基因重组与基因工程概述

1、第十四章第十四章 基因重组与基因工程基因重组与基因工程姚真真姚真真生物化学与分子生物学教研室生物化学与分子生物学教研室Gene recombination & Gene engineering中心法则中心法则 逆逆转录转录转录转录RNA翻译翻译蛋白质蛋白质复制复制DNA生物体生物体环境环境 基因的表达调控基因的表达调控 适应环境适应环境了解中心法则了解中心法则 对天然的对天然的DNA进行改造进行改造为人类服务为人类服务基因工程基因工程 即即DNADNA重组技术。在分子水平重组技术。在分子水平上进行遗传操作，上进行遗传操作，按设计的蓝图按设计的蓝图，从供体中提取或人工合成从供体中提取或人

2、工合成目的基因目的基因，使其与载体构建成重组使其与载体构建成重组DNADNA，再转再转移到受体细胞。移到受体细胞。目的基因目的基因在受体细在受体细胞中表达，获得新的遗传性状胞中表达，获得新的遗传性状 。 基因工程基因工程荧光蛋白酶基因荧光蛋白酶基因乳汁中分泌人凝血因子的乳汁中分泌人凝血因子的转基因山羊转基因山羊乳汁中乳汁中分泌分泌人蛋白人蛋白因子因子的的转基因转基因猪猪主要内容主要内容DNA重组重组重组重组DNA技术技术重组重组DNA与医学的关系与医学的关系 不同不同DNA之间发生共价连接形成新之间发生共价连接形成新的的DNA 分子。分子。 基因移动和重组是生物界普遍现象，基因移动和重组是生物

3、界普遍现象，是生物进化的动力，是生物进化的动力，DNA重组具有重组具有重要的生物学意义重要的生物学意义DNA重组概念重组概念第一节第一节 DNA重组重组DNADNA重组的类型重组的类型位点特异性重组位点特异性重组（site-specific recombination）接合接合(conjugation) 转化转化(tranformation) 转导转导(transduction)同源重组同源重组（homologous recombination）转座重组转座重组（transposition recombination ）细菌的基因转移与重组细菌的基因转移与重组一、细菌的基因转移与重组一、细菌的

4、基因转移与重组 接合接合(conjugation) 转化转化(tranformation) 转导转导(transduction)（一）接合作用（一）接合作用 (conjugation ) 指通过细胞的指通过细胞的直接直接接触接触( (如菌毛如菌毛) ) ，遗传信息从供体细胞遗传信息从供体细胞单向转移单向转移到受到受体细胞的过程。体细胞的过程。接合接合转移转移F因子因子染色体染色体DNA性鞭毛性鞭毛Griffith 肺炎球菌转化实验肺炎球菌转化实验（二）转化（二）转化（transformation） 相关概念：相关概念：转化：转化：细胞从周围介质中吸收裸露细胞从周围介质中吸收裸露 的的DNA,而

5、获得新的遗传表型。而获得新的遗传表型。感受态细胞（感受态细胞（competent cell）: 具有摄取周围介质中游离具有摄取周围介质中游离DNA 分子能力的细菌细胞。分子能力的细菌细胞。 转化过程：转化过程：DNA片断细菌细菌摄取摄取DNA片断片断重组重组细菌性状改变细菌性状改变（三）转导（三）转导（transduction）通过病毒（噬菌体）介导发生在供通过病毒（噬菌体）介导发生在供体细胞与受体细胞之间的体细胞与受体细胞之间的DNADNA转移转移和重组过程。和重组过程。溶溶 菌菌感感 染染重重 组组感感 染染细细 菌菌噬菌体噬菌体 转导转导噬菌体感染宿主噬菌体感染宿主后的两种结局后的两种结

6、局cI基因基因cro基因基因溶原状态溶原状态cI基因基因cro基因基因溶菌状态溶菌状态噬菌体感染宿主菌后的两种状态是由噬菌体的噬菌体感染宿主菌后的两种状态是由噬菌体的cI和和cro两个基因编码调控蛋白控制的，溶原状态，两个基因编码调控蛋白控制的，溶原状态， cI 表达；溶菌状态，表达；溶菌状态， cro 表达。除了控制其他基表达。除了控制其他基因表达外，因表达外， cI和和cro两个基因编码调控蛋白是互为两个基因编码调控蛋白是互为阻遏蛋白。阻遏蛋白。结合协同cI基因基因cro基因基因溶原状态溶原状态cI基因基因cro基因基因溶菌状态溶菌状态思考：思考：当含噬菌体的细菌用紫外线轻度当含噬菌体的细

