Karrikin信号转导途径与独脚金内酯信号途径共同调控水稻黑暗中胚轴的伸长

1、Karrikin信号转导途径与独脚金内酯信号途径共同调控水稻黑暗中胚轴的伸长导读单子叶植物的幼苗出苗主要取决于中胚轴伸长，需要发育信号与环境刺激之间的协调。独角金内酯（SLs）和Karrikin是丁烯内酯化合物，可调节各种发育过程。两者都能够在黑暗中负面调节水稻的中胚轴伸长率。在这里，研究者报告了一个Karrikin信号复合体DWARF14-LIKE（D14L）-DWARF3（D3）-O。水稻MAX2 1的抑制子（OsSMAX1）在黑暗中介导水稻中胚轴伸长的调控。研究者证明D14L识别Karrikin信号并招募SCFD3泛素化连接酶用于OsSMAX1的泛素化和降解，反映了独角金内酯诱导的和D1

2、4和D3依赖性的泛素化和D53的降解。OsSMAX1的过表达在黑暗中促进了胚轴伸长，而敲除OsSMAX1则抑制了d14l和d3的伸长的胚轴表型。OsSMAX1定位于细胞核，并与TOPLESS相关蛋白相互作用，调节下游基因的表达。此外，研究者表明，GR24对映体GR245DS和GR24ent-5DS分别以D14和D14L依赖性方式特异性抑制中胚轴延伸并调节下游基因的表达。研究者的工作表明，Karrikin和独角金内酯信号传导在调节下游基因表达和在黑暗中负面调节中胚轴伸长方面起着平行和累加的作用。实验设计结果1 在黑暗条件下，D14L与D14平行或相加调节水稻中胚轴伸长 Kar

3、rikin和独角金内酯信号通路都参与了黑暗中胚轴伸长的调节，这分别需要是D14L（DWARF14-LIKE）和D14（DWARF14）的发挥功能。独角金内酯生物合成或信号转导的缺失导致D53（DWARF53 ）的积累，并导致分蘖芽的生长。d53作为功能增益不敏感突变体，其茎分枝表型与功能缺失SL生物合成突变体d27、d17和d10以及功能缺失SL信号突变体d14和d3相似。与野生型相比，SL缺陷突变体（d27、d17和d10）和SL不敏感突变体（d14和d3）的中胚轴更长。为了研究D53在黑暗中抑制中胚轴伸长的作用，研究者测量了D53的中胚轴长度，它与D14的长度一样长（图1A和1B）。组成型

4、表达d53和GFP融合蛋白的ACT：D53m-GFP转基因幼苗表现出与d53相似的芽枝表型。ACT：D53m-GFP转基因幼苗的中胚轴长度也与d14相似。这些结果表明，D53在这些幼苗中的积累促进了黑暗中胚轴的伸长，并证实了D14-和D3依赖的D53降解参与了水稻黑暗中胚轴伸长的抑制作用。然而，d3的中胚轴长度比其它SL突变体（包括d14和d53）长，这表明暗诱导的水稻中胚轴伸长也受到一个独立的调控途径。D14L、D14L2、D14L3和D14L4是D14的同系物。此外，D14L与HTL/KAI2同源，并参与调节水稻中胚轴在黑暗中的伸长。D14L2和D14L3类似于DLK2，可以通过Karri

5、kin处理诱导，并增强下胚轴伸长。 为了研究Karrikin如何在黑暗中调节水稻中胚轴的发育，研究者使用CRISPR/CRISPR相关9（Cas9）介导的基因编辑技术，产生了D14L基因敲除植株。D14L-1突变株在D14L的493位点有一个1-bp的缺失，它改变了基因结构，D14L-2突变体在493位点到495位点有一个3-bp的框内缺失，D14L-3突变体在495位点有一个G-T替换，在496-502位点有一个7-bp的缺失，导致了D14L中的氨基酸产生偏移。d14l-1用于进一步分析，此后称为d14l。在光照条件下，在14、d14l、d3、d14 d14l或野生型幼苗中未观察到

6、中胚轴伸长。黑暗条件下，d14l的中胚轴长度与d14相似，比野生型长，但比D3短（图1A和1B）。本研究中d14l中胚轴表型与先前报告的表型一致。然而，与先前研究中的D14L RNAi d14幼苗不同，d14 D14L双突变体的中胚轴长度与D3相同（图1A和1B）。此外，D53 D14L双突变体的中胚轴比D14LAND长，与d3相似。这些结果说明D14L介导的途径与D14介导的途径在黑暗条件下抑制水稻中胚轴伸长具有叠加作用。SL在中胚轴发育过程中负调节OsTCP5的表达。D14或D14L的缺陷导致OsTCP5的下调（图1C）。GY1参与了JA的生物合成，并对中胚轴伸长负性调节。D14或D14L

