组织培养学实验

1、植物组织培养实验植物组织培养实验教师：叶水英教师：叶水英实验一、熟悉和整理植物实验一、熟悉和整理植物组织培养实验室组织培养实验室 一、实验目的：一、实验目的： 了解植物组织培养实验室的设置及基本了解植物组织培养实验室的设置及基本设备，学习基本仪器设备的使用原理与方设备，学习基本仪器设备的使用原理与方法，掌握植物组织培养的一些基本技术。法，掌握植物组织培养的一些基本技术。 二、实验内容：二、实验内容： （一）组培实验室的设置（一）组培实验室的设置 我系组培实验：植物实验室、分子生物实验室、我系组培实验：植物实验室、分子生物实验室、组培室三大个实验室组成。组培室三大个实验室组成。 一个标准的组织培

2、养实验室应当包括：准备室、一个标准的组织培养实验室应当包括：准备室、接种室、培养室、驯化室等，准备室又称为化学接种室、培养室、驯化室等，准备室又称为化学实验室或通用实验室，可由洗涤室、培养基配制实验室或通用实验室，可由洗涤室、培养基配制室和灭菌室构成。在实际中可结合可行条件，合室和灭菌室构成。在实际中可结合可行条件，合并一部分。各分室能满足实验准备（器皿的洗涤并一部分。各分室能满足实验准备（器皿的洗涤与存放、培养基制备和无菌操作、用具的灭菌）、与存放、培养基制备和无菌操作、用具的灭菌）、无菌操作和控制培养三项基本工作的需要。无菌操作和控制培养三项基本工作的需要。 1、准备室、准备室 由洗涤室、

3、培养基配制室和灭菌室构成。由洗涤室、培养基配制室和灭菌室构成。 （1）洗涤室）洗涤室(cleaning room) 用于玻璃器皿和实验用具的洗涤、干燥和贮存；用于玻璃器皿和实验用具的洗涤、干燥和贮存；培养材料的预处理与清洗；组培苗的出瓶、清洗培养材料的预处理与清洗；组培苗的出瓶、清洗与整理等。与整理等。 室内应配备大型水槽，最好是白瓷水槽。为防止室内应配备大型水槽，最好是白瓷水槽。为防止碰坏玻璃器皿，可铺垫橡胶。上下水道要畅通。碰坏玻璃器皿，可铺垫橡胶。上下水道要畅通。备有塑料筐，用于运输培养器皿。备有干燥架，备有塑料筐，用于运输培养器皿。备有干燥架，用于放置干燥涮净的培养器皿。用于放置干燥涮

4、净的培养器皿。 （2）培养基配制室）培养基配制室 用于培养基的配制。用于培养基的配制。 要求房间宽敞明亮、通风、干燥、清洁卫生，要求房间宽敞明亮、通风、干燥、清洁卫生，便于多人同时操作；有电源、自来水和水槽便于多人同时操作；有电源、自来水和水槽（池），保证上下水道畅通。有时可将配制（池），保证上下水道畅通。有时可将配制室内部间隔为称量分室和配制分室。规模较室内部间隔为称量分室和配制分室。规模较小时，配制室可与洗涤室合并为准备室。小时，配制室可与洗涤室合并为准备室。 仪器与用具配置：仪器与用具配置：电子天平、磁力搅拌器、蒸馏水器、电子天平、磁力搅拌器、蒸馏水器、酸度计、恒温水浴锅、电炉（或微波炉

5、、电饭煲、液化酸度计、恒温水浴锅、电炉（或微波炉、电饭煲、液化气炉灶等）、冰箱等仪器设备；移液管（或微量移液气炉灶等）、冰箱等仪器设备；移液管（或微量移液器）、移液管架、培养瓶（包括试管）、棕色或透明试器）、移液管架、培养瓶（包括试管）、棕色或透明试剂瓶、烧杯（带或不带刻度）、量筒、容量瓶、培养皿、剂瓶、烧杯（带或不带刻度）、量筒、容量瓶、培养皿、吸管、打孔器、玻璃棒、标签纸、记号笔、耐高温高压吸管、打孔器、玻璃棒、标签纸、记号笔、耐高温高压塑料薄膜等封口材料、周转筐、尼龙绳、脱脂棉、纱布、塑料薄膜等封口材料、周转筐、尼龙绳、脱脂棉、纱布、工作台、蒸馏水桶、医用小推车等用品和用具。此外，工作台

6、、蒸馏水桶、医用小推车等用品和用具。此外，配备器械柜和药品柜，分别存放接种用具和分类存放化配备器械柜和药品柜，分别存放接种用具和分类存放化学试剂（可改为药品）。最好配备防尘设备，以减少灰学试剂（可改为药品）。最好配备防尘设备，以减少灰尘污染。尘污染。 （3）灭菌室）灭菌室 用于培养基、器皿、工具和其他物品的消毒灭菌。用于培养基、器皿、工具和其他物品的消毒灭菌。 要求安全、通风、明亮；墙壁和地面防潮、耐高温；配要求安全、通风、明亮；墙壁和地面防潮、耐高温；配备水源、水槽（池）、电源或煤气加热装置和供排水设备水源、水槽（池）、电源或煤气加热装置和供排水设施；保证上下水道畅通，通风措施良好。生产规模

7、较小施；保证上下水道畅通，通风措施良好。生产规模较小时，可与洗涤室、配制室合并在一起，但灭菌锅的摆放时，可与洗涤室、配制室合并在一起，但灭菌锅的摆放位置要远离天平和冰箱，而且必须设置换气窗或换气扇，位置要远离天平和冰箱，而且必须设置换气窗或换气扇，以利通风换气。以利通风换气。 仪器与用具配置：仪器与用具配置：高压灭菌锅、干热消毒柜或烘箱、细高压灭菌锅、干热消毒柜或烘箱、细菌过滤装置、工作台、培养基存放架或橱柜、周转筐、菌过滤装置、工作台、培养基存放架或橱柜、周转筐、换气扇、医用小推车等。换气扇、医用小推车等。 2、无菌操作室（、无菌操作室（transfering room） 进行植物材料的接种

