慢性粒单核细胞白血病干细胞转录本预测疾病形态和预后

1、慢性粒单核细胞白血病干细胞转录本预测疾病形态和预后导读慢性粒单核细胞白血病（CMML）是一种具有骨髓增生异常和骨髓增生重叠特征的临床异质性干细胞恶性肿瘤，超过90%的患者携带表观遗传和/或剪接基因突变，通常可在白血病起始细胞所在的Lin-CD34+CD38-免疫表型干细胞间检测到。干细胞水平的转录失调可能是疾病发生和发展的基础。本研究使用基于液滴的超高通量10x平台对来自7例初治CMML患者和3例健康对照者的6826株分选的Lin-CD34+CD38-进行单细胞测序分析。鉴定了独特的CMML干细胞特征，发现患者间和患者内转录组异质性程度显著，转录因子网络失调模式不同，即使在原始干细胞水平上CM

2、ML-1和CMML-2之间的显著差异也很明显。实验设计结果1 CMML干细胞表现出髓系偏向、增殖的转录特征基于526个高度可变基因的t-SNE二维可视化，揭示CMML和对照组Lin-CD34+CD38-之间存在实质性的分离，此外，不同CMML患者之间具有转录组异质性的细胞（图1B）。通过分析差异表达基因，初步关注CMML和对照干细胞之间的差异。将对照组和CMML组Lin-CD34+CD38-进行了差异基因表达分析，发现CMML中943个基因上调，296个基因下调。对上调基因进行KEGG和GO分析，突出了与细胞周期相关通路的富集，也突出了髓系细胞的那些特征（图1C，1D）。 

3、接下来计算分选的单个Lin-CD34+CD38-细胞群体中每个基因的平均标准化表达值，并使用信噪比排序度量进行基因集富集分析（GSEA）。最显著的富集是分化骨髓细胞特征的基因集，如“炎症反应”和“IL6-JAK-STAT信号转导”和细胞周期基因集“E2F靶标”和“G2M检查点”,与Lin-CD34+CD38-中相比，在CMML中强烈富集（图1E）。 由于干细胞的分裂和分化紧密相关，对Lin-CD34+CD38- HSC中上调的基因集进行了额外的GSEA分析。与正常Lin-CD34+CD38-HSC相比，观察到，CMML中正常的Lin-CD34+CD38-HSC基因集显著下调

4、（图2A），而在Lin-CD34+CD38-HSC中性粒细胞或单核/树突状细胞启动的祖细胞中选择性表达的基因则显著上调（图2B）。相比之下，B细胞、MegE或EBM祖细胞基因集的表达富集极少或不富集。这些发现得到了所示小提琴图的进一步支持（图2C）。用于与HSC自我更新相关的转录因子基因的单细胞表达，包括MEIS1、HLF、KLF4和EGR1（在CMML与正常干细胞中均下调）；以及转录因子和其他与骨髓承诺和分化相关的基因，如RUNX1、CEBPD、LGALS1和AZU（在CMML与正常HSC中均上调）（图2C）。这些数据表明，与正常Lin-CD34+CD38-HSC相比，CMML干细胞表现出转

5、录组的特征为髓系和细胞周期基因表达增加，正常HSC选择性表达的基因表达较低。图1 CMML干细胞表现出不同的转录特征图2 CMML干细胞失去了干细胞静止的特征，并表现出髓样偏向2 CMML患者正常Lin-CD34+CD38-单细胞转录信号的检测接下来，进行了无监督的迭代聚类，并在所有测序细胞中确定了17个转录上可分离的亚群（图3A）。对于每个亚群体与所有剩余群体的比较，确定了20个上调程度最高的基因。图3B显示了17个簇中每个簇的这些标记基因的表达，以及在每个簇中显示显著富集的前三个KEGG项（图3B）。正常Lin-CD34+CD38-造血干细胞几乎完全聚集在第1

6、5簇中（图3C）。值得注意的是，大多数CMML样本包含不同比例的细胞也被归入第15簇。再次观察到，与正常人相比，从CMML患者BC786和BC746中回收的Cluster15干细胞中正常的HSC基因相对下调；在从患者BC746中提取的Cluster15干细胞中，中性粒细胞和单核/树突状祖细胞中选择性表达的基因显著增加。说明这些患者的转录组已经被疾病相关的骨髓微环境所改变。 图3 CMML干细胞的可变部分与正常干细胞有一个共同的转录特征 3 CMML-1和CMML-2患者的干细胞具有不同的转录程序 骨髓原始细胞百分比的增加与CMML的不良结局密切相关。为了确定这种临