7、缺失导致GY1表达显著下调（图1D）。OSTCP5和GY1在d14和d14l中的表达下调类似于d14和d14l（图1C和1D），这表明d14和d14l介导的途径可能调节共同的靶基因，从而在黑暗中调节中胚轴的伸长。 接下来，研究者比较了野生型，d14，d14l，d3和d14l幼苗的基因表达谱。野生型和d3之间超过三分之二的差异表达基因（DEGs）与野生型和d14 d14l之间的差异表达基因（DEGs）重叠。有趣的是，野生型和d14之间的差异表达基因（DEGs）超过三分之一与野生型和d14l之间的DEGs重叠（图1E和1F）。对这些DEG的基因GO富集分析显示，与非生物胁迫和光刺激反应相

8、关的基因显著富集，这些基因可能受D14-和D14L介导途径的调控（图1G）。D14或D14L功能丧失导致D14L表达降低（图1H）。有人认为D14L2的表达依赖于D14L。事实上，破坏D14或D14L的功能导致D14L2表达量的急剧下降（图1I）。此外，D14L3的表达还依赖于D14和D14L的功能（图1J）。综上所述，这些结果表明，在黑暗条件下调控水稻胚轴伸长的D14L-和D14介导的途径是相加的和平行的，两者都依赖于D3的功能。 图1. 在黑暗中，D14L与D14在中胚轴抑制中起平行和相加的作用。（A ）黑暗中生长7d的幼苗的中胚轴；箭头表示中胚轴的边界。（B） 暗生幼苗中胚轴的

9、长度。C和D  RT-qPCR检测突变体幼苗中胚轴相关基因stcp5（C）和gy1（D）与野生型（WT）的相对表达水平。D  与野生型相比，突变体中表达上调的基因的维恩图。 2  D14L与OsSMAX1和D3相互作用 D53-like/SMAXL蛋白家族在水稻中有9个成员。在独角金内酯的存在下，D14招募D3来降解D53。研究者假设D14L可能与D14相似，在黑暗中D53样/SMAXL蛋白泛素化调节中胚轴伸长方面D3的招募相似。首先，研究者在酵母双杂交试验中测试了单个D53样/SMAXL蛋白与D14、D14L、D14L2和D14L3蛋白质的相

10、互作用。在水稻D53-like/SMAXL蛋白质中，由LOC_Os12g01360编码的D53L与D53最为相似并且可以在rac-GR24的存在下与D14相互作用。 LOC_Os08g15230编码的蛋白质与拟南芥SMAX1最为相似，并可与D14L相互作用（图2A），但与D14、D14L2或D14L3不存在相互作用。因此，研究者在下文中将LOC_Os08g15230称为OsSMAX1。Pull-down分析证实OsSMAX1与D14L相互作用，而不是D14（图2B）。此外，当标记蛋白在水稻原生质体中瞬时表达时，HA-OsSMAX1被GFP-D14L共沉淀，而不是GFP-D14共沉淀，

11、进一步证实OsSMAX1和D14L之间的相互作用（图2C）。 为了检测D14L和D3之间的相互作用，研究者进行了Pull-down分析。Nus-D14L被谷胱甘肽S-转移酶（GST）-D3抑制，而GST没有，这表明D14L可以与D3相互作用（图2E）。HA-D3和GFP-D14L均在水稻原生质体中瞬时表达。HA-D3可被GFP-D14L共免疫沉淀，但GFP不能（图2F）。这些结果表明D14L可能与D3和OsSMAX1形成复合物，D14与D3和D53形成复合物。 图2. D14L与OsSMAX1和D3形成复合体。（A）D14L在酵母双杂交检测中与OsSMAX1相互作用。 （B

12、）体外Pull-down实验。 （C）水稻原生质体中瞬时表达的蛋白质的Co-IP。（D）体外Pull-down实验。（E）使用谷胱甘肽磁性琼脂糖珠的Pull-down试验。（F）水稻原生质体中瞬时表达的蛋白质的Co-IP。 3  OsSMAX1的积累决定了水稻中胚轴的黑暗伸长 独角金内酯诱导的D53降解需要D14和D3的功能。独角金内酯生物合成或信号转导不足的突变体积累D53并表现出分蘖芽的生长。为了研究OsSMAX1的蛋白质稳定性是否需要体内D14L和D3的功能，研究者使用OsSMAX1抗体测量野生型、d14、D14L、D3和d14 D14L幼苗中Os

