尼古丁通过TET2调控的Fas去甲基化促进胸腺细胞凋亡

1、尼古丁通过TET2调控的Fas去甲基化促进胸腺细胞凋亡研究背景: 尼古丁作为香烟中最主要的成瘾和毒性成分 ,在吸烟引起的免疫系统损伤和相关疾病中发挥着关键和主导作用。本室前期研究显示 , 孕期尼古丁暴露可促进胎胸腺细胞及 CD4单阳性(CD4 single positive,CD4SP) 细胞凋亡, 引起CD4初始T细胞输出减少,进而导致子代免疫功能紊乱,其中Fas通路发挥 重要的促凋亡作用 , 但具体的分子机制还不清楚。有研究证明,尼古丁可调控胎组织基因的 DNA甲基化水平,且Fas表达可受 DNA甲基化的调控。因此我们推测,尼古丁可能通过调控Fas的DNA甲基化修饰 促进胸腺细胞凋亡。目的

2、：观察尼古丁对胸腺细胞凋亡的影响,并从DNA甲基化修饰角度，探讨 Fas凋亡通路介导的尼古丁促胸腺细胞凋亡的分子机制。方法:(1)胸腺细胞凋亡 及Fas通路基因表达：选取出生后3周断奶ICR健康小鼠,无菌环境下建立原代胸 腺细胞培养体系,分成正常对照组和尼古丁不同剂量(25、50、100、200和400卩 M)组,给药 48 h,Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测细胞活力。选取合适的尼古丁剂量(25、50和100卩M)给药48h,流式细胞术(Fluorescenee Activating Cell Sorter,FACS)检测总胸腺细胞及 CD4SPffl胞凋 亡水平的

3、变化；根据尼古丁量效结果，选取50卩M尼古丁分别处理胸腺细胞0、24、48、72 h,FACS检测总胸腺细胞及CD4SF细田胞凋亡水平的变化。实时荧光定量 PCR(Real-time quantitative PCR,qPCF检测胸腺细胞 a 7 nAChF和 Fas 凋亡 通路相关基因(Fas、Caspase & Caspase 3)的mRN表达,FACS检测胸腺细胞膜 表面的 Fas 蛋白表达 ,Caspase 酶活性检测试剂盒测定 Caspase 8 和 Caspase 3 的活性蛋白水平。(2)Fas 甲基化及甲基化酶参与尼古丁促胸腺细胞凋亡 : 首先,根据尼古丁对 胸腺细胞的

4、量效和时效作用结果，选择50卩M作为尼古丁给药剂量和48 h作为 尼古丁给药时间,分子量阵列技术(SequenomMassARRA检测Fas启动子区的DNA 甲基化水平，qPCR检测甲基化酶(TET1、TET2 TET3 Dnmtl、Dnmt3a、Dnmt3b) 的mRN表达。然后选取表达显著改变的基因 TET2进行siRNA干扰,Western blot 检测TET2的蛋白表达，FACS检测总胸腺细胞及CD4SF细胞的凋亡比例及细胞膜 表面的Fas蛋白表达,SequenomMassARRA检测Fas启动子区的DNA甲基化水平。(3)研究a 7nAChF在尼古丁诱导的胸腺细胞凋亡中的作用：尼古

5、丁处理前1 小时给予尼古丁受体特异性抑制剂 a -银环蛇毒素(a -Bungarotoxin, a -Btx)1 卩g/mL或PBS处理,FACS检测总胸腺细胞及CD4SP田胞凋亡水平的变化和细胞膜 表面的 Fas 蛋白表达 ,Caspase 酶活性检测试剂盒测定 Caspase 8 和 Caspase 3 的活性蛋白水平Western blot检测TET2的蛋白表达,SequenomMassARRA检测 Fas启动子区的DNA甲基化水平。结果:(1)尼古丁促进胸腺细胞凋亡并激活 a 7 nAChR/Fas通路基因的表达：细胞活性结果:25卩M尼古丁对胸腺细胞活力没有 显著影响，而50200卩

6、M尼古丁呈剂量依赖性降低了胸腺细胞的活力 (P<0.05,P<0.01)。尼古丁量效与时效实验结果：尼古丁处理48h后,25卩M尼古丁对小鼠总 胸腺细胞和CD4SF细胞的凋亡无明显影响，而50和100卩M尼古丁显著增加了二 者的凋亡比例；时效结果显示，尼古丁作用24h对胸腺细胞的凋亡无明显影响，随 着尼古丁作用时间的延长,4872h胸腺细胞的凋亡率呈时间依赖性显著增加 (P<0.01)。a 7nAChR/Fas凋亡通路基因的表达:50和100卩M尼古丁呈剂量 依赖性增强了 a 7 nAChR Fas、Caspase 8和Caspase 3的mRN及蛋白

7、或活性蛋白的表达。(2)Fas基因DNA甲基化及甲基化酶介导尼古丁促胸腺细胞凋亡：Fas甲基化和甲基化酶表达的结果：尼古丁处理后，胸腺细胞Fas基因启动子区核酸 (nuleotide,nt)-2394 、nt-2441 及 nt+295 的甲基化水平显著降低(P<0.05),nt+456 的甲基化水平也呈现降低趋势(P=0.06)。50和100卩M尼古 丁显著增加了 TET2的表达，各浓度尼古丁均对 TET1 TET3 Dnmt 1、Dnmt 3a、 Dnmt 3b 的表达无明显影响。siRNA瞬时转染结果:TET2表达降低后,尼古丁诱导的总胸腺细胞和CD4SP 细胞凋亡效应、Fas去甲基化及Fas表达升高均被抑制。(3) a 7nAChF介导Fas 去甲基化及胸腺细胞凋亡：添加a -Btx后,尼古丁诱导的总胸腺细胞和 CD4SRM 胞凋亡、Caspase 8和Caspase 3活性蛋白及TET2蛋白表达、Fas去甲基