流式细胞仪分析技术及应用讲义学习教案

1、会计学1流式细胞仪分析技术流式细胞仪分析技术(jsh)及应用讲义及应用讲义第一页，共77页。第一节 概述 一、工作原理(yunl) 二、散射光的测定 三、荧光测量 四、细胞分选原理(yunl)第二节 数据的显示与分析 一、参数(cnsh) 二、数据显示方式 三、设门分析技术第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求一、免疫检测样品制备二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色三、免疫胶乳(jior)颗粒的应用四、流式细胞免疫学技术的质量控制第1页/共76页第二页，共77页。思考题小结(xioji)第2页/共76页第三页，共77页。流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手

2、段的一项能快速(kui s)、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。 第3页/共76页第四页，共77页。 流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助(xizh)，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。 细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏(ln mn)、定量流式细胞术的特点流式细胞术的特点(tdin)第4页/共76页第五页，共77页。快速测量并可分类收集的高技术。第一节 概述(i sh)第5页/共76页第六页，共77页。第6页/共76页第七页，共77页。细胞组成细胞组成细胞功能细胞功能大小大小细胞表面

3、细胞表面/ /胞浆胞浆/ /核核-特异性抗原特异性抗原粒度粒度细胞活性细胞活性DNA, RNADNA, RNA含量含量胞内细胞因子胞内细胞因子蛋白质含量蛋白质含量激素结合位点激素结合位点钙离子钙离子, PH, PH值值, , 膜电位膜电位酶活性酶活性流式细胞(xbo)仪常检测的细胞(xbo)特性第7页/共76页第八页，共77页。采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞(xbo)悬液中单个细胞(xbo)的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。 一、工作(gngz

4、u)原理 第8页/共76页第九页，共77页。 （1） 液流系统(xtng) （2） 光学系统(xtng) （3） 数据处理系统(xtng)1.流式细胞仪的基本流式细胞仪的基本(jbn)结构：结构：第9页/共76页第十页，共77页。（1）液流系统(xtng)第10页/共76页第十一页，共77页。喷嘴FluorescencesignalsFocused laserbeam鞘液液流系统液流系统(xtng)示意图示意图第11页/共76页第十二页，共77页。FCM的液流系统（如何(rh)形成单个细胞流）样本(yngbn)管鞘液管第12页/共76页第十三页，共77页。n光电倍增管：光电倍增管：FS, SS

5、FS, SS（散射（散射光），光）， FL1, FL2, FL3, FL1, FL2, FL3, FL4FL4（荧光）（荧光）（2）光学系统第13页/共76页第十四页，共77页。FlowTipLaserSS and FLDetectorFS Detector光学系统示意图光学系统示意图第14页/共76页第十五页，共77页。（3）数据处理系统第15页/共76页第十六页，共77页。基本工作基本工作(gngzu)原理原理第16页/共76页第十七页，共77页。单细胞液柱已标记的单细胞悬液和鞘液硅化管流动室喷嘴荧光检测系统和散射光感受系统收集光信号荧光染料被激发发光光电倍增管脉冲信号计算机系统分析结果放

6、大垂直相交形成稳态水平激光与之基本(jbn)过程第17页/共76页第十八页，共77页。区别区别流式细胞仪流式细胞仪显微镜显微镜光源光源激光激光自然光、灯光自然光、灯光对象对象细胞、生物粒子细胞、生物粒子细胞、组织等细胞、组织等承载工具承载工具鞘液及流动室鞘液及流动室载玻片载玻片检测信号检测信号光学信号光学信号形态及染色形态及染色放大方式放大方式PMTPMT、放大电路、放大电路目镜目镜物镜、光学放大物镜、光学放大统计统计计算机，计算机，50005000人工，人工，200200结果结果多参数，综合分析多参数，综合分析简单，单参数简单，单参数流式细胞仪与显微镜的区别(qbi)第18页/共76页第十九