13、SMAX1蛋白水平。OsSMAX1蛋白在d14l，d3，d14 d14l中积累，但在野生型或d14中没有积累（图3A）。这些结果表明，OsSMAX1蛋白稳定性的调节依赖于D14L和D3的功能，而不是D14的功能。相比之下，研究者发现D53在d14l中的积累与野生型相似（图3B），表明d14l对D53丰度的影响很小。 在d53植物中，缺少Gly-Lys-Thr（GKT） motif阻止了d53受到SL诱导的降解。当GKT基序突变D53（D53m）在野生型中过度表达时，茎分枝表型与ofd53相似。由于OsSMAX1的GKT基序区域与D53高度相似，研究者通过在744到747的GKT mo

14、tif的框内删除（Gly-Lys-Thr-Ala；图3C）生成突变OsSMAX1（OsSMAX1m），这与D53中813到817处的GKT基序类似（Gly-Lys-Thr-Gly-Ile）。由于d53与D14以及d53相互作用，因此采用酵母双杂交试验（图3D）和pull-down试验（图3E）验证OsSMAX1m与D14L之间的相互作用，结果表明OsSMAX1m与D14L以及OsSMAX1相互作用。 为了进一步评估D53/SMAXL家族蛋白的稳定性，研究者在水稻原生质体中进行了类StrigoQuant的报告瞬时表达分析。为了验证该分析的可行性，研究者首先测试了RAC-GR24对在野生

15、型d3、d14、d14l和d14 d14l原生质体中瞬时表达的D53和D53m报告基因稳定性的影响。荧光素酶活性比率用1 uM Mrac-GR24处理的D53报告基因在d14、d3和d14 d14l的荧光素酶活性高于野生型和d14l，相比之下，野生型d3，d14，d14l和d14 d14l在响应rac-GR24处理后，D53m报告基因的FF：REN没有明显差异。为了评价OsSMAX1和OsSMAX1m的稳定性，在野生型、d14、d14l、d3和d14 d14l原生质体中瞬时表达OsSMAX1和OsSMAX1m的类StrigoQuant报告因子。FF:REN表明，OsSMAX1在d14l、d3和

16、d14 d14l中的稳定性高于野生型，而OsSMAX1在d14中的稳定性与野生型相似（图3F）。然而，OsSMAX1m在14、d14l、d3、o或d14 d14l中的稳定性与野生型无明显差异（图3F）。这些结果表明，OsSMAX1的稳定性受D14L和D3的调节，而不是D14的调控；OsSMAX1的GKT基序突变使OsSMAX1m能够抵抗D14L和D3依赖的降解。为了测试这些突变体中OsSMAX1的积累是否导致d14l，d3和d14 d14l的中间胚轴的延长，研究者构建了表达玉米UBIQUITIN启动子驱动的OsSMAX1和OsSMAX1m的载体（Ubi：OsSMAX1-GFP-3XFlag和U

17、bi：OsSs -GFP-3XFlag），并将其转化为水稻中图3G至3I）。OsSMAX1和OsSMAX1m的过表达促进了黑暗中中胚轴的伸长（图3G和3H）。转基因幼苗中胚轴的长度与OsSMAX1或OsSMAX1m融合蛋白的蛋白质水平一致（图3I）。研究者进一步创建了由水稻ACTIN启动子驱动的过表达OsSMAX1和OsSMAX1m的构建体（分别为ACT：OsSMAX1-Flag和ACT：OsSMAX1m-Flag），并将其转化到水稻中。此外，研究者生成了一个由OsSMAX1启动子驱动的OsSMAX1m表达载体（OsSMAX1：OsSMAX1m-GFP-3XFlag），并随后获得了转基因幼苗。

18、ACT：OsSMAX1-Flag幼苗的中胚轴长度与野生型幼苗的相似。ACT：OsSMAX1m-Flag和OsSMAX1：OsSMAX1m-GFP3XFlag转基因幼苗的中胚轴长度显着大于野生型幼苗的长度，这与ACT中OsSMAX1m-Flag融合蛋白的丰度一致：OsSMAX1m-Flag转基因幼苗和OsSMAX1：OsSMAX1mGFP-3XFlag转基因幼苗中的OsSMAX1m-GFP-Flag融合蛋白。这些结果表明，OsSMAX1m能够比OsSMAX1更容易引起配体的降解，并且OsSMAX1在黑暗中积累决定了水稻中胚叶的表型。 图3. OsSMAX1的积累导致在黑暗中水稻中胚轴伸