7、菌用紫外线轻度照射后，照射后，cI蛋白被降解蛋白被降解,接下去会发生什接下去会发生什么？停止照射后会怎样？为什么会进化么？停止照射后会怎样？为什么会进化成这种机制？成这种机制？结合协同 二、同源重组二、同源重组（homologous recombination） 不需要特异不需要特异DNA序列，而是依赖两分子之间序列，而是依赖两分子之间序列的相同或相似性而进行的重组。序列的相同或相似性而进行的重组。同源序列愈长，同源重组率愈高，反之，则同源序列愈长，同源重组率愈高，反之，则不易发生重组。不易发生重组。 概念概念同源重组意义同源重组意义同源重组发生在任何生物中。同源重组发生在任何生物中。细菌如果

8、通过接合或转化获得的外源细菌如果通过接合或转化获得的外源DNA与宿主与宿主DNA充分同源，那末外源充分同源，那末外源DNA就可以整合进宿主的染色体。就可以整合进宿主的染色体。同源重组也是同源重组也是DNA损伤修复的重要机制损伤修复的重要机制Electron micrograph of a Holliday JunctionHolliday Junction (A) The structure of a Holliday junction bound by Cre recombinase (gray), a bacteriophage protein. (B) A schematic view

9、of a Holliday junction. 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 分支迁移分支迁移 (recA)5 3 5 3 5 3 5 3 内切酶内切酶 (recBCD)5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 3 3 5 5 内切酶内切酶(recBCD)5 3 3 3 DNA侵扰侵扰(recA)3 5 5 3 5 3 5 3 DNA 连接酶连接酶Holiday中间体中间体5 3 5 3 5 3 5 3 E. coli 的同源重组过程：的同源重组过程：5 3 Holiday中间体中间体5 3 5 3 5 3 3 5 5 5 5 3 3 3 内切酶内切酶(ruvC

10、)内切酶内切酶(ruvC)5 5 5 5 3 3 3 3 5 3 5 5 5 3 3 3 DNA连接酶连接酶3 5 5 5 5 3 3 3 拼接重组体拼接重组体 DNA连接酶连接酶5 5 5 5 3 3 3 3 片段重组体片段重组体Holliday模型同源重组步骤模型同源重组步骤两个同源染色体两个同源染色体DNA排列整齐排列整齐一个一个DNA的一条链断裂、并与另一个的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成对应的链连接，形成Holliday中间体中间体通过分支移动产生异源双链通过分支移动产生异源双链DNAHolliday中间体切开并修复，形成两个双链中间体切开并修复，形成两个双链重组体重

11、组体DNA，分别为：分别为：片段重组体片段重组体(patch recombinant)拼接重组体拼接重组体(splice recombinant) 片段重组体片段重组体 （见模型图（见模型图右右边产物）：边产物）： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。5 5 5 5 3 3 3 3 片段重组体片段重组体拼接重组体拼接重组体（见模型图（见模型图左左边产物）：边产物）： 切开的链并非原来断裂的链，重组体异源切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本双链区的两

12、侧来自不同亲本DNA。 3 5 5 5 5 3 3 3 拼接重组体拼接重组体 位点特异性重组：位点特异性重组：由整合酶催化，在两个由整合酶催化，在两个DNA位点特异的短序列之间发生的切割和连位点特异的短序列之间发生的切割和连接反应接反应:l 噬菌体噬菌体DNA整合整合l细菌特异位点重组细菌特异位点重组l免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白基因的重排三、位点特异性重组三、位点特异性重组（一）（一）噬菌体噬菌体DNA的整合的整合噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转反转录病毒整

13、合酶可特异地识别、整合反转录病毒录病毒cDNA的的长末端重复序列长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)。 attPattBE. coli DNAInt, IHFInt, IHF , Xis DNA噬菌体噬菌体DNA的的整合和切除整合和切除att: attachment site, Int: integrase, IHF: integration host factor, Xis: excisionasePOPBOBBOPPOBattLattR整合整合切除切除hix为反向重复序列，它们之间的为反向重复序列，它们之间的H片片段可在段可在Hin控制下进行特异位点重组控制

14、下进行特异位点重组(倒位倒位)。H片段上有两个启动子片段上有两个启动子P，其一驱动其一驱动hin基因表达，另一正向时驱动基因表达，另一正向时驱动H2和和rH1基因表基因表达，反向达，反向(倒位倒位)时时H2和和rH1不表达。不表达。rH1为为H1的阻遏蛋白基因。的阻遏蛋白基因。（二）细菌的特异位点重组（二）细菌的特异位点重组沙门氏菌沙门氏菌H H片段片段特异位点重组特异位点重组(倒位倒位) )决定鞭毛相转变决定鞭毛相转变DNAH片段片段 h1H2与阻遏基因与阻遏基因mRNAHin重组酶重组酶H2鞭毛素鞭毛素阻遏蛋白阻遏蛋白(a) hinh2阻遏基因阻遏基因rh1启动序列启动序列hinmRNAP