8、、培养物的转移等无菌操作，因此进行植物材料的接种、培养物的转移等无菌操作，因此接种室也称为无菌操作室。其无菌条件的好坏对组织培接种室也称为无菌操作室。其无菌条件的好坏对组织培养的成功与否起着重要作用。养的成功与否起着重要作用。 在工作方便的前提下，接种室宜小不宜大，一般在工作方便的前提下，接种室宜小不宜大，一般78m2，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置推拉门，以减少开关门时的空气扰动。清洁和消毒。配置推拉门，以减少开关门时的空气扰动。 接种室要求干爽安静，清洁明亮。在适当位置吊装接种室要求干爽安静，清洁明亮。在适当位置吊装1

9、-2盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。最好安装一小型空调，盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。 仪器与用具配置：超净工作台、空调机、解剖镜、接种仪器与用具配置：超净工作台、空调机、解剖镜、接种器具消毒器器具消毒器(或高温焚化炉或高温焚化炉)、紫外光灯、酒精灯、广口、紫外光灯、酒精灯、广口瓶、三角瓶、搪瓷盘、接种工具、手持喷雾器、工作台、瓶、三角瓶、搪瓷盘、接种工具、手持喷雾器、工作台、搁架、接种用的小平车、不锈钢长方形饭盒搁架、接种用的小平车、不锈钢长方形饭盒(盛放盛放7075%酒精，

10、用于浸泡接种工具酒精，用于浸泡接种工具)或医院用消毒盒等。配或医院用消毒盒等。配置污物桶，以便存放接种过程中的丢弃物，须每天清洗置污物桶，以便存放接种过程中的丢弃物，须每天清洗更换。更换。 进入无菌室前，为了防止带菌空气直接进入接种室和工进入无菌室前，为了防止带菌空气直接进入接种室和工作人员进出接种室时带进杂菌，接种人员在缓冲间更衣、作人员进出接种室时带进杂菌，接种人员在缓冲间更衣、换鞋、洗手、戴上口罩后，才能进入接种室。应当在此换鞋、洗手、戴上口罩后，才能进入接种室。应当在此室内安装灭菌用的紫外灯。室内安装灭菌用的紫外灯。 3、培养室（、培养室（culturing room） 培养室是将接种

11、的材料进行培养生长的场所。培养室的培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。高度而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。高度比培养架略高为宜，周围墙壁要求有绝热防火的性能。比培养架略高为宜，周围墙壁要求有绝热防火的性能。 培养材料放在培养架上培养。培养架大多由金属制成，培养材料放在培养架上培养。培养架大多由金属制成，一般一般 设设5、6层，最低一层离地高约层，最低一层离地高约l0-20cm，其他每层，其他每层间隔间隔30cm左右，培养架即高左右，

12、培养架即高1.7m左右。培养架长度都左右。培养架长度都是根据日光灯的长度而设计，如采用是根据日光灯的长度而设计，如采用40W日光灯，则长日光灯，则长1.3m，30W的长的长lm，宽度一般为，宽度一般为60cm。 培养室最重要的因子是温度，一般保持在培养室最重要的因子是温度，一般保持在2027左左右，具备产热装置，并安装窗式或立式空调机。由于热右，具备产热装置，并安装窗式或立式空调机。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，最好不同带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，最好不同种类有不同的培养室。室内湿度也要求恒定，相对湿度种类有不同的培养室。室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在以保持在

13、7080为好，可安装加湿器。为好，可安装加湿器。 控制日光照时间可安装定时开关钟，一般需要每天光照控制日光照时间可安装定时开关钟，一般需要每天光照1016h也有的需要连续照明。现代组培实验室大多设也有的需要连续照明。现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源，这样不但可以节计为采用天然太阳光照作为主要能源，这样不但可以节省能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。省能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。在阴雨天可用灯光作补充。在阴雨天可用灯光作补充。 4、驯化室、驯化室 驯化室要求清洁无菌，配有空调机、加湿器、恒温恒湿驯化室要求清洁无菌，配有空调机、加湿器、恒温恒湿控

14、制仪、喷雾器、光照调节装置、通风口以及必要的杀控制仪、喷雾器、光照调节装置、通风口以及必要的杀菌剂。菌剂。 （二）组培实验室常用仪器设备（二）组培实验室常用仪器设备 1、常用仪器设备、常用仪器设备 （1）超净台）超净台 最常用最普及的无菌操作装置最常用最普及的无菌操作装置,主要通过风机主要通过风机,送送入的空气经过细菌过滤装置入的空气经过细菌过滤装置,再流过工作台面再流过工作台面.因因此此,超净工作台应放置在空气干净超净工作台应放置在空气干净,地面无灰尘的地面无灰尘的地方地方,以延长使用期以延长使用期.使用过久使用过久,引起堵塞引起堵塞,需要清洗需要清洗和更换过滤器。和更换过滤器。 （2）高压

15、灭菌锅）高压灭菌锅 是最基本的设备，用于培养基是最基本的设备，用于培养基.器械等的灭菌。器械等的灭菌。 （3）空调机）空调机 保证室内温度，一般为保证室内温度，一般为252，应安置在室内，应安置在室内较高的位置。以便于排热散凉。较高的位置。以便于排热散凉。 （4）光照培养箱）光照培养箱 用于植物材料的特定培养，可以控制温度、湿度用于植物材料的特定培养，可以控制温度、湿度及光照等。及光照等。 （5）烘箱）烘箱 洗净后的玻璃器皿，如需迅速干燥，可放在烘箱内烘干，洗净后的玻璃器皿，如需迅速干燥，可放在烘箱内烘干，温度以温度以80-100为宜若需干热灭菌，温度升高至为宜若需干热灭菌，温度升高至150-