19、长。（A）通过抗OsSMAX1多克隆抗体的免疫印迹检测到的野生型（WT）和突变苗中的OsSMAX1蛋白水平。（B）通过用抗D53多克隆抗体免疫印迹检测到的野生型（WT）和突变体幼苗中的D53蛋白水平。（C）OsSMAX1m的突变位点。（D）酵母两杂交分析表明，D14L与OsSMAX1和OsSMAX1m的相互作用相同。（E）体外Pull-down实验分析。（F）35S：REN-2A-OsSMAX1-FF和35S：REN-2A-OsSMAX1m-FF在野生型（WT）和突变体的水稻原生质体中瞬时表达。（G）野生型（WT）和转基因Ubi:OsSMAX1-GFP-3XFlagandUbi：OsSMAX1

20、m-GFP-3XFlag幼苗在黑暗中生长7 d。(H) 野生型（WT）和转基因Ubi：OsSMAX1-GFP-3XFlag和Ubi：OsSMAX1m-GFP-3XFlag幼苗中胚轴的长度。(I) 通过抗-Flag单克隆抗体的免疫印迹揭示了野生型（WT）和转基因Ubi：OsSMAX1-GFP-3XFlag和Ubi：OsSMAX1m-GFP-3XFlag幼苗中的OsSMAX1蛋白水平 4  类Karrikin信号（KLs）诱导osmax1泛素化和降解 为了确定Karrikin在黑暗中抑制水稻中胚轴伸长的作用，研究者在黑暗中向幼苗生长的培养基中添加Kar1或Kar2，持

21、续培养7d（图4A至4C）。用20 uM KAr1或KAr2处理抑制野生型和d14幼苗中胚轴的伸长，但不抑制第14或第3种种子的中胚轴的伸长（图4A和4B）。Karrikin处理持续导致野生型和d14中OsSMAX1的丰度降低，但对14和d3的丰度几乎没有影响（图4C）。这些结果表明，Karrikin能诱导OsSMAX1降解，这与D14L和D3的功能有关。为了证实Karrikin是否诱导OsSMAX1降解，这取决于GKT基序的功能，研究者用10 uM KAR1处理了来自Ubi:OsSMAX1-GFP-Flag和Ubi:OsSMAX1mGFP-Flag转基因幼苗的愈伤组织，发现KAR1对OsSM

22、AX1诱导和诱导2小时（图4D）的诱导没有明显影响。 有人提出，不同的GR24立体异构体具有不同的作用，非天然对映异构体GR24ent-5DS可以模拟Karrikin对拟南芥下胚轴伸长的抑制作用。因此，研究者测量了OsSMAX1-GFP-Flag融合蛋白的丰度。用10 uM GR24ent-5DS处理后，OsSMAX1-GFP-Flag降解，但用10 uM GR245DS处理后则未降解（图4D）。但是，无论使用GR24ent-5DS还是GR245DS进行处理，都不会影响OsSMAX1m的丰度（图4D）。此外，结果表明GR24ent-5DS处理可以诱导OsSMAX1的泛素化，但不能诱导

23、OsSMAX1m的泛素化（图4E）。综上表明，不同的GR24立体异构体对OsSMAX1降解的诱导具有明显的影响，并且OsSMAX1的GKT基序突变对GR24ent-5DS诱导的泛素化和降解具有抗性。 为了进一步确定Karrikin是否可以以类似于独角金内酯的方式增强D14L和OsSMAX1之间的相互作用。就D14和D53之间的相互作用而言，研究者用不同的小分子进行了酵母双杂交检测。结果表明，加入20 uM rac-GR24或GR245DS可以增强D14和D53之间的相互作用，但是rac-GR24和GR245DS或KAR1和GR24ent-5DS都不能增强D14L与OsSMAX1之间的

24、相互作用。Pull-down还显示添加20 uM rac-GR24，KAR1，GR245DS，rGR24ent-5D对D14L与OsSMAX1之间的相互作用没有明显影响。即使当这些化学物质的浓度增加到50 uM，KAR1和GR24ent-5DS仍然对D14L和OsSMAX1之间的相互作用没有明显影响。这些结果表明，KL和D14L之间以及SL和D14之间可能存在不同的识别机制。 图4. Karrikin信号引起的OsSMAX1降解取决于D14L和D3的功能。 （A）在Karrikin处理下的7 d龄野生野生型（WT），d14，d14l和d3幼苗。 （B）在Karrikin处理下，在黑暗

