免疫亲和柱净化液相色谱柱后光化学衍生法测定调味品中黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1

1、免疫亲和柱净化液相色谱柱后光化学衍生法测定调味品中黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1摘要：目的：建立免疫亲和柱净化液相色谱柱后光化学衍生法测定调味品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2。方法：样品经甲醇-水7+3提取过滤，稀释后，滤液经免疫亲和柱净化，采用HPLC柱后光化学衍生-荧光检测器测定其含量。结果：黄曲霉毒素B1、G1、B2、G2检出限分别为0.12、0.28、0.04、0.12g·kg-1，其相关系数均大于0.9995，回收率為66%97%，RSD小于10%。结论：该方法具有操作简单、快速、准确度高、灵敏度高等优点，适用于调味品中黄曲霉毒素的测定。关键词：黄曲霉毒素;柱后光化学

2、衍生;调味品;高效液相色谱;免疫亲和柱Abstract：Objective：ToestablishamethodforthedeterminationofaflatoxinB1，B2，G1，G2incondimentbyimmune-affinitycolumncleaningupandHPLCwithpost-columnphotochemicalderivation.Methods：Sampleswereextractedwithmethanol-water7+3solution，theextractionswerepurifiedbyimmune-affinitycolumnafterf

3、ilterationanddilution，separationofaflatoxinweremeasuredbypost-columnphotochemicalinstrument.Results：thelimitsofdetectionofaflatoxinB1、G1、B2andG2were0.12，0.28，0.04，0.12g·kg-1respectively，thecorrelationcoefficientofallaflatoxinswasgreaterthan0.9995，andtherecoveryrateswerefrom66%to97%，RSDwasbelow1

4、0%.Conclusion：Themethodiseasy，quick，preciseandhigh-sensitive，whichissuitableforthedeterminationofaflatoxinsincondiments.Keywords：Aflatoxins;Post-columnphotochemicalderivation;Condiment;HPLC;Immune-affinitycolumn中图分类号：O657.7黄曲霉毒素是一种天然毒素，它的产生与环境密切相关。调味品在日常生活中必不可少，在其加工、运输、存储过程中易发生霉变。为保证饮食平安，需建立黄曲霉毒素检测方

5、法。目前黄曲霉毒素检测方法有薄层色谱法【1】、酶联免疫法【2】、液相色谱法【3】等。本文采用免疫亲和柱净化-光化学柱后衍生-液相色谱荧光法检测调味品中4种黄曲霉毒素。1材料与方法1.1材料与仪器材料。72种调味品花椒、辣椒来自于江西省九江市、区、县各超市及集贸市场，包括散装及定型包装;黄曲霉毒素六合一免疫亲和柱IAC-SEP;甲醇，购自国药集团化学试剂;玻璃纤维滤纸直径11cm;黄曲霉毒素总量标准品美国SUPELCO，批号：LB96951;B1、B2、G1、G2分别为1.039、0.314、1.056、0.288g·mL-1;实验用水经WaterPurifer超纯水机制备，0.45m

6、滤膜过滤后使用。仪器。岛津LC-20AT高效液相色谱仪配荧光检测器，ColoversilHPLCColumn4.6mm×250mm，5m，购自美国CLOVER;光化学衍生器型号：PHRED美国AURA;泵流操作架，购自北京中检维康技术;真空泵型号：AP-01PVACUUMPUMP，天津奥特赛恩斯仪器;涡旋混匀器型号：VORTEX-GENIE2，上海易扩仪器。1.2实验方法1.2.1色谱条件流动相：甲醇-水45+55在线混合;流速：1.0mL·min-1;进样量：50L;柱温：35;检测波长：激发波长360nm;发射波长440nm。1.2.2样品前处理1样品提取及稀释。准确称

7、取调味品粉末2.5g于50mL离心管中，参加1g氯化钠，25mL甲醇-水7+3，混合均匀。定性滤纸过滤，准确移取10mL滤液并参加20mL纯水稀释，用玻璃纤维滤纸过滤，至滤液澄清，备用。2样品净化。将免疫亲和柱连接于10mL玻璃注射器下。准确移取20mL样品提取液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以2mL·min-1流速缓慢通过免疫亲和柱，直至23mL空气流过柱体。以10mL水淋洗柱子3次，弃去全部淋出液，并使23mL空气通过柱体。准确参加1.0mL甲醇洗脱，收集全部洗脱液于玻璃试管中，参加1.0mL纯水，混匀，待测定。1.2.3标准曲线标准储藏液：用甲醇

8、-水1+1将标准品稀释10倍，至黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2浓度分别为103.9、31.4、105.6、28.8ng·mL-1。将储藏液逐级稀释到适宜的标准工作溶液，对标准工作液和样液在上述色谱条件下测定，进样量50L，以保存时间定性，峰面积定量。2结果与分析2.1光化学柱后衍生效果黄曲霉毒素B1、G1具有很强的荧光性，但接触水后易发生荧光淬灭现象，荧光性消失液相色谱难以检测，要用衍生的方法增强其熒光性。用光化学的方法对B1、G1进行衍生，B2、G2那么不受衍生的影响，操作简单、实验重复性好，灵敏度高，适用于大批量样品的检测。2.2标准曲线及标准品图谱标准曲线见表1，标准溶液色谱

9、图见图1。2.3方法检出限及定量限将0.16ng·mL-1的黄曲霉毒素B1标准品进样25L进行屡次测定，其峰高均约为基线噪声高度的3倍，因此仪器检出限为0.08ng·mL-1，方法检出限为0.12g·kg-1，黄曲霉毒素B2、G1、G2的仪器检出限依次为0.03、0.19、0.08ng·ml-1，方法检出限依次为：0.04、0.28、0.12g·kg-1。B1、B2、G1、G2方法定量限依次为0.4、0.13、0.9、0.4g·kg-1。2.4回收率和精密度实验用不含黄曲霉毒素的花椒和辣椒样品作为空白样品进行加标回收实验，在样品中分别

10、添加不同浓度的标准品后，按照样品前处理步骤进行前处理，按照1.2.1色谱条件测定其回收率。每个加标样品连续测定6次，结果见表2、表3。对被测组分含量小于0.1mg·kg-1的样品，回收率范围应在66%97%，花椒、辣椒回收率均符合要求，该方法精密度高，RSD2.5实际样品的测定采用本法对72种调味品进行检测，样品图谱根本无干扰杂质峰，测定结果70种调味品均未检出黄曲霉毒素，其中有2种检出黄曲霉毒素B1，含量分别为2.7g·kg-1、0.6g·kg-1，食品平安国家标准暂未对调味品花椒、辣椒中真菌毒素限量进行规定【4】。3结论本方法采用免疫亲和柱净化-柱后光化学衍生-液相色谱荧光法测定了调味品中黄曲霉毒素，净化效果好，方法简单，适用于大批量样品中黄曲霉毒素的检测，同时该方法也满足我国对黄曲霉毒素限量的检测要求。参考文献：【1】张鹏，赵卫东，张艺兵.高效薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2J.分析化学，20003：392.【2】王彩云，王政纲，云战友.酶联免疫法测定食品和饲料中的黄曲霉毒素J.食品工程，20214：58-60.【3】Ibá?ez-VeaM，CorcueraLA，RemiroR，etal.ValidationofaUHPLC-FLDmethodforthesimultan