16、160 ,持续持续1-3小时即可小时即可 （6）冰箱）冰箱 某些试剂药品和母液需低温保存，有些材料需低温处某些试剂药品和母液需低温保存，有些材料需低温处理，需要使用冰箱理，需要使用冰箱 （7）电子分析天平）电子分析天平 电子分析天平，用于称取大量元素、微量元素、维生素、电子分析天平，用于称取大量元素、微量元素、维生素、激素等微量药品精确度为激素等微量药品精确度为0.0001g；托盘天平用于称取；托盘天平用于称取用量较大的糖和琼脂等，其精确度为用量较大的糖和琼脂等，其精确度为0.1g。天平应放置。天平应放置在干燥、不受震动的天平操作台上。在干燥、不受震动的天平操作台上。 （8）显微镜及解剖镜，）

17、显微镜及解剖镜， 种类较多，用于分离微茎尖可采用双筒实体解剖镜。双种类较多，用于分离微茎尖可采用双筒实体解剖镜。双筒解剖镜在分离茎尖等较小组织时，便于观察、操作，筒解剖镜在分离茎尖等较小组织时，便于观察、操作，通常放大通常放大5-80倍。放大倍。放大40倍以上操作需要有相当熟练的倍以上操作需要有相当熟练的技术和较好的工具。为进行操作，要有照明装置。解剖技术和较好的工具。为进行操作，要有照明装置。解剖镜上带有照相装置，根据需要随时对所需材料进行摄影镜上带有照相装置，根据需要随时对所需材料进行摄影记录。记录。 （9）摇床与转床）摇床与转床 用于改善液体培养材料的通气状况及促进酶解原生质体用于改善液

18、体培养材料的通气状况及促进酶解原生质体的解离。一般在液体培养中转速为每分钟的解离。一般在液体培养中转速为每分钟100次左右，次左右，在解离原生质体时为每分钟在解离原生质体时为每分钟80左右。左右。 （10）磁力搅拌器）磁力搅拌器 磁力搅拌器用于加速搅拌难溶的物质，如各种化学物质、磁力搅拌器用于加速搅拌难溶的物质，如各种化学物质、琼脂粉等。磁力搅拌器还可加热，使之更利于溶解。琼脂粉等。磁力搅拌器还可加热，使之更利于溶解。 （11）培养架）培养架 进行固体培养和试管苗大量繁殖时进行固体培养和试管苗大量繁殖时,需要有放置培养瓶需要有放置培养瓶的培养架。的培养架。 （12）酸度计）酸度计 组织培养中培

19、养基组织培养中培养基pH值的准确度是十分重要的，应当值的准确度是十分重要的，应当使用酸度计，若无酸度计，也可使用使用酸度计，若无酸度计，也可使用pH试纸进行粗测。试纸进行粗测。 （13）离心机）离心机 用于收集原生质体，转速要求较低。一般为用于收集原生质体，转速要求较低。一般为10004000rpm即可。即可。 （三）必要的器皿（三）必要的器皿 1、玻璃器皿、玻璃器皿 长时间培养和贮存药液用的玻璃器皿，要求由碱性溶解度小的硬长时间培养和贮存药液用的玻璃器皿，要求由碱性溶解度小的硬质玻璃制成，而且能够耐高压灭菌。质玻璃制成，而且能够耐高压灭菌。 （1）培养器皿）培养器皿 装入培养基进行植物材料的

20、培养，根据培养目的和要求不同，可装入培养基进行植物材料的培养，根据培养目的和要求不同，可以采用不同种类和规格的玻璃器皿。试管、三角瓶（或锥形瓶）、以采用不同种类和规格的玻璃器皿。试管、三角瓶（或锥形瓶）、培养皿。通常以纱布包被棉花塞，外面再包一层牛皮纸，用线绳培养皿。通常以纱布包被棉花塞，外面再包一层牛皮纸，用线绳或橡皮筋扎好。现在多采用聚丙烯塑料薄膜作为封口，以线绳结或橡皮筋扎好。现在多采用聚丙烯塑料薄膜作为封口，以线绳结扎或橡皮圈箍扎。为了增加通气性，可在里面衬一层硫酸纸或牛扎或橡皮圈箍扎。为了增加通气性，可在里面衬一层硫酸纸或牛皮纸。这样经济方便，且通气好。也可采用专用的封口膜。以达皮纸

21、。这样经济方便，且通气好。也可采用专用的封口膜。以达到防止培养基干燥和杜绝污染的目的。到防止培养基干燥和杜绝污染的目的。 目前，培养容器和制备培养基所需的玻璃器皿逐渐被塑目前，培养容器和制备培养基所需的玻璃器皿逐渐被塑料器皿所代替。塑料容器具有质轻、透明、不易破碎、料器皿所代替。塑料容器具有质轻、透明、不易破碎、成本低等优点，如培养容器多为平底方盒形，可提高培成本低等优点，如培养容器多为平底方盒形，可提高培养空间利用率的植株数，并能一层层地叠摞起来，从而养空间利用率的植株数，并能一层层地叠摞起来，从而节约空间。这类塑料制品多是采用聚丙烯材料制成，能节约空间。这类塑料制品多是采用聚丙烯材料制成，