25、中生长7天的所示幼苗的中胚轴长度。（C）OsSMAX1蛋白水平。 （E）响应10uM GR24ent-5DS的OsSMAX1-GFP-Flag和OsSMAX1m-GFP-Flag的泛素化测定。 5  OsSMAX1在调节中胚轴伸长中作用于D14L和D3的下游 为了进一步剖析OsSMAX1在黑暗中中胚轴伸长调控中的作用，研究者通过CRISPR / Cas9介导的基因组编辑生成了OsSMAX1敲除植物，发现OsSMAX1的功能丧失在黑暗中降低了水稻中胚轴伸长。与野生型相比。Ossmax11（在第70至73位位点有4 bp的缺失）被用于进一步分析，此后称为Ossmax1

26、。OsTCP5，GY1和OsGSK2基因的表达水平与Ossmax1和OsSMAX1的中胚轴表型一致：OsSMAX1m-GFP-3XFlag，此后称为OsSMAX1m过表达（OE）。这些结果表明，OsSMAX1可能在中胚轴发育过程中通过调节这些基因的表达而在黑暗中调节中胚轴伸长。此外，D14L，D14L2和D14L3基因的表达在Ossmax1中增加，而在OsSMAX1m-OE中减少。综上表明，D14L-D3-OsSMAX1复合物可能与D14-D3-D53复合物协同作用，以控制下游基因（如D14L，D14L2和D14L3）的表达。 在拟南芥中，SMAX1和SMXL2功能的丧失会抑制max

27、2的下胚轴伸长表型。为了测试OsSMAX1是否在中胚轴伸长的调节中作用于D14L和D3的下游，研究者获得了Ossmax1 d14l和Ossmax1 d3双突变植物。在黑暗中，Ossmax1 d14l和Ossmax1 d3双重突变体的中胚轴长度与Ossmax1相似（图5A和5B），表明OsSMAX1在D14L和D3的下游起作用。此外，研究者在野生型，d3，d14l，Ossmax1，Ossmax1 d3和Ossmax1 d14l中测量了OsSMAX1的蛋白质水平，发现OsSMAX1的功能丧失导致d3和d14l中没有OsSMAX1积累（图5C）。与野生型相比，这些突变体中OsTCP5和GY1的转录水

28、平均与这些突变体中OsSMAX1的丰度和中胚轴延伸表型一致（图5D）。这些结果强烈表明，OsSMAX1在黑暗中抑制D14LandD3的下游，以抑制中胚轴伸长。 D14可以募集D3来降解D53，D14L可以募集D3来降解OsSMAX1（图2和4D）。由于d14 d14的中胚轴表型与d3类似，因此可以合理地预期OsSMAX1的功能丧失可以挽救d14l的拉长中胚轴表型，并且Ossmax1 d3的中胚轴长度将与ofd14相似。出人意料的是，OsSMAX1的功能丧失完全拯救了d3的拉长中胚轴表型，而不是在黑暗中部分挽救d3的中胚轴表型（图5A至5D）。因此，研究者创建了Ossmax1 d10和

29、Ossmax1 d14双突变体。Ossmax1 d10和Ossmax1 d14的中胚轴长度与Ossmax1相似（图5E和5F）。此外，Ossmax1 d10和Ossmax1 d14中OsTCP5和GY1的转录水平均与Ossmax1中的转录水平相似（图5G和5H），OsTCP5和GY1的表达水平与OsTCP5和GY1一致。观察到了这些突变体的中胚轴延伸表型。总之，这些发现表明OsSMAX1可能在黑暗中调节水稻中胚轴伸长中的D14-D3-D53信号下游。 与野生型相比，OsSMAX1转录水平在d14l，d3，d14 d14l和OsSMAX1m-OE中被下调，但在Ossmax1和Ossma

30、x1 d3中被上调，表明OsSMAX1表达受到OsSMAX1蛋白积累的负调控。令人惊讶的是，OsSMAX1转录水平在d14和D53m-OE中也被下调，但在Ossmax1 d14中被上调。D53转录受SL信号的反调控。有趣的是，研究者发现d14l和过表达OsSMAX1m中的D53表达水平降低，与d14和过表达D53m中的相似，但在Ossmax1中升高。总体而言，这些结果表明，D14-D3-D53和D14L-D3OsSMAX1信号复合物相互依存，以维持D53和OsSMAX1的表达水平。 图5. OsSMAX1的功能丧失抑制了d14l和d3的伸长的中胚轴表型。 （A）野生型（WT），d14