15、Phixhix hinh2阻遏基因阻遏基因rh1H片段倒位片段倒位 h1hin mRNAH1 mRNAHin重组酶重组酶H1鞭毛素鞭毛素(b) hinPP沙门氏菌沙门氏菌H H片段片段特异位点重组特异位点重组(倒位倒位) )决定鞭毛相转变决定鞭毛相转变（二）细菌的特异位点重组（二）细菌的特异位点重组（三）、免疫球蛋白基因的重排（三）、免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链由两条轻链(L链链)和两和两条重链条重链(H链链)组成，分别由三个独立的基因组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链族编码，其中两个编码轻链( 和和 )，一个编，一个编码重链。码重链。 轻链的基

16、因片段：轻链的基因片段：重链的基因片段：重链的基因片段：L V J C L V D J C The organization of mouse immunoglobulin gene segments. The organization in germline cells is shown on the left, and the rearranged organization characteristic of mature B lymphocytes is shown to the right of the arrows. The rearranged states shown are b

17、ut single examples of the many possibilities for each gene family. Consensus elements are located above and below germline variable-region genes that recombine to form genes encoding immuno-globulin chains. These consensus elements are complementary and are arranged in a heptamer-nonamer, 12-bp to 2

18、3-bp spacer pattern. -Chain -Chain H-Chain231223122312 CACAGTG ACAAAAACC ACAAAAAACC CACAGTG此重排的重组酶基因此重排的重组酶基因rag (recombination activating gene)共共有两个，分别产生蛋白质有两个，分别产生蛋白质RAG1和和RAG2。RAG1 识别九核识别九核苷酸序列，苷酸序列，RAG2 加入复合物，切割七核苷酸序列位点等加入复合物，切割七核苷酸序列位点等 CACAGTG ACAAAAACC GTGTCAC TGTTTTTGG 7 核苷酸序列核苷酸序列 12/23间隔序列

19、间隔序列 9核苷酸序列核苷酸序列重组信号序列（重组信号序列（RSS）重排机制：重排机制：重链重链(IgH)基因的基因的V-D-J重排和轻链重排和轻链(IgL)基因的基因的V-J重排均发生重排均发生在特异位点上。在在特异位点上。在V片段的下游，片段的下游，J片段的上游以及片段的上游以及D片段的片段的两侧均存在保守的重组信号序列两侧均存在保守的重组信号序列(recombination signal sequence, RSS)。V片段片段J片段片段RSSRSS间插间插DNAOHHOVJ单链切开单链切开RAG1RAG2分子内转酯反应分子内转酯反应单链切开单链切开转移核苷酸转移核苷酸修复、连接修复、连

20、接免疫球蛋白基因重排过程免疫球蛋白基因重排过程-OH亲核攻击亲核攻击四四 转座重组转座重组（transpositiontransposition）由插入序列和转座子介导的基因转移或重排。由插入序列和转座子介导的基因转移或重排。 许多数细菌基因组含有几十个拷贝的能转许多数细菌基因组含有几十个拷贝的能转座座DNA片段，片段长度从几百到几万个片段，片段长度从几百到几万个bp,是遗传多样性的一个重要来源。是遗传多样性的一个重要来源。转座重组分类：转座重组分类：插入序列插入序列 ( insertion sequence，IS )转座转座: 由转座酶（由转座酶（transposase）、）、一个分离的反向

21、重复序一个分离的反向重复序（inverted repests）列和侧翼二个正向重复序列（列和侧翼二个正向重复序列（direct repeats）组成。组成。 发生形式：发生形式： 保守性转座保守性转座( (conservative transposition)conservative transposition) 复制性转座复制性转座( (duplicative transposition)duplicative transposition) 转座子（转座子（transposon，Tn）转座：转座： 除了有插入序列的除了有插入序列的 结构外，还带有抗性或其他标记基因。结构外，还带有抗性或其他标

22、记基因。转座序列结构转座序列结构反向重复序列反向重复序列反向重复序列转座酶基因IS转座酶基因ampR反向重复序列Tn3转座酶基因tetRTn10IS细菌中的三种转座子类型插入序列的复制性转座插入序列的复制性转座转座子转座子(transposons) 可从一个染色体位可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。点转移到另一位点的分散重复序列。 转座子组成：转座子组成：反向重复序列反向重复序列转座酶编码基因转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因抗生素抗性等有用的基因IRIRTransposase Gene有用基有用基因因转座子转座转座子转座由转座子介导的转座由转座子介导的转座Exon shuff

23、ling by transposition. (a) Transposition of an exon flanked by homologous DNA transposons into an intron on a second gene. transposase can recognize and cleave the DNA at the ends of the transposon inverted repeats. In gene 1, if the transposase cleaves at the left end of the transposon on the left

24、and at the right end of the transposon on the right, it can transpose all the intervening DNA, including the exon from gene 1, to a new site in an intron of gene 2. The net result is an insertion of the exon from gene 1 into gene 2. 转座子转座转座子转座-外显子重组（混编）外显子重组（混编） 外显子混编（外显子混编（ Exon shuffling ）：）：产生许多新

