毕赤酵母表达系统资料整理

1、毕赤醉母表达系统之阿布王创作时间：二O二一年七月二十九日Mut+和 Muts毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶一一AOX1及AOX2细胞中年夜大都的醇氧化酶是 AOX1基因产物，甲醇可紧密调节、诱导 AOX1基因的高水平表达，较典范的是占可溶性卵白的30犯上.AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制.简单来说， 在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制.为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养.注意即使在甘 油中生长（去抑制）时，仍缺乏以使AOX1基因到达最低水平的表达， 诱导物甲醇是 AOX1基因可辨表达水平所必需的.AOX1基因已被分 离，含AOX1启动子的质

2、粒可用来增进编码外源卵白的目的基因的 表达.AOX2基因与AOX1M因有97%勺同源性，但在甲醇中带 AOX2S 因的菌株比带AOX1基因菌株慢很多，通过这种甲醇利用缓慢表型 可分离Muts菌株.在YPD替母膏、卵白月东、葡萄糖）培养基中，不 论是Mut+还是Muts其在对数期增殖一倍的时间年夜约为2h.Mut+和Muts菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率是一样的，存在甲醇的情况下,Mut+在对数期增殖一倍的时间年夜约为4至6个小时,Muts在对数期增殖一倍的时间年夜约为18个小时.菌株 GS115 X-33、KM71 和 SMD1168勺区另U时间：二O二一年七月二十九日GS115 KM71

3、和SMD1168?是用于表达外源卵白的毕赤酵母受 体菌，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不会使卵白过糖基化 ，糖基化后有 利于卵白的溶解或形成正确的折叠结构.GS115、KM71 SMD116酢组氨酸脱氢酶位点（His4）有突变，是组氨酸缺陷型，如果表达载体 上携带有组氨酸基因，可赔偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不 含组氨酸的培养基上筛选转化子.这些受体菌自发突酿成组氨酸野生型的概率一般低于10-8.GS115表型为Mut+,重组表达载体转化GS115后，长出的转化子可能是 Mut+,也可能是Muts（载体取代AXO1 基因），可以在MMR! MDW养基上鉴定表型.SMD1168和GS115类似，

4、但SMD116睡因组中的Pep4基因发生突变，是卵白酶缺陷型，可降 低卵白酶对外源卵白的降解作用.其中X-33由于是野生型，因此耐受性比力好，如果担忧转化率 的话可以考虑这种酵母菌，而X33与GS115一样都是属于 MUH暗 示型，也就是说可以在含甲醇的培养基中快速生长，可是据说会对外源基因表达有影响，KM71的亲本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因（arg4）有突变，在不含精氨酸的培养基中不能生长.用野生型ARG4基因（约2kb）拔出到克隆的野生型 AOX1基因的BamHI（AOX1基因15/16密码子）及 SalI（AOX1基因227/228密码子）位点，取代了 AOX1基因16-227密 码子，

5、此结构转化至 KM71亲本菌（arg4his4）中，分离发生 KM71 MutsArg+His-菌株,Arg+转化子遗传分析显示野生型 AOX1被 时间：二。二一年七月二十九日aox1:ARG4结构所取代，所以KM71所有转化子都是 Muts表型,AOX1 位点没有被完全缺失，理论上可用你的目的结构通过基因取代方法 替换aox1:ARG4结构，这样重组菌株的表型是 His+MutsArg-,这意 味着重组菌株生长时需精氨酸.但仅添加精氨酸其实不能完全缓和 arg4突变的影响,arg4菌株在含精氨酸的最小培养基中不能很好 地生长.因此不推荐在KM71中通过取代aox1:ARG4结构来获得His

6、+转化子.一般来说，如果是胞内表达，应尽量用 Muts细胞，这样获得的 卵白产物中醇氧化酶卵白量较少而目的卵白量相对较多，使下游纯化更易进行.而对分泌卵白的表达，无论是甲醇利用慢（Muts）还是 甲醇利用快（Mut+）的细胞都可应用.基因重组Pichia.pastoris酵母菌体内无天然质粒，所以表达载体需与宿主染色体发生同源重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以 实现外源基因的表达，包括启动子、外源基因克隆位点、 终止序列、 筛选标识表记标帜等.细菌内同源重组被认为是重组质粒构建过程 的难点，因为未线性化的环状质粒之间发生同源重组的几率非常低 所以重组转移载体必需用特定的限制性内切酶进行线