31、l，d3，Ossmax1，Ossmax1 d14l和Ossmax1 d3的深色生长的7天龄幼苗。中心幼苗在右上角显示为放大，中胚轴由箭头指示。棒5 2厘米。（B）（A）中暗长的7日龄幼苗的胚轴长度。（C）（A）中黑暗生长的7日龄幼苗中OsSMAX1蛋白的丰度。（D）OsTCP5和GY1在野生型（WT），d14l，d3，Ossmax1，Ossmax1 d14l，Ossmax1 d3的深色生长的7-d龄幼苗中的相对表达水平。（E）深色生长的7日龄野生型（WT），d10，d14，Ossmax1，Ossmax1 d10，n d Ossmax1 d14幼苗。中心幼苗在右上角显示为放大，中胚轴由箭头指示。

32、棒5 2厘米。（F）（E）中暗长的7d幼苗的中胚轴长度。（G）OsTCP5和GY1在野生型（WT），d10，Ossmax1和Ossmax1 d10的深色生长7 d幼苗中的相对表达水平。（H）在野生型（WT），d14，Ossmax1，Ossmax1 d14的深色生长的7天龄幼苗中，OsTCP5和GY1的相对表达水平。 6  独角金内酯介导的中胚轴伸长调控需要OsSMAX1，独角金内酯介导的抑制枝条分支不需要OsSMAX1调控 为了确定D14L-D3-OsSMAX1是否像D14-D3-D53一样调节枝条分支，研究者测量了野生型d3，d14，d14l和d14 d14l的

33、分蘖数（图6A和6B）。在野生型和d14l之间未检测到分蘖数的显着差异，并且d14 d14l的分蘖数与d14和d3的分蘖数相似（图6A和6B）。此外，Ubi：OsSMAX1-GFP-3XFlag和Ubi：OsSMAX1m-GFP-3XFlag转基因植物的分蘖数与野生型植物的分蘖数没有显着差异。与这些结果一致，ACT:OsSMAX1-Flag,ACT:OsSMAX1m-Flag和OsSMAX1: OsSMAX1m-GFP-3XFlag转基因植物的分蘖数也与野生型相似。尽管OsSMAX1的功能丧失在黑暗中抑制了中胚轴伸长，但与野生型植物相比，OsSMAX1敲除植物的分蘖数差异不大。尽管OsSMAX

34、1的功能丧失抑制了d3的伸长的中胚轴表型（图5A和5B），但Ossmax1 d3的分蘖数与d3的分蘖数相似（图6A和6B），这表明OsSMAX1对水稻分枝的影响很小。此外，Ossmax1 d14和Ossmax1 d10的分蘖数分别与d14和d10中的分蘖数相似（图6A和6B）。这些结果表明，与D14D3-D53复合物不同，不需要D14L-D3-OsSMAX1复合物来调节水稻的枝条分支。 研究者观察到，在OsSMAX1和OsSMAX1过表达植物和Ossmax1植物（图6C）中，植物高度都降低了。同样，与d3，d14和d10相比，Ossmax1 d3，Ossmax1 d14和Ossmax

35、1 d10的植物高度也分别降低了（图6C）。这些结果表明，D14L-D3-OsSMAX1复合物可能参与调节水稻的株高。 图6. D14L-D3-OsSMAX1 介导的信号通路不调节枝条分支。（A）抽穗期的野生型（WT），d10，d14，d3，d53，d14l，Ossmax1，Ossmax1 d10，Ossmax1 d14，Ossmax1 d3，d53 d14l，n dd14 d14l植物的形态。 （B）抽穗期所示植物的分蘖数。（C）在抽穗期指示植物的高度。 7 OsSMAX1与TPR相互作用以调节下游基因表达 D53/SMAXL家族蛋白位于细胞核内，并能够通过其E

36、AR募集TPR转录共表达调节下游基因表达的motif。与D53相似，OsSMAX1具有EAR motif，表明OsSMAX1可能与TPR相互作用以调节下游基因表达，如D53所观察到的那样。OsSMAX1和水稻TPR之间的相互作用通过双杂交检测到（图7A），OsSMAX1和TPR2 N末端之间的相互作用通过Pull-down进一步证实（图7B）。OsSMAX1的突变EAR motif破坏了OsSMAX1和OsTPR2之间的相互作用。此外，OsSMAX1-GFP-Flag和OsSMAX1m-GFP-Flag融合蛋白主要定位于细胞核（图7C）。这些观察结果表明OsSMAX1可能招募TPR转录抑制剂来

