩 增的特异性，浓度过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变：通常进行 PCR 扩增采用的体积为 20ul、30ul、50ul。或 100ul, 应用多大体积进行 PCR 扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如 20ul后,再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。物理原因：变性对

4、 PCR 扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能 出现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低 PCR 扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测 一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是 PCR 失败的原因之一。靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列 某段缺失使引物与模板失去互补序列，其 PCR 扩增是不会成功的。二假阳性,出现非特异性扩增带1.假阳性出现的 PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，

5、因而在进行 PCR 扩增时，扩增出的 PCR 产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假 阳性。需重新设计引物。靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段 的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止 将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。 可互相拼接，与引物互 补后，可扩增出 PCR 产物,而导致假阳性的

6、产生，可用巢式 PCR 方法来减轻或消除。2出现非特异性扩增带PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩 增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因:一是引物与靶序列不完全互 补、或引物聚合形成二聚体。二是 Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及 PCR 循 环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一 来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新 设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93C变性,65C左右退火与延 伸。3.

7、出现片状拖带或涂抹带PCR 扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或 酶的质量差，dNTP 浓度过高,Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其 对策有:减少酶量，或调换另一来源的酶。减少 dNTP 的浓度。适当降低 Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。三. PCR 污染与对策PCR 反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。污染原因(一标本间交叉污染：标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由 于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染；标本核酸模板在 提取过程中

8、，由于吸样枪污染导致标本间污染；有些微生物标本尤其是病毒可随气溶 胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。匚 PCR 试剂的污染：主要是由于在 PCR 试剂配制过程中，由于加样枪、容器、 双蒸水及其它溶液被 PCR 核酸模板污染.（三 PCR 扩增产物污染：这是 PCR 反应中最主要最常见的污染问题，因为 PCR产 物拷贝量 大（一般为 1013 拷贝/ml,远远高于 PCR 检测数个拷贝的极限，所以极微量的 PCR 产物污染,就可造成假阳就可形成假阳性。还有一种容易忽视，最可能造成 PCR 产物污染的形式是气溶胶污染；在空气与液 体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时

9、、吸样时及污 染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含 48000 拷 贝,因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题（四实验室中克隆质粒的污染：在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对 照的检验室，这个问题也比较常见。因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖 的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。污染的监测一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。四. 对照试验1. 阳性对照:在建立 PCR 反应实验室及一般的检验单位都应

10、设有 PCR 阳性对照,它是 PCR反应是否成功、 产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参 考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以 重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高（100 个拷贝以下，但阳性对照尤其是重组质 粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR 试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。2. 阴性对照:每次 PCR 实验务必做阴性对照。它包括标本对照：被检的标本是 血清就用鉴定后的正常血清作对照；被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作 对照。试剂对照:在 PCR 试剂中不加模板

11、 DNA 或 RNA,进行 PCR 扩增,以监测试 剂是否污染。3.重复性试验4.选择不同区域的引物进行 PCR 扩增五. 防止污染的方法（一合理分隔实验室：将样品的处理、配制 PCR 反应液、PCR 循环扩增及 PCR 产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及 PCR 产物的鉴定应与其它 步骤严格分开。最好能划分标本处理区：PCR 反应液制备区；PCR 循环扩增区：PCR 产物鉴定区。 其实验用品及吸样枪应专用，实验前应 将实验室用紫外线消毒以破坏残留的 DNA 或 RNA。（二吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题。由于操作时不慎将样品或模板 核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污

12、染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免 交叉污染或产生气溶胶污染。（三预混和分装 PCR 试剂:所有的 PCR 试剂都应小量 分装，如有可能，PCR 反应液应预先配制好，然后小量分装，-20C保存。以减少 重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR 试剂，PCR 反应液应与样品及 PCR 产 物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。（四防止操作人员污染，使用一次性 手套、吸头、小离心管应一次性使 用。（五设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性 对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能 性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作 阴性对照。（六减少 PCR