25、功能产生许多新功能的蛋白质的蛋白质外显子混编是生物进化的一个重要过程，得益于真核生物外显子混编是生物进化的一个重要过程，得益于真核生物DNA编码序列的组织方式：断裂基因含有长长的内含子，含有许多编码序列的组织方式：断裂基因含有长长的内含子，含有许多的重复序列，并处于外显子的两侧。因此，内含子的存在提供的重复序列，并处于外显子的两侧。因此，内含子的存在提供了外显子混编的基础。有人提出人基因组编码的约了外显子混编的基础。有人提出人基因组编码的约6万种蛋白万种蛋白质是从几千个独立的外显子混编而来。质是从几千个独立的外显子混编而来。第二节第二节 重组重组DNADNA技术技术重组重组DNA技术相关概念及

26、意义技术相关概念及意义重组重组DNA技术的原理及过程技术的原理及过程重组重组DNA技术与医学关系技术与医学关系一、重组一、重组DNA技术相关概念及意义技术相关概念及意义 （一）有关（一）有关DNA克隆的相关概念克隆的相关概念克隆克隆（clone）: 通过无性繁殖过程所产生的与亲代通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体，这一群体可以是分子、细胞、完全相同的子代群体，这一群体可以是分子、细胞、动物或植物等。获取这一群体的过程称为动物或植物等。获取这一群体的过程称为克隆化克隆化（cloning）DNA克隆克隆(DNA cloning ) ： 是按人类的意愿，在体是按人类的意愿，在体外对外对

27、DNA分子进行重组，再将重组分子导入受体细分子进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA分子分子的大量拷贝。又称的大量拷贝。又称分子克隆分子克隆 （molecular cloning)，基因克隆（基因克隆（gene cloning）、）、重组重组DNA ( recombinant DNA) 。重组重组DNA技术技术(recombinant DNA technology)：是指实现基因（或是指实现基因（或DNA）克隆所采用的方法及技术路线等。又称克隆所采用的方法及技术路线等。又称基因工程（基因工程（gene engineerin

28、g），），遗传工遗传工程程（genetic engineering）等。等。（二）重组（二）重组DNADNA技术的意义技术的意义填平了物种间不可逾越的鸿沟；填平了物种间不可逾越的鸿沟；缩短进化时间；缩短进化时间；对生物定向改造；对生物定向改造；基因结构、结构功能及调控研究的基础；基因结构、结构功能及调控研究的基础；疾病诊治疾病诊治二、重组二、重组DNA技术的原理及过程技术的原理及过程基本过程：基本过程：分分切切接接转转筛筛（一）工具（一）工具酶酶 工工具酶具酶：系系指能用于指能用于DNA和和RNA分子分子的的切割切割，连接连接，聚合聚合，反反转录转录等等有关有关的的酶酶系系统统称为工具称为工具

29、酶酶。常常 用用 的的 工工 具具 酶酶 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶 (restriction endonucleases) DNA连接酶连接酶 (DNA ligase) DNA聚合酶聚合酶I (DNA polymerase I) 多核苷酸激酶多核苷酸激酶 (polynucleotide kinase) 反转录酶反转录酶 (reverse transcriptase) DNA末端转移酶末端转移酶 (DNA terminal transferase) 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase) 在在DNA分子内部的特异性的碱基序列内部进行分子内部的特异性的碱基序列内

30、部进行切割切割 将两条以上的线性将两条以上的线性DNA分子或片段分子或片段 催化形成磷催化形成磷酸二酯键连接成一个整体酸二酯键连接成一个整体 催化催化DNA 切口平移反应，制备高比活探针；切口平移反应，制备高比活探针； DNA末端标记，合成末端标记，合成cDNA的第二链的第二链 催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的 5OH末端上末端上 以以RNA为模板合成互补的为模板合成互补的cDNA链链 线性双链线性双链 或单链或单链DNA分子的分子的3OH末端末端加上同加上同聚物尾聚物尾 去除去除DNA,RNA,dNTP的的5末端的末端的磷酸基团磷酸基团工工 具具 酶酶

31、 主主 要要 功功 能能1、限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） 定义定义：是一类能识别和切割双链：是一类能识别和切割双链DNA分子中特定分子中特定碱基序列的核酸水解酶。碱基序列的核酸水解酶。分类分类vI 型：复合功能酶内切型：复合功能酶内切(识别位点周围识别位点周围400-700 bp)、甲基化、甲基化、ATP酶和酶和DNA解旋；解旋；vIII型：内切型：内切(识别位点周围识别位点周围25-30 bp) 、甲基化甲基化vII 型：识别和切割双链型：识别和切割双链DNA的特异顺序的特异顺序(识别识别位点内位点内)命名：根据酶的微生物学名命名：命