7、床病理差异是否反映在CMML干细胞室内的转录差异上，比较了CMML-0或CMML1患者和“CMML-2”患者的单个干细胞转录本。观察到显著的差异：在CMML-1和CMML-2干细胞群体中，782个基因上调，802个基因下调。KEGG和GO生物学过程分析显示，CMML-1基因集在CMML-1中有丰富的表达。相比之下，与CMML-1相比，CMML-2干细胞中丰富的基因集包括与炎症和细胞因子反应、JAK-STAT信号和凋亡相关的基因集。使用替代的可视化方法UMAP，能更好地表示细胞起源和发育过程中的轨迹，这表明CMML-2干细胞转录本与CMML-1和对照干细胞转录本显著分离，但CMML-2患者BC5

8、72的干细胞亚组分除外（图4A）。 为了进一步研究正常和CMML干细胞群体的相关性，进行了伪时间排序分析。在二维线性表示中，观察到CMML-1、CMML-2和正常干细胞的明确界限（图4B）。这种分离通过分支表示进一步强调，其中伪时间将干细胞排序到不同的分支，而没有预先假设正常的HSC分化（图4C和D）。在这个投影控制中，CMML-1干细胞大部分位于分支点2以上，而分支点2之前的干细胞主要是CMML-2干细胞。鉴于CMML-1和CMML-2干细胞的不同转录，接下来评估转录因子的表达水平，因为这些转录因子是细胞状态和分化的核心调节因子。与更广泛的单核细胞分化相一致，ELANE、MPO和L

9、YZ在CMML-1干细胞中显著上调（图5C）。综上所述，以上数据显示CMML-2患者的干细胞转录本与CMML-1患者的干细胞转录本非常不同，显然可以预测疾病的形态和结果。 图4 CMML-1和CMML-2干细胞表现出不同的发育轨迹  图5 来自CMML-1和CMML-2患者的干细胞具有不同的转录特征 4 CMML干细胞中涉及的转录因子网络 为了更深入地评价CMML干细胞中转录因子的异常调控，进行了转录调控网络分析。为此，研究采用了SIENIC，通过整合转录因子的共表达和在其顺式调控元件中包含相应转录因子结合基序的基

10、因来识别调节子模块。总共296个调节子的聚类再次表明，正常和CMML Lin-CD34+CD38-干细胞在转录空间中可广泛分离（图6A）。虽然一些调节子在所有细胞中都同样活跃（例如Elf1、HMGA1、ETS2），但某些转录因子网络在样本的子集中显示出独特的活性（图6B）。与早先的分析一致，与原癌基因Jun和与HSC自我更新相关的转录因子（例如KLF4，HLF）相关的调控子在CMML中相对不活跃（图6C）。CMML-1干细胞与已知的髓系转录因子CEBPD、CEBPA和MYC相关的调节子活性相对增强。与单核细胞分化相关的网络在CMML-2干细胞中优先活跃（图6C）。因此，根据CMML-

11、1（MYC）或CMML-2（IRF转录因子）患者的不同，CMML干细胞的转录组和它们的谱系潜力是通过表达独特的转录图谱来表征的。 图6 在CMML-1和CMML-2干细胞中运作的不同转录因子网络 5 CMML HSPC患者间和患者内的异质性 细胞间转录相关分析发现，样本之间或CMML和对照之间总体转录异质性的大小没有一致的差异，这表明总体上CMML干细胞并不比正常干细胞更具异质性。然而，与对照干细胞不同的是，每个患者的干细胞分布在23个不同的簇上（图7A）。接下来，进行了两两通路分析，比较了每个CMML患者特异性簇与簇15的转录谱，排除了来自C

12、MML患者的映射到这个簇的细胞（图7B）。定位于不同KEGG途径的基因存在高度异质性差异表达。有些（例如，“细胞因子-细胞因子受体相互作用”、“趋化因子信号传递”）在大多数疾病群组中一般都是活跃的，而另一些在一些患者的某些群组中只是活跃的。此外，研究在某些CMML患者中观察到显著的异质性。这些数据进一步突出了CMML患者干细胞群体之间以及内部的转录异质性。 图7 CMML干细胞在患者间和患者内部的异质性结论本研究发现慢性粒单核细胞白血病患者间和患者内存在显著的异质性，CMML干细胞表现出独特的转录程序。与正常对照组相比，CMML干细胞表现为髓系基因和细胞周期基因表达增加，而正常