22、能耐高温，可进行高压灭菌。有些产品为一次性消耗品，耐高温，可进行高压灭菌。有些产品为一次性消耗品，不但可节省洗涤人工，还可节省时间，提高效率。一次不但可节省洗涤人工，还可节省时间，提高效率。一次性塑料容器或带螺丝帽的玻璃瓶，无须另外配盖，使用性塑料容器或带螺丝帽的玻璃瓶，无须另外配盖，使用时比较方便。时比较方便。 （2）盛装器皿）盛装器皿 配制培养基时，各种药品的溶解，储备均需要各种规格配制培养基时，各种药品的溶解，储备均需要各种规格的烧杯、试剂瓶等。大烧杯用于培养基的熔化，成本高，的烧杯、试剂瓶等。大烧杯用于培养基的熔化，成本高，易破，可以用搪瓷盆代替。易破，可以用搪瓷盆代替。 2计量器皿计

23、量器皿 母液的配制、药液的分装、吸取需要玻璃计量器皿，如母液的配制、药液的分装、吸取需要玻璃计量器皿，如10ml、25 ml、50 ml、100 ml、200 ml、500 ml、1000 ml的量筒，的量筒，25 ml、50 ml、100 ml、200 ml、500 ml、1000 ml、2000 ml的容量瓶，以及的容量瓶，以及0.1 ml、0.2 ml、0.5 ml、1 ml、2 ml 、5 ml的移液管，用于配的移液管，用于配制培养基时吸取不同种类的母液。应多准备几支，分开制培养基时吸取不同种类的母液。应多准备几支，分开使用。使用。 3、其他器皿：如滴瓶、称量瓶、玻璃棒、漏斗、玻璃、其

24、他器皿：如滴瓶、称量瓶、玻璃棒、漏斗、玻璃管、注射器等实验室常用器皿应具备。管、注射器等实验室常用器皿应具备。 2、金属器械报告：组织培养常用的金属器械，可选用、金属器械报告：组织培养常用的金属器械，可选用医疗器械或微生物实验所用的器械。医疗器械或微生物实验所用的器械。 （1）镊子类：常应用医疗上的镊子。根据操作需要有）镊子类：常应用医疗上的镊子。根据操作需要有各种类型，若用各种类型，若用l00ml的三角瓶作为培养瓶，可用的三角瓶作为培养瓶，可用20em长的镊子。镊子过短容易使手接触瓶口，造成污染。长的镊子。镊子过短容易使手接触瓶口，造成污染。镊子太长，使用起来不灵活。镊子太长，使用起来不灵活

25、。 （2）剪刀类：可采用医疗五官科用的中型剪刀。主要）剪刀类：可采用医疗五官科用的中型剪刀。主要用于切断茎段、叶片等。也可以用弯形剪刀，由于其头用于切断茎段、叶片等。也可以用弯形剪刀，由于其头部弯曲，可以深入到瓶口中进行剪切。部弯曲，可以深入到瓶口中进行剪切。 （3）解剖刀）解剖刀 切割较小材料和分离茎尖分生组织时，可用切割较小材料和分离茎尖分生组织时，可用解剖刀。刀片要经常调换，使之保持锋利状解剖刀。刀片要经常调换，使之保持锋利状态，否则切割时会造成挤压，引起周围细胞态，否则切割时会造成挤压，引起周围细胞组织大量死亡，影响培养效果。组织大量死亡，影响培养效果。 （4）接种针）接种针 用来转移

26、细胞和愈伤组织。用来转移细胞和愈伤组织。 （四）实验用具的洗涤和灭菌（四）实验用具的洗涤和灭菌 1、器皿的清洗、器皿的清洗 植物组织培养最重要的，也是最基本的要求，就是各项植物组织培养最重要的，也是最基本的要求，就是各项操作都应从无毒害、无污染的培养环境来考虑。培养过操作都应从无毒害、无污染的培养环境来考虑。培养过程中最经常、最大量的工作之一，是洗涤培养瓶及其它程中最经常、最大量的工作之一，是洗涤培养瓶及其它常用器皿。在清洗器皿处应有较大的水池，水池应用水常用器皿。在清洗器皿处应有较大的水池，水池应用水泥制作，白瓷砖砌内外表面，池底另放一张橡胶垫，以泥制作，白瓷砖砌内外表面，池底另放一张橡胶垫

27、，以减少器皿破损。自来水龙头宜采用三孔鹅颈式的，用水减少器皿破损。自来水龙头宜采用三孔鹅颈式的，用水方便，并在需要时可加装抽滤器。下水道应畅通，以免方便，并在需要时可加装抽滤器。下水道应畅通，以免妨碍工作。除水池外，还需辅助以若干盆与桶。妨碍工作。除水池外，还需辅助以若干盆与桶。 最常用的洗涤助剂就是家庭用的洗衣粉及肥皂两种，备最常用的洗涤助剂就是家庭用的洗衣粉及肥皂两种，备一点去污粉也有些用处。如果冷的洗衣粉水效力欠佳，一点去污粉也有些用处。如果冷的洗衣粉水效力欠佳，可以增加浓度或适当加热。这已可以处理许多清洗中的可以增加浓度或适当加热。这已可以处理许多清洗中的问题。没必要使用铬酸问题。没必

28、要使用铬酸-硫酸洗液，因为使用这种洗液硫酸洗液，因为使用这种洗液要十分小心，而且效率也不高。洗瓶时先将瓶子在清水要十分小心，而且效率也不高。洗瓶时先将瓶子在清水中泡一会儿，然后在水龙头下涮去瓶内污物，沥干水，中泡一会儿，然后在水龙头下涮去瓶内污物，沥干水，泡入浓洗衣粉水中，再用瓶刷沿瓶壁上下刷动和呈圆周泡入浓洗衣粉水中，再用瓶刷沿瓶壁上下刷动和呈圆周旋转两个方向刷洗。瓶外也要刷到，不要留下未刷到之旋转两个方向刷洗。瓶外也要刷到，不要留下未刷到之处。刷后放到水龙头下用流水冲刷处。刷后放到水龙头下用流水冲刷4次，以彻底冲去洗次，以彻底冲去洗衣粉残留物。衣粉残留物。 洗好的瓶子应透明锃亮，内外壁水膜