32、名：根据酶的微生物学名命名： 如：如：Escherichia coli, R株中几种限制酶：株中几种限制酶： EcoR I，EcoR II，EcoR V第一字母（大写，斜体），示该酶微生物第一字母（大写，斜体），示该酶微生物属属名；名；第二、三字母（小写，斜体），示该酶微生物第二、三字母（小写，斜体），示该酶微生物种种名；名；第四字母（大写，斜体），示该酶微生物第四字母（大写，斜体），示该酶微生物株或株或型型；如一种菌株中有多种限制性内切酶，用罗马数字如一种菌株中有多种限制性内切酶，用罗马数字表示发现分离的先后顺序。表示发现分离的先后顺序。II型限制性内切酶的作用特点型限制性内切酶的作用特点识

33、别序列个碱基，识别序列个碱基，4个核苷酸序列，个核苷酸序列，则每则每（）个碱基出现一个靶序列；（）个碱基出现一个靶序列；6个核苷酸序列出现的间隔是个核苷酸序列出现的间隔是4kb, 8个核苷个核苷酸序列则是酸序列则是65kb 。回文结构回文结构（palindrome）三种不同的切口：平末三种不同的切口：平末(blunt end) 端、端、 突出粘性末端突出粘性末端(cohensive end or stick ) 突出粘性末端突出粘性末端限制性核酸内切酶三种切口限制性核酸内切酶三种切口产生产生5突出粘性末端（突出粘性末端（sticky end):以以EcoR I为例：为例： 5-G AATTC-

34、3 5-GP OHAATTC-3 3-CTTAA G-5 EcoR I 3-CTTAAOH PG-5产生产生3突出粘性末端突出粘性末端:以以Pst I为例：为例： 5-CTGCA G-3 5-CTGCAp OHG-3 3-G ACGTC-5 Pst I 3-GOH p ACGTC-5产生平末端（产生平末端（blunt end): 以以Nru I为例：为例： 5-TCG CGA-3 5-TCGp OHCGA-3 3-AGC GCT-5 Nru I 3-AGCOH pGCT-5II型限制性内切酶的用途：型限制性内切酶的用途： DNA克隆克隆 DNA杂交与序列分析杂交与序列分析 改建质粒改建质粒 构

35、建基因组图谱和文库构建基因组图谱和文库限制与修饰系统（限制与修饰系统（ restriction modification ，R-M系统）：系统）： 甲基化酶与相关的甲基化酶与相关的II型限制性内切酶组成，型限制性内切酶组成，它们识别相同序列，发挥不同功能。它们识别相同序列，发挥不同功能。 如：如：EcoRI restriction endonuclease和和 EcoRI methylaserestriction modification (a) EcoRI, a restriction enzyme from E. coli, makes staggered cuts at the spec

36、ific 6-bp inverted repeat sequence shown. This cleavage yields fragments with single-stranded, complementary “sticky” ends. Many other restriction enzymes also produce fragments with sticky ends. (b) Bacterial cells with restriction endonucleases also contain corresponding modification enzymes that

37、methylate bases in the restriction-recognition site. For example, E. coli cells containing the EcoRI restriction enzyme also contain EcoRI methylase, a modification enzyme that catalyzes addition of a methyl group to two adenines in the EcoRI recognition sequence. The methylated restriction site is

38、not cleaved by EcoRI, assuring that a cell making this restriction enzyme does not destroy its own DNA. 2、DNA聚合酶（聚合酶（DNA polymerases）能合成能合成DNA的酶称的酶称DNA聚合酶。常用的酶：聚合酶。常用的酶：大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶及其大片断（及其大片断（Klenow片段）片段）Taq DNA聚合酶聚合酶反（逆）转录酶反（逆）转录酶末端脱氧核糖核酶转移酶（末端转移酶）末端脱氧核糖核酶转移酶（末端转移酶）(1) 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 5 3外切

39、酶外切酶 53聚合酶聚合酶 3 5外外切酶切酶枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶Klenow 片段片段作用特点：作用特点：多功能酶：多功能酶：53DNA聚合酶活性聚合酶活性35外切酶活性外切酶活性53外切酶活性外切酶活性主要用途主要用途: 催化催化DNA 切口平移反应，制备高比活探切口平移反应，制备高比活探针；针； DNA测序、合成测序、合成cDNA第二链，及第二链，及DNA末端标末端标记（记（Klenow片段）片段）555555DNA酶酶 IDNA聚合酶聚合酶I（全酶）全酶）利用大肠杆菌利用大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I进行切口平移法进行切口平移法Mg 2+dATP dCTP dGTP-32P dT

40、TPT*T*T*T*T*T*55555555限制性内切酶限制性内切酶Klenow 片段片段-32P dNTP变性变性3末端末端32P标记的标记的单链单链DNA探针探针利用利用Klenow片断进行片断进行3端标端标记记5末端末端突出的突出的DNA（2）Taq DNA聚合酶聚合酶 1988年年saiki在嗜热水生菌在嗜热水生菌(thermus aquaticus)分离出分离出耐热耐热的依赖于的依赖于DNA的的DNA聚合酶，聚合酶，MW=65kD，主要应用于聚合酶主要应用于聚合酶链反应（链反应（polymerase chain reaction, PCR）中对中对DNA分子的特定序列进行体外扩增分子