7、性化处置.这种处置的目的是防止随机拔出重组时质粒在功能区断开，造成目的基因表达失活，让同源重组以指定的方式发生.表达载体主要分为以下几类：（1）胞内表达载体主要有 pHIL-D2、pA0815、 pPIC3K、 pPICZ、 pHWO10,pGAPZpGAPZa（Invitrogen）等.该类载体可以将目的基因表达在胞内，可以防止毕赤酵母的糖基化，主要适合于那些不能被糖基化相关基因 的表达；（2）分泌型表达载体主要有pPIC9、pHIL-S1、pPICZ%、pYAM75游,由于毕赤酵母自己的泌内源卵白非常少，将外源卵白分泌到胞外，非常有利于目的卵白质的纯化及积累.经常使用的分泌的信号序列主要是

8、由89个氨基酸组成的 交配因子（ -factor）的引导；（3）多拷贝拔出表达载体如pPIC9K,pPIC3.5K.在某些情况下，毕赤酵母中重组基因多拷贝整合可增加所需卵白的表达量.该载体均可用于在体内（pPIC3.5K, pPIC9K）或体外（pAO815）发生并分离多拷贝拔出，同时可检测增加重组基因的拷贝数是否增加卵白 表达量.体内整合可通过高遗传霉素抗性筛选可能的多拷贝拔出，而体外整合可通过连接发生外源基因的串连拔出在GS115中筛选His+Mut+转化子：用SalI或StuI线性化质 粒转化GS115后，年夜多在His4位点上发生重组，年夜大都转化子 是Mut+表型；然而由于质粒含有A

9、OX1基因序列，有可能在AOX1位点发生重组，破坏野生型AOX1基因，发生His+Muts转化子，则需要 在MW MMff板上检测可证实 His+ Mut+转化子.线性化酶切位点拔失事件GS115表型KM71表型SalI 或 StuI拔出his4His+Mut+His+Muts毕赤SacI拔出5AOX1His+Mut+His+Muts酵母表达经常BglII取代AOX1His+MutsHis+Muts(不推荐)使用培养基10XYNB(13.4%勺无氨基酸酵母氮源 ),134gYNB固体溶于1L蒸储水, 过滤灭菌,4 C保管.YPD完全培养基：酵母提取物10 g/L,卵白月东20 g/L,葡萄糖2

10、0g/L(固体培养基含1.5%琼脂).转化培养基 RDB每100mL加入山梨醇 18g(186 g/L), 琼脂糖 2g(20g/L)121c灭菌20分钟，然后待温度降至 60c以后在超净台 上加入 10X YNB 10mL(13.4 g/L),10 X葡萄糖 10mL(20 g/L),500 x 生物素 0.2mL(4X10-4g/L), 100XAA 1mL.混匀，倒平板(灭菌时只 加入80ml水即可).选择培养基 MD最小葡萄糖)：配100mL，向80mL水中加入琼脂糖 2g(20 g/L)121 C灭菌20分钟，待温度降至60c以后在超净台上加 入 10X YNB 10mL(13.4

11、g/L),10 X葡萄糖 10mL(20 g/L),500 x生物 素 0.2mL(4X10-4g/L).选择培养基MM最小甲醇)：配100mL，向90mL7k中加入琼脂糖2g(20 g/L) 121 C灭菌 20分钟，待温度降至 60c以后在超净台上加入 10X YNB 10mL(13.4 g/L),500 X 生物素 0.2mL(4 x 10 -4g/L),0.5mL 甲醇(0.5%).诱导表达培养基 BMGY配1L,酵母提取物 10 g/L,卵白月东20 g/L,3g/L K2HPO4,11.8g/L KH2PO4,力口水至 890mL,121C灭菌 20 分 钟，然后待温度降至60c以

12、后在超净台上加入 10X YNB100mL(13.4 g/L),500 X 生物素 1mL(4X 10-4g/L),甘油 10mL.诱导表达培养基BMMY酵母提取物10g/L,卵白月东20 g/L,3g/LK2HPO4,11.8g/L KH2PO4,力口水至 895mL,121C 灭菌 20 分 钟，然后待温度降至60c以后在超净台上加入100XYNB 100mL(13.4 g/L),500 X 生物素 1mL(4X 10-4g/L),甲醇 5mL.BMGY/BMMY酵母浸出物及卵白月东，可稳定分泌卵白，阻止或减少分 泌卵白的分解.如果目的卵白对中性 PH卵白酶敏感的话，可在无缓 冲培养基(MGY