29、均一，不挂水珠，洗好的瓶子应透明锃亮，内外壁水膜均一，不挂水珠，即表示无污迹存在。通常无须乎再用蒸馏水涮一遍，直即表示无污迹存在。通常无须乎再用蒸馏水涮一遍，直接置于搁架上沥晾水汽。也可制作晾洗架，瓶子倒放在接置于搁架上沥晾水汽。也可制作晾洗架，瓶子倒放在孔格中或挂在小木棍上，这样洗后要摆一遍瓶子，用时孔格中或挂在小木棍上，这样洗后要摆一遍瓶子，用时再收一次瓶子。急等使用的瓶子可以用烘箱烘干。烘时再收一次瓶子。急等使用的瓶子可以用烘箱烘干。烘时缓慢升温，温度也无须太高。新买进的瓶子亦可按上述缓慢升温，温度也无须太高。新买进的瓶子亦可按上述方法处理。移液管之类的仪器，可用橡皮吸球方法处理。移液管

30、之类的仪器，可用橡皮吸球(洗耳球洗耳球)和热洗衣粉水吸洗，再放水龙头下流水冲净，垂直放置和热洗衣粉水吸洗，再放水龙头下流水冲净，垂直放置晾干。带刻度的计量仪器不宜烘烤，以免玻璃变形，影晾干。带刻度的计量仪器不宜烘烤，以免玻璃变形，影响计量的准确度。如洗后急等使用，只要用要吸量的液响计量的准确度。如洗后急等使用，只要用要吸量的液体吸弃数次，或用体吸弃数次，或用95%酒精吸弃数次后，即可使用。酒精吸弃数次后，即可使用。 2、灭菌、灭菌 （1）器皿和用具常用灭菌方法：）器皿和用具常用灭菌方法： 1、热压灭菌法（学习操作）、热压灭菌法（学习操作） 将洗净的培养器皿，用具，用牛皮纸包好，放将洗净的培养器

31、皿，用具，用牛皮纸包好，放入高压消毒锅中，入高压消毒锅中，1.1压力下灭菌压力下灭菌2030分钟。分钟。 2、干热灭菌法、干热灭菌法 洗净的玻璃器皿置于电热干燥箱中，洗净的玻璃器皿置于电热干燥箱中，15040分钟或分钟或120两小时，待冷却后使用。两小时，待冷却后使用。 （二）无菌室灭菌（接种室、培养室）（二）无菌室灭菌（接种室、培养室） 1、用新洁尔灭擦抺工作台，、用新洁尔灭擦抺工作台，70%酒精擦拭超净工作台。酒精擦拭超净工作台。 2、薰蒸（学习操作）、薰蒸（学习操作） 用甲醛、高锰酸钾提前用甲醛、高锰酸钾提前13天薰蒸密封房间方法天薰蒸密封房间方法1：甲醛倒入蒸：甲醛倒入蒸发皿加热，用量

32、发皿加热，用量10ml/m2。 方法方法2：甲醛（：甲醛（HCHO）与高锰酸钾（）与高锰酸钾（KMn4）以）以10：1比例混合。比例混合。 3、接种前用、接种前用7075%酒精喷雾，使飘在空气中的尘埃沉积下来。酒精喷雾，使飘在空气中的尘埃沉积下来。 4、用紫外光灯进行照射灭菌（波长、用紫外光灯进行照射灭菌（波长26502660A最好）接种箱最好）接种箱及用具及用具3040分钟。分钟。 （三）培养基灭菌（略）（三）培养基灭菌（略） （四）培养材料灭菌（略）（四）培养材料灭菌（略） （五）工作人员无菌操作（略）（五）工作人员无菌操作（略） 三、作业：简述我系组培实验室中的各仪器及使用方法。三、作业

33、：简述我系组培实验室中的各仪器及使用方法。实验二实验二 MSMS培养基母液的配制与保存培养基母液的配制与保存 一、目的要求：一、目的要求：通过通过MS培养基母液的配制培养基母液的配制与保存，掌握配制与保存培养基母液的基与保存，掌握配制与保存培养基母液的基本技能。本技能。 二、材料与用具：二、材料与用具：配制配制MS培养基所需的药培养基所需的药品、天平、烧杯、容量瓶、量筒、蒸馏水、品、天平、烧杯、容量瓶、量筒、蒸馏水、母液瓶、标签、冰箱等。母液瓶、标签、冰箱等。 三、实验步骤：三、实验步骤： 1、母液的配制、母液的配制 （1）母液）母液1的配制：的配制： 称量：称量：NH4NO3 82.5g，K

34、NO3 95g， MgSO47H2O 18.5g 混合：混合：用少量蒸馏水将药品分别加热溶解。然用少量蒸馏水将药品分别加热溶解。然后依次混合。后依次混合。 定容：定容：加少蒸馏水定容至加少蒸馏水定容至1000ml，成，成50倍液。倍液。 （2）母液）母液2的配制：的配制： 称量：称量：CaCl22H2O 22.0g 定容：定容：加蒸馏水定容至加蒸馏水定容至500ml，成，成100倍液。倍液。 （3）母液）母液3的配制：的配制： 称量：称量：KH2PO4 8.5g 定容：定容：加蒸馏水定容至加蒸馏水定容至500ml，成，成100倍液。倍液。 （4）母液）母液4的配制：的配制： 称量：称量：Na2