41、的特定序列进行体外扩增（3）反转录酶）反转录酶 (reverse transcriptase) 亦称依赖于亦称依赖于RNA的的DNA聚合酶（聚合酶（RDDP)催化以催化以RNA为模板的为模板的DNA聚合反应，以聚合反应，以mRNA为为模板，催化合成出互补的模板，催化合成出互补的DNA，称为称为cDNA (com -plementary DNA)。主要用于主要用于cDNA文库的构建。文库的构建。35外切酶活性（又称外切酶活性（又称RNA酶酶H活性），特异性活性），特异性降解降解RNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的RNA部分部分（4 4）末端脱氧核糖核酸转移酶）末端脱氧核糖核酸转移酶（末端转移（

42、末端转移酶酶, terminal , terminal transferasetransferase）催化作用：催化作用：在二价阳离子存在下，它催化在二价阳离子存在下，它催化dNTP加到加到DNA分子的分子的3羟基端。羟基端。用途：用途：l用于给载体或用于给载体或cDNA加上互补的多聚体尾巴，加上互补的多聚体尾巴，造成便于重组的人工粘性末端；造成便于重组的人工粘性末端；l用于用于DNA片断片断3-末端标记。末端标记。AAAAAn 3 mRNAA A A AAn 3 mRNAT T T T 5 cDNAT T T T 5GGGGGGGGT T T T 55CCCCA A AAOligo(dT)引

43、物引物反转录酶反转录酶dNTPOligo (dC) 引物引物Taq DNA 聚合物聚合物（或（或Klenow 片段）片段）dNTP去除去除mRNA链链加加oligo(dG)末端转移酶末端转移酶cDNA双链双链全长双链全长双链 cDNAcDNA的合成的合成5533333、DNA连接酶连接酶(ligase) 催化两个独立催化两个独立DNA片段的片段的5磷酸基与磷酸基与3羟基之间形羟基之间形成磷酸二酯键，使成磷酸二酯键，使DNA片片段拼接起来段拼接起来T4连接酶连接酶：粘性末端和平：粘性末端和平末端；末端；大肠杆菌连接酶大肠杆菌连接酶：粘性末：粘性末端端4 4、多核苷酸激酶（、多核苷酸激酶（poly

44、nucleotide polynucleotide kinasekinase） 寡核苷酸探针标记；用于连接反应，使缺寡核苷酸探针标记；用于连接反应，使缺 少少端端磷酸的磷酸的DNA片段合成接头磷酸化片段合成接头磷酸化N N N N NHOAd-P-P-P5 3N N N N NP5 3 +Ad-P-P+ - 32PATPADP寡核苷酸片段寡核苷酸片段32P标记的标记的寡寡核苷酸片段核苷酸片段多核苷酸激酶多核苷酸激酶（二）基因载体（二）基因载体（vectorvector） 载体（载体（vector）：携带目的携带目的DNA片段进入宿片段进入宿主细胞进行扩增和主细胞进行扩增和/或表达的一类或表达的

45、一类DNA分子。分子。载体特征：载体特征：l自主复制自主复制 即有复制原点（必需）即有复制原点（必需）l酶切位点（必需）酶切位点（必需）l大小适合大小适合l筛选标记筛选标记: 如抗药性、营养标记、如抗药性、营养标记、 -半乳糖半乳糖苷酶显色反应等苷酶显色反应等l拷贝数高拷贝数高 载体类型载体类型：l来源来源: 质粒；噬菌体；病毒质粒；噬菌体；病毒, 酵母人工染色酵母人工染色体体l功能功能: 克隆载型体和表达型载体克隆载型体和表达型载体l受体细胞受体细胞: 原核细胞载体、真核细胞载体和原核细胞载体、真核细胞载体和穿梭载体（穿梭载体（shuttle vector）u质粒（质粒（plasmid）：细

46、菌染色体外小型双链环状细菌染色体外小型双链环状DNA。u质粒复制的类型质粒复制的类型：严紧型：严紧型：1-5拷贝，与细菌复制密切相关拷贝，与细菌复制密切相关松弛型：松弛型：10-200拷贝以上拷贝以上u常用载体常用载体：pBR322：4.36kb；人工构建人工构建 ；Tetr和和Ampr；多克隆位多克隆位点，松弛型点，松弛型pUC系列质粒：系列质粒： pBR322和和M13噬菌体改建噬菌体改建, 2.674kb；Ampr；蓝白斑筛选（蓝白斑筛选（lacZ， -肽）；高拷贝（肽）；高拷贝（500-700）1 1、质粒载体、质粒载体u用途用途：保存与扩增保存与扩增 2kb的目的基因的目的基因构建构