37、调节下游基因的表达。 为了鉴定由OsSMAX1调控的下游基因，研究者比较了野生型，Ossmax1和OsSMAX1m-OE的基因表达谱，并鉴定了可能受OsSMAX1调控的84个基因。在这些基因中，18个基因的表达在Ossmax1中上调，在OsSMAX1mOE中下调，66个基因的表达在Ossmax1中下调，在OsSMAX1m-OE中上调（图7D）。这些OsSMAX1负调控基因和正调控基因的表达谱分别在热图中显示（图7E）。研究者选择了几种基因进行RT-qPCR分析，并确认了它们的表达水平。LOC_Os06g49750，LOC_Os02g40240和LOC_Os05g11414的表达在Os

38、SMAX1m-OE中下调，在Ossmax1中上调（图7F至7H）。LOC_Os06g49750编码拟南芥中Karrikin诱导标记基因KUF1的水稻同源物（图7F）。LOC_Os02g40240是一种光诱导性基因，编码LP2的质膜受体样激酶（图7G）。LOC_Os05g11414编码MADS-box家族转录因子OsMADS58，它调节光合作用相关基因的表达（图7I）。相比之下，分别编码棒曲霉素，硫堇和水通道蛋白家族蛋白成员的LOC_Os04g15840，LOC_Os06g32355和LOC_Os03g64330的表达在OsSMAX1m-OE中上调，而在Ossmax1中下调（图7I和7J）。这些

39、结果提供了进一步的证据，表明OsSMAX1通过调节下游基因的表达而在黑暗中影响水稻中胚轴伸长。 图7. OsSMAX1与TPR相互作用并调节下游基因表达。（A） 酵母两杂交试验，显示OsSMAX1与TPR的N末端（1到300）相互作用（B） 通过直链淀粉树脂进行的体外Pull-down测定。 His-MBP-OsSMAX1被抗His抗体检测到。通过抗His抗体检测到TPR2（1-600）-His。 MBP被抗MBP抗体检测到。用作诱饵的蛋白质用红色箭头指示，用作猎物的蛋白质用黑色箭头指示。 （C） OsSMAX1-GFP-Flag和OsSMAX1m-GFP-Flag融合蛋白的亚细胞定

40、位。（D） 与野生型（WT）植物相比，Ossmax1和OsSMAX1：OsSMAX1m-GFP-Flag转基因植物中差异调节基因的Venn图。（E）  与野生型（WT）植物相比，Ossmax1突变植物中上调基因和OsSMAX1：OsSMAX1m-GFP-Flag（OsSMAX1m-OE）转基因植物中上调基因表达倍数变化的热图。在不同的突变和转基因植物中，指定的OsSMAX1阻遏基因LOC_Os06g49750。（F）到（H）在不同的突变体和转基因植物中，指定的OsSMAX1阻遏基因LOC_Os06g49750（F），LOC_Os02g40240（G）和LOC_Os05g11414（H

41、）的相对表达水平（I）到（K） 与野生型（WT）植物相比，在不同的突变和转基因植物中，指定的OsSMAX1激活基因LOC_Os04g15840（I），LOC_Os06g4032355（J）和LOC_Os03g64330（K）的相对表达水平。 8  Karrikin和独角金内酯信号复合物在黑暗中感知不同的GR24异构体抑制水稻中胚轴伸长 为了确定Karrikin和独角金内酯在黑暗中抑制中胚轴伸长的作用，研究者向用于幼苗生长的培养基中添加了化学物质，并在黑暗中观察了7天（补充图20）。研究者发现1 uM racGR24或GR24ent-5DS足以抑制d10的中间胚轴的

42、延长，但不能抑制野生型，而10 uM racGR24或GR24ent-5DS能够显着抑制野生型和d10的中间胚轴的延长。20 uM处理与野生型和d10的10 uM rac-GR24相比，rac-GR24产生的抑制作用更明显，而在野生型中，用20 uM GR24ent-5DS处理比10 uM GR24ent-5DS产生更明显的抑制作用，而在d10中则没有。用20 uMrac-GR24处理可显着抑制野生型和d17幼苗的中间胚轴的延伸，略微抑制d14和d14l的中间胚轴的延伸，并且对d3和d14 d14l突变体的中间胚轴的延伸几乎没有影响。然而，20 uM KAR1抑制了野生型，d17和d14幼苗的