35、-EDTA 1.865 g , FeSO47H2O 1.390 g , （EDTA：乙二胺四乙酸）：乙二胺四乙酸） 混合：混合：用少量蒸馏水将用少量蒸馏水将Na2-EDTA加热溶解后。加热溶解后。再缓缓倒入再缓缓倒入FeSO4溶液，充分搅拌并加热溶液，充分搅拌并加热5分钟，分钟，使其充分螯合。使其充分螯合。 定容：定容：加蒸馏水定容至加蒸馏水定容至500ml，成，成100倍液。倍液。 （5）母液）母液5的配制：的配制：（微量）（微量） 称量：称量：H3BO3 0.31g ，NaMoO42H2O 0.0125g，MnSO44H2O 1.115g CuSO35H2O 0.00125g，ZnSO47

36、H2O 0.43g，CoCl26H2O 0.00125g KI 0.0415g 混合：混合：用少量蒸馏水将药品分别加热溶解。然用少量蒸馏水将药品分别加热溶解。然后依次混合。后依次混合。 定容：定容：加蒸馏水定容至加蒸馏水定容至1000ml，成，成50倍液。倍液。 （6）母液）母液6的配制：的配制：（微量）（微量） 称量：称量：肌醇：肌醇：5.0g， 甘氨酸：甘氨酸：0.1g, 烟酸：烟酸：0.025g。 VB6 (盐酸吡哆素盐酸吡哆素) 0.025g , VB1（盐酸硫氨素）（盐酸硫氨素）0.005g, 混合：混合：用少量蒸馏水将药品分别加热溶解。然后依次用少量蒸馏水将药品分别加热溶解。然后依

37、次混合。混合。 定容：定容：加蒸馏水定容至加蒸馏水定容至250ml，成，成200倍液。倍液。 （7）植物生长调节物质母液的配制。）植物生长调节物质母液的配制。（微量）（微量） 称量：称量：生长素（生长素（IAA、IBA、NAA、2,4-D）或细胞分）或细胞分裂素裂素(KT、ZT、6-BA)50100mg，（，（0.05g0.1g） 溶解：溶解：生长素（生长素（IAA、IBA、NAA、2,4-D）可用少量）可用少量0.1mol/L的的NaOH或或95%的酒精溶解，细胞分裂素的酒精溶解，细胞分裂素(KT、ZT、6-BA) 可用少量可用少量0.1mol/L的的HCI加热溶解。加热溶解。 定容：定容：

38、将溶解的生长物质一滴滴倒入不断搅拌的盛有将溶解的生长物质一滴滴倒入不断搅拌的盛有5060ml蒸馏水的小烧杯中，然后倒入蒸馏水的小烧杯中，然后倒入100ml容量瓶，容量瓶，用水冲洗小烧杯数次，最后加蒸馏水定容至用水冲洗小烧杯数次，最后加蒸馏水定容至100ml配制配制成浓度为成浓度为0.51mg/ml的溶液。的溶液。 2、母液的保存、母液的保存 （1）装瓶：）装瓶：将配制好的母液分别倒入瓶中，将配制好的母液分别倒入瓶中，贴好标签，注明培养基名称、母液号、配制贴好标签，注明培养基名称、母液号、配制倍数（或浓度）与配制日期。倍数（或浓度）与配制日期。 （2）储藏：）储藏：将母液瓶储放在将母液瓶储放在4

39、0冰箱内备用。冰箱内备用。实验三实验三 MS固体培养基的配制固体培养基的配制 MS培养基是目前使用最普遍的培养基。其培养基是目前使用最普遍的培养基。其具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速愈伤组织的生长。由于配方的矿质营养还能加速愈伤组织的生长。由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存和消毒等过程中，中的离子浓度高，在配制、贮存和消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不会影响离子间的平即使有些成分略有出入，也不会影响离子间的平衡。衡。 MS固体培养基可用于诱导愈伤组织，也可固体培养基可用于诱导愈伤组织，也可用于胚、茎段、茎尖及花药的培

40、养，其液体培养用于胚、茎段、茎尖及花药的培养，其液体培养基用于细胞悬浮培养时能获得明显的成功。基用于细胞悬浮培养时能获得明显的成功。MS培养基的无机养分的数量和比例比较合适，足以培养基的无机养分的数量和比例比较合适，足以满足植物细胞在营养上和生理上的需要。因此，满足植物细胞在营养上和生理上的需要。因此，一般情况下，不用再添加氨基酸、酪蛋白水解物、一般情况下，不用再添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有机附加成分。和其它培酵母提取物及椰子汁等有机附加成分。和其它培养基的基本成分相比，养基的基本成分相比，MS培养基中的硝酸盐、培养基中的硝酸盐、钾和铵的含量高，这是它的显著特点。钾和铵的含

41、量高，这是它的显著特点。 一、目的和要求：一、目的和要求：通过通过MS固体培养基的配制，固体培养基的配制，掌握配制培养基的基本技能。掌握配制培养基的基本技能。 二、材料与用具：二、材料与用具：配制配制MS培养基的各种母液、培养基的各种母液、生长调节物质母液、琼脂粉、蔗糖、蒸馏水、移生长调节物质母液、琼脂粉、蔗糖、蒸馏水、移液管量筒、容量瓶、电炉、酸度计或液管量筒、容量瓶、电炉、酸度计或PH试纸、试纸、0.1 mol/L的的NaOH、0.1 mol/L的的HCI、培养瓶、培养瓶、标签、铅笔等。标签、铅笔等。 三、方法与步骤：（下面取的量是定容三、方法与步骤：（下面取的量是定容1000ml，每小，