47、建cDNA文库文库测序测序制备探针制备探针复制点：复制点：ori筛选标记筛选标记：ampr,tetr克隆位点克隆位点：多个单一：多个单一限制性内切酶位点限制性内切酶位点2 2、噬菌体载体、噬菌体载体 （bacterieophagebacterieophage vectorvector）基因组特点基因组特点：u50kb双链双链DNA分子，末端分子，末端12bp为互补单链为互补单链（cos位点，又称粘端）位点，又称粘端）u两个启动子：两个启动子：PR和和PLu编码基因：包装蛋白，裂解功能蛋白等编码基因：包装蛋白，裂解功能蛋白等生长方式生长方式：u溶菌性生长（组装噬菌体）溶菌性生长（组装噬菌体）u溶

48、源性生长（整合入细菌溶源性生长（整合入细菌DNA内）内）噬菌体载体（噬菌体载体（Bacteriophage Lambda）cosTACGGGGCGGCGACCTCGCGATGCCCCGCCGCTGGAGCGCCos序列及酶切割位点序列及酶切割位点载体种类：载体种类：u插入载体插入载体（insertion vector）：）：外源性外源性DNA直直接插入酶切位点（接插入酶切位点（EcoR）容量：几个容量：几个kb代表载体：代表载体：gt10； gt11用途：构建用途：构建cDNA文库文库u替代载体替代载体（substitution vector）：）：外源性外源性DNA替代载体中央部分替代载体中

49、央部分酶切位点：酶切位点：EcoR；BamH；Sal容量：容量：9-22kb代表载体：代表载体：EMBL4用途：构建基因组文库用途：构建基因组文库coscoscoscoscoscoscIEcoR IEcoR IlacZE,B,SE,B,Sgt10gt11EMBL4 噬菌体插入载体和替代载体示意图噬菌体插入载体和替代载体示意图3 3、柯斯质粒载体、柯斯质粒载体（cosmid）基因组组成：基因组组成：质粒与噬菌体的质粒与噬菌体的cos位点联合位点联合构成、构成、 4-6kb、质粒复制起始位点、酶切位质粒复制起始位点、酶切位点、抗药性基因；点、抗药性基因；容量：容量：29-45kb代表载体：代表载体

50、： pGEM-3Zf（-）工作方式：工作方式：具有噬菌体样的包装和感染，具有噬菌体样的包装和感染，又具有质粒样的复制又具有质粒样的复制用途：用途：基因组文库基因组文库（三）目的基因（三）目的基因（target genetarget gene）1、目的基因的用途、目的基因的用途研究该基因的全貌与内涵：结构、功能、调研究该基因的全貌与内涵：结构、功能、调控控寻找异常基因异常点，探索疾病的机理与治寻找异常基因异常点，探索疾病的机理与治疗疗研究生物种系进化与相关同源性研究生物种系进化与相关同源性基因工程重组表达基因工程重组表达改造某些基因，以改良品种改造某些基因，以改良品种基因治疗基因治疗2 2、获得

51、目的基因的方法、获得目的基因的方法原核目的基因获得：原核目的基因获得：直接分离直接分离真核目的基因获得：真核目的基因获得：l基因组文库筛选基因组文库筛选lcDNA文库筛选文库筛选l人工合成人工合成lPCR合成合成 DNA文库概念文库概念 DNA文库（文库（DNA library）：）：通过重组、克隆方法通过重组、克隆方法保存在宿主细胞中的各种重保存在宿主细胞中的各种重组组DNA分子的集合体分子的集合体 。 分两类：分两类：基因组文库基因组文库(genomic library)：将某种生物细胞的将某种生物细胞的基因组基因组DNA切割成一定大小的片段后，分别与合适切割成一定大小的片段后，分别与合适

52、的载体重组并导入宿主细胞内克隆保存。这种保存的载体重组并导入宿主细胞内克隆保存。这种保存在宿主细胞内的整个基因组在宿主细胞内的整个基因组DNA片段集合体称片段集合体称。cDNA文库文库(cDNA library)：将分离纯化获得某种真将分离纯化获得某种真核细胞中的全部核细胞中的全部mRNA逆转录成逆转录成cDNA，并通过重并通过重组、克隆方法保存在宿主细胞中。这种保存在宿主组、克隆方法保存在宿主细胞中。这种保存在宿主细胞内的细胞内的cDNA集合体称集合体称。用聚合酶链反应（用聚合酶链反应（PCR）方法获取目的基方法获取目的基因因第一次循环：第一次循环：变性（变性（95oC） 退火退火延伸（延伸