43、中胚轴的伸长，但对d14l，d3和d14 d14l突变体的中胚轴的影响很小（图8A和8B）。rac-GR24处理以D14依赖性方式诱导D53表达，而KAR1处理以D14L依赖性方式诱导OsSMAX1表达（图8C和8D）。在野生型中，OsKUF1的表达对KAR1的应答比对rac-GR24的应答更为特异性，而在d17和d14的应答中，OsKUF1的表达仅对KAR1应答（图8E）。OsSMAX1下调基因LP2的表达在野生型和d17中均响应KAR1和rac-GR24诱导，并在d14中响应KAR1诱导（图8F）。在野生型中，未响应于KAR1或rac-GR24而诱导了OsSMAX1上调的基因LOC_Os0

44、4g15840和LOC_Os06g32355的表达（图8G和8H）。独角金内酯或Karrikin途径的缺乏导致这两个基因的表达增加，从而在d17突变体中，它们的表达均响应于两个KAR1和rac-GR24而受到抑制（图8G和8H）。d14，d14l和d14 d14l中的LOC_Os04g15840和LOC_Os06g32355的表达对KAR1和rac-GR24都有响应。但是，rac-GR24并没有像KAR1在d14那样很好地抑制它们在d14las中的表达（图8G和8H），这与rac-GR24和KAR1对d14l和d14中胚轴伸长的抑制作用相一致（图8B）。 图8.在黑暗中响应SL和Ka

45、rrikin信号的中胚轴伸长率。（A）暗长成的7日龄野生型（WT），d17，d14，d14l，d14 d14l，n dd3幼苗，无论是否经过20mM所示化学药品处理。（B）（A）中所示的幼苗的中胚轴长度。（C）响应化学处理的D53的相对表达水平。（D）响应化学处理的OsSMAX1的相对表达水平。（E）响应化学处理的OsSMAX1抑制基因KUF1（LOC_Os06g49750）的相对表达水平。（F）响应化学处理的OsSMAX1抑制基因LP2（LOC_Os02g40240）的相对表达水平。（G）响应化学处理的OsSMAX1增强基因LOC_Os04g15840的相对表达水平。（H）响应化学处理的Os

46、SMAX1增强基因LOC_Os06g32355的相对表达水平。 鉴于rac-GR24是两种对映异构体（GR245DS和GR24ent-5DS）的外消旋混合物，并且GR24ent-5DS触发了OsSMAX1的泛素化和降解，研究者期望racGR24能够在野外激活D14和D14L介导的下游反应分别在d14中激活和激活Karrikin诱导的反应，在d14l中激活SL诱导的反应。出乎意料的是，用20 uMrac-GR24处理的幼苗在d14和d14l幼苗中对中胚轴的伸长略有抑制（图8A-8C）。用40 uM rac-GR24处理幼苗显示出对野生型和d14的中胚轴伸长的显着抑制作用，但对d14l的

47、中胚轴伸长无抑制作用。但是，当野生型d17，d14，d14l，d3和d14 d14l幼苗仅在含有20mM GR245DS或GR24ent-5DS的培养基中生长时，GR245DS会抑制野生型，d17和d14l幼苗的中胚轴伸长，但不是d14幼苗（图9A和9B）。相比之下，GR24ent-5DS抑制野生型，d17和d14幼苗的中胚轴的伸长，但不抑制d14幼苗的中胚轴的伸长（图9A和9B）。 GR245DS和GR24ent5D都不会对d3或者d14 d14l的中胚轴长度产生明显的抑制作用（图9A和9B）。与其抑制中胚轴伸长的能力一致，GR24ent-5DS处理减少了野生型，d17和d14幼苗中OsSM

48、AX1的积累，但对d14landd14 d14l幼苗中OsSMAX1的丰度影响很小（图9C和9D）。综上所述，这些结果表明D14L在中胚轴发育的调节中对GR24ent-5DS特异性应答。 GR245DS诱导D53在野生型，d17和d14l幼苗中表达，但在d14，d14，d14l和d3幼苗中没有诱导（图9E）。相比之下，GR24ent-5DS诱导d17和d14幼苗中的OsSMAX1表达，而不是野生型d14l，d14 d14l和d3幼苗中的OsSMAX1表达（图9F）。RT-qPCR分析显示LP2分别以D14或D14L依赖性方式响应GR24ent-5DS或GR245DS（图9G）。OsKUF1似乎以D14Land D3依赖的方式对GR24ent-5DS作出了特别的反应。这些结果表明，非天然对映体GR24ent-5DS可以模拟Karri