42、每小瓶瓶30ml左右，每人接种左右，每人接种4小瓶左右。要多少小瓶左右。要多少ml？）？） 1、按母液顺序和规定量，用吸管提取母液，放入盛有、按母液顺序和规定量，用吸管提取母液，放入盛有一定量的蒸馏水的烧杯中。一定量的蒸馏水的烧杯中。 母液母液1 20ml 母液母液2 10ml 母液母液3 10ml 母液母液4 10ml 母液母液5 20ml(如果是如果是800倍的，母液倍的，母液1.25ml+水水18.75ml) 母液母液6 5ml 2、加入生长调节物质：加入的具体调节物质与量，视、加入生长调节物质：加入的具体调节物质与量，视培养物不同而异，有时也可不加。培养物不同而异，有时也可不加。 3、

43、加入固化剂：加入琼脂、加入固化剂：加入琼脂7g。 4、加糖：放入蔗糖、加糖：放入蔗糖30g。 5、定容：加入蒸馏水定容至、定容：加入蒸馏水定容至1000ml。（如是固。（如是固体琼脂要加热溶化。）体琼脂要加热溶化。） 6、调整、调整PH值：经酸度计或值：经酸度计或PH试纸测试，用试纸测试，用0.1 mol/L的的NaOH、0.1 mol/L的的HCI把培养基的把培养基的PH调整到调整到5.86.0之间。之间。 7、培养基分注：把配制好的培养基分注到培养、培养基分注：把配制好的培养基分注到培养瓶中，瓶中，100150ml的培养瓶每瓶装入的培养瓶每瓶装入2025ml左右培养基。分注后立即加盖，贴上

44、标签，注明左右培养基。分注后立即加盖，贴上标签，注明培养基的名称和配制时间等。培养基的名称和配制时间等。实验四、培养基和培养用具的灭菌实验四、培养基和培养用具的灭菌 一、实验目的：一、实验目的： 1、掌握高温高压湿热灭菌的原理及手提式、掌握高温高压湿热灭菌的原理及手提式灭菌锅灭菌操作流程。灭菌锅灭菌操作流程。 2、 探究影响培养基灭菌效果和凝固效果探究影响培养基灭菌效果和凝固效果的主要因素。的主要因素。 二、二、 实验原理：培养基和培养用具一般采用高温高实验原理：培养基和培养用具一般采用高温高压湿热灭菌法来进行灭菌，压湿热灭菌法来进行灭菌， 其灭菌原理是利用高温其灭菌原理是利用高温高压产生的蒸

45、汽杀灭微生物的方法，高压产生的蒸汽杀灭微生物的方法， 因为热蒸气具因为热蒸气具有较强穿透力有较强穿透力 ，可使蛋白质凝固而达到灭菌的目的。，可使蛋白质凝固而达到灭菌的目的。 培养基高温高压湿热灭菌是压力在培养基高温高压湿热灭菌是压力在 0. 11-0. 15MPa(温度为温度为 121-126 ) ， 保持该压力保持该压力 15-30 min， 即可达到灭菌目的。即可达到灭菌目的。 三、三、 材料、材料、 仪器与试剂仪器与试剂 1、仪器、仪器: 高压灭菌锅高压灭菌锅 2、用、用 具具: 集装框、集装框、 手套、手套、 计时器计时器 四、实验步骤四、实验步骤 1、洗涤：把组织培养基用、洗涤：把组

46、织培养基用 的培养皿、的培养皿、 三角三角 瓶、瓶、 试管试管等玻璃器皿进行彻底清洗。自等玻璃器皿进行彻底清洗。自 然晾干或烘箱干燥。然晾干或烘箱干燥。 2、包扎：用牛皮纸、报纸、纱布或锡箔纸把玻璃器皿、包扎：用牛皮纸、报纸、纱布或锡箔纸把玻璃器皿和金属器械分别包扎好。和金属器械分别包扎好。 3、加水：往锅里加水至浸没发热管、加水：往锅里加水至浸没发热管( 切忌干烧切忌干烧! ) 。 4、装锅：在灭菌锅内、装锅：在灭菌锅内 放入含培养基的培养瓶或三角放入含培养基的培养瓶或三角 瓶、装蒸馏水的玻璃瓶，以及包扎好的玻璃器皿和金瓶、装蒸馏水的玻璃瓶，以及包扎好的玻璃器皿和金属器械等。属器械等。 5、

47、封锅、封锅、 接通电源接通电源: 盖好锅盖，盖好锅盖， 对角线拧对角线拧紧螺旋。关闭放气阀和安全阀，紧螺旋。关闭放气阀和安全阀， 接通电源，接通电源， 加热。加热。 6、排冷空气：当压力达到、排冷空气：当压力达到 0. 05Mpa 时，打时，打开手动放气阀放冷气，开手动放气阀放冷气， 将锅内的冷空气全部将锅内的冷空气全部排出。排出。 或将排气阀开着，加热，直至锅内释或将排气阀开着，加热，直至锅内释放出大量水蒸气放出大量水蒸气( 此时水蒸气横向喷出此时水蒸气横向喷出 ) ，再，再关闭阀门关闭阀门 。 7、 升温升压升温升压: 压力压力 回零后，回零后， 关闭放气阀，关闭放气阀， 继续加热加压。继

48、续加热加压。 8、 保温保压保温保压: 当压力达到当压力达到 0. 11Mpa( 温度为温度为 121 ) 时开始计时，使压力保持在时开始计时，使压力保持在 0. 11-0. 15Mpa( 121-126 ) 之间，维持之间，维持15-30min。 ( 若灭菌时间过长，会使培养基中的某些成分若灭菌时间过长，会使培养基中的某些成分变性失效变性失效) 9、 断电降温、出锅断电降温、出锅: 灭菌完毕后，断电，灭菌完毕后，断电， 手手动缓慢放气到压力为动缓慢放气到压力为 0. 05 Mpa 时，才能快速时，才能快速放气，当压力降到放气，当压力降到“ 0” 时打开锅盖，时打开锅盖， 取出取出灭菌物品灭菌