53、（72oC）第二次循环第二次循环第三次循环第三次循环2530次循环后次循环后模板模板DNA含量含量可以扩大可以扩大100万万百倍以上百倍以上用用聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）方法获取目的基因方法获取目的基因一对引物分别含有一对引物分别含有BamH I 和和Hind III 位点，位点，PCR产物经双产物经双酶切后，可定向插入载体。酶切后，可定向插入载体。（四）外源基因与载体的连接（四）外源基因与载体的连接作用酶：作用酶：DNA连接酶连接酶连接方式：连接方式：l粘性末端连接粘性末端连接l平末端平末端l同聚物加尾连接同聚物加尾连接l人工接头人工接头 人工接头人工接头连接连接法法BamHI接头

54、接头连接酶连接酶BamHI切割切割连接酶连接酶 + BamHI切割的切割的pBR322（五）重组（五）重组DNA导入受体菌导入受体菌1、重组子导入受体菌的方式、重组子导入受体菌的方式 ：u转化（转化（transformation）：）：特指将质粒特指将质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。菌的过程。u转染（转染（transfection）：）：病毒及其重组子病毒及其重组子导入受体细胞。导入受体细胞。2 2、导入方法、导入方法u氯化钙法氯化钙法 感受态感受态 ：细菌处于容易吸收外细菌处于容易吸收外源源DNA的状态称的状态称感受态感受态 制备条件：制备条件

55、：冰浴、低渗冰浴、低渗CaCl2 （ 0.1mol/L ） 转化反应：转化反应：冰浴冰浴30分分短暂短暂热休克（热休克（42） 转化效率转化效率：105-106/g DNA;环状环状DNA高于高于线状线状DNA 1000倍倍u电穿孔法：电穿孔法：电穿孔仪电穿孔仪（六）重组子的筛选与鉴定（六）重组子的筛选与鉴定1、阳性菌落筛选：、阳性菌落筛选：u抗药性标志：抗药性标志：ampr、tetr、neoru插入抗性失活插入抗性失活u互补筛选：蓝白斑筛选（互补筛选：蓝白斑筛选（-互补）、营互补）、营养缺陷互补养缺陷互补u分子杂交：原位杂交、分子杂交：原位杂交、southern杂交杂交2 2、插入外源性、插

56、入外源性DNADNA的鉴定：的鉴定：u酶切（目的片段长度）酶切（目的片段长度）uPCRPCRu测序测序3 3、表达蛋白的鉴定：、表达蛋白的鉴定：免疫学、生物学免疫学、生物学活性活性抗药性抗药性筛选筛选多克隆位点多克隆位点启动子启动子裂开的裂开的N端端裂开的裂开的N端端外源外源DNA 半乳糖苷酶半乳糖苷酶 N端编码序列端编码序列pUC182686bppUC182686bp染色体染色体重组体重组体pUC18细菌在含细菌在含X-gal和乳糖操和乳糖操纵子诱导剂的琼脂上培养纵子诱导剂的琼脂上培养细菌在含细菌在含X-gal和乳糖操纵和乳糖操纵子诱导剂的琼脂上培养子诱导剂的琼脂上培养pUC18含重组体含重

57、组体pUC18的白色菌落的白色菌落蓝色菌落蓝色菌落含载体含载体pUC18的蓝色菌落的蓝色菌落 半乳糖苷酶半乳糖苷酶C 端编码序列端编码序列转化转化转化转化 利用利用 互补原理筛选（兰白斑筛选）重组子互补原理筛选（兰白斑筛选）重组子pUC18amprampr蓝白斑筛选重组质粒蓝白斑筛选重组质粒原位杂交原位杂交Radioactive probe will hybridize with its complementary DNAWash filter, prepare autoradiograph and compare with master platePlace nitrocellulose f

58、ilter in sealable plastic bag with solution of labeled DNA probeSouthern blot免疫学方法筛选重组子免疫学方法筛选重组子DNA DNA 重组技术实例：重组技术实例： 基因文库构建与筛基因文库构建与筛选选 人基因组文库构建人基因组文库构建Construction of a genomic library of human DNA in a bacteriophage l vector. 人基因组人基因组DNA用限制性内切用限制性内切酶（酶（Sau 3A）部分消化产生部分消化产生约约20-kb带粘性末端的部分重带粘性末端的部

59、分重叠的随机片段；叠的随机片段；载体消化：载体消化： 噬菌体噬菌体DNA用用Bam H1消化，去掉中间的可消化，去掉中间的可置换片段，并产生左右两个置换片段，并产生左右两个带粘性末端的片段带粘性末端的片段基因组片段与基因组片段与 噬菌体噬菌体DNA拼拼接成重组接成重组DNA体外装配有活性的噬菌体，体外装配有活性的噬菌体，并感染大肠杆菌并感染大肠杆菌菌种培养、筛选、扩增保存菌种培养、筛选、扩增保存Infect E.coliIndividual clonesProduction of overlapping restriction fragments by partial digestion of

60、 human genomic DNA with Sau3A. This restriction endonuclease recognizes the 4-bp sequence GATC and produces fragments with single-stranded sticky ends with this sequence on the 5 end of each strand. A hypothetical region of human genomic DNA showing the Sau3A recognition sites (red) is shown at the top.