49、物品 。 注意事项注意事项: 1、 培养基中含有大量有机物，培养基中含有大量有机物， 尤其是含糖量较高，尤其是含糖量较高，为各种微生物滋生和繁殖提供极好场所。为各种微生物滋生和繁殖提供极好场所。 因此，培养因此，培养基配制好必须尽早基配制好必须尽早( 不能超过不能超过 24h) 进行灭菌，以保证进行灭菌，以保证植物组织培养的顺利进行。植物组织培养的顺利进行。 2、灭菌锅使用应注意、灭菌锅使用应注意: ( 1) 先打开放气阀，先打开放气阀， 再打开锅盖。再打开锅盖。 ( 以免锅内以免锅内 压力压力 大而爆炸大而爆炸! ) ( 2) 开盖后应尽快转移培养瓶，使培养瓶冷却、开盖后应尽快转移培养瓶，使

50、培养瓶冷却、 凝凝固固 。 一般应将灭菌后的培养瓶储藏于一般应将灭菌后的培养瓶储藏于 30 以下的室以下的室内内 ， 最好储藏在最好储藏在 4-10 的条件下。的条件下。 ( 3) 某些生长调节剂如某些生长调节剂如 IAA、 ZT、 ABA 等以及某等以及某些维生素遇热是不稳定的，些维生素遇热是不稳定的， 不能同培养基一起高压不能同培养基一起高压灭菌，灭菌， 而需要进行过滤灭菌。而需要进行过滤灭菌。 ( 4) 锅内冷气必须排尽，锅内冷气必须排尽， 以保证灭菌效果。以保证灭菌效果。 否则，否则， 压力表指针虽指到一定压力压力表指针虽指到一定压力 ， 但由于锅内冷空气的但由于锅内冷空气的存在而达不

51、到要求的温度，存在而达不到要求的温度， 很难达到彻底灭菌。很难达到彻底灭菌。 ( 5) 当达到一定压力后，当达到一定压力后， 要严格遵守灭菌时间。时要严格遵守灭菌时间。时间过长会使一些化学物质遭到破坏，影响培养基成间过长会使一些化学物质遭到破坏，影响培养基成分分; 时间短则达不到彻底灭菌的目的。时间短则达不到彻底灭菌的目的。实验五实验五 无菌操作技术无菌操作技术 一、目的和要求：一、目的和要求：通过在超净工作台上进行无菌操作训通过在超净工作台上进行无菌操作训练，使学生初步掌握组织培养的无菌操作技术。练，使学生初步掌握组织培养的无菌操作技术。 二、材料与用具：二、材料与用具：超净工作台、超净工作

52、台、70%酒精、酒精、95%的酒精、的酒精、盛有培养基的培养瓶（已灭菌）、接种器械（主要指解盛有培养基的培养瓶（已灭菌）、接种器械（主要指解剖刀、剪刀、镊子等）、酒精灯、培养材料（根、茎、剖刀、剪刀、镊子等）、酒精灯、培养材料（根、茎、叶或种子等）、叶或种子等）、0.1%的升汞或漂白粉、无菌水等。的升汞或漂白粉、无菌水等。三、方法与步骤：三、方法与步骤：1、用水和肥皂洗净双手，穿上灭菌过的专用、用水和肥皂洗净双手，穿上灭菌过的专用实验服、帽子与鞋子，进入接种室。实验服、帽子与鞋子，进入接种室。2、打开超净工作台和无菌操作室的紫外灯，、打开超净工作台和无菌操作室的紫外灯，照射照射20分钟。分钟。

53、3、操作前、操作前10分钟使超净工作台处于工作状态，分钟使超净工作台处于工作状态，让过滤室空气吹拂工作台面和四周的台壁。让过滤室空气吹拂工作台面和四周的台壁。4、照射、照射20分钟后，关闭紫外灯，分钟后，关闭紫外灯，5、用用70%的酒精灯擦拭工作台和双手。的酒精灯擦拭工作台和双手。6、用蘸有、用蘸有70%的酒精的纱布擦拭装有培养基的培养的酒精的纱布擦拭装有培养基的培养器皿，放进工作台。器皿，放进工作台。 7、把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在、把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95%的酒精的酒精中，在火焰上灭菌后，放在器械架上。中，在火焰上灭菌后，放在器械架上。8、把培养材料放进、把培养材料放进7

54、0%的酒精中浸泡的酒精中浸泡30秒后。再在秒后。再在0.1%的升汞（氯化汞）中浸泡的升汞（氯化汞）中浸泡10分钟，或在分钟，或在10%的漂的漂白粉上清液中浸泡白粉上清液中浸泡1015分钟，浸泡时可进行搅动，分钟，浸泡时可进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好的接触；然后用无菌水冲使植物材料与灭菌剂有良好的接触；然后用无菌水冲洗洗35次。次。9、用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到，打开瓶口。到，打开瓶口。10、取下接种器械，在火焰上灭菌。、取下接种器械，在火焰上灭菌。11、把培养材料放入培养瓶，盖上瓶口（每人、把培养材料放入培养瓶，盖上瓶口（每人接种接种510瓶）。操作期间应经常用瓶）。操作期间应经常用70%酒精酒精擦拭工作台和双手；接种器械应反复在擦拭工作台和双手；接种器械应反复在95%的的酒精中浸泡和在火焰上灭菌。酒精中浸泡和在火焰上灭菌。12、接种结束后，清理和关闭超净工作台。、接种结束后，清理和关闭超净工作台。防止操作带来的污染防止操作带来的污染 A、整个接种操作应在近火焰处进行，、整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速且动作要迅速正正 确确 错错 误误B、接种过程中尽可能达到悬空要求、接种过程中尽可能达到悬空要求防止操作带来的污染防止操作带来的污染正正 确确 错错 误误 C、接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口、接