7、页，共77页。 细胞在液柱中与激光束相交时向周围360立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒(kl)折射等有关，主要分为前向散射光和侧向散射光。二、散射光的测定二、散射光的测定(cdng)第19页/共76页第二十页，共77页。第20页/共76页第二十一页，共77页。第21页/共76页第二十二页，共77页。FALS SensorLaser前向散射光示意图第22页/共76页第二十三页，共77页。侧向散射光（侧向散射光（side scatter, SSside scatter, SS）：激光束照射）：激光束照射(zhosh)(zhosh)细胞时，光以细胞时，光以9090角散射

8、的讯号，用于角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。检测细胞内部结构属性。第23页/共76页第二十四页，共77页。FALS Sensor90LS SensorLaser侧向(c xin)散射光示意图第24页/共76页第二十五页，共77页。胞分类的基本胞分类的基本原理，但不能原理，但不能分析表面分子。分析表面分子。淋巴细胞单核细胞中性(zhngxng)粒细胞光散射测量最有效(yuxio)用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群 第25页/共76页第二十六页，共77页。三、荧光(ynggung)测量第26页/共76页第二十七页，共77页。激发(jf)波长(EXCITING)发射波长(EMISSION)第

9、27页/共76页第二十八页，共77页。第28页/共76页第二十九页，共77页。荧光(ynggung)补偿第29页/共76页第三十页，共77页。 通过流式细胞(xbo)仪进行细胞(xbo)分选主要是在对具有某种特征的细胞(xbo)需进一步培养和研究时进行的。四、细胞四、细胞(xbo)分选原理分选原理第30页/共76页第三十一页，共77页。细胞悬液形成液流柱流动室振动液流断裂成液滴空白液滴含细胞的液滴弃去偏转落入收集器压电晶体(jngt)产生(chnshng)机械振动不充电(chng din)充电（一）分选基本原理第31页/共76页第三十二页，共77页。n分选得率：从一群体细胞悬液分选得率：从一群

10、体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。得率。与分选速度成反比。（二）分选的技术(jsh)要求第32页/共76页第三十三页，共77页。第二节第二节 数据数据(shj)(shj)的显示与分析的显示与分析第33页/共76页第三十四页，共77页。一、一、 参数参数(cnsh)第34页/共76页第三十五页，共77页。n直分析(fnx)方图设门分析(fnx):REGION和GATE设置二、数据显示方式二、数据显示方式第35页/共76页第三十六页，共77页。（一）单参数(cnsh)直方图第36页/共76页第三

11、十七页，共77页。单参数(cnsh)直方图细胞相对数量信道(channel )第37页/共76页第三十八页，共77页。荧光强度荧光强度(qingd)(qingd)的颗粒的颗粒数量的多少。数量的多少。（二）双参数(cnsh)直方图第38页/共76页第三十九页，共77页。1.双参数(cnsh)直方图点图绿色荧光强度红色荧光强度第39页/共76页第四十页，共77页。双参数(cnsh)直方图点图第40页/共76页第四十一页，共77页。2. 二维等高图第41页/共76页第四十二页，共77页。二维等高图第42页/共76页第四十三页，共77页。3. 假三维等高图第43页/共76页第四十四页，共77页。（三）

12、三参数(cnsh)直方图第44页/共76页第四十五页，共77页。（四）流式细胞仪的多参数(cnsh)分析第45页/共76页第四十六页，共77页。根据门的形状又分为了线性门、矩形(jxng)门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。 三、设门分析(fnx)技术第46页/共76页第四十七页，共77页。A 淋巴细胞B 单核细胞C 中性(zhngxng)粒细胞A、B、C均为任意(rny)门第47页/共76页第四十八页，共77页。线性门第48页/共76页第四十九页，共77页。第49页/共76页第五十页，共77页。D1 CD4+/CD3-D2 CD4+/CD3+D3 CD4- /CD3-D4 CD4- /

13、CD3+如十字门分析时，起就可以(ky)由四个区域构成，即G=D1+D2+D3+D4。 第50页/共76页第五十一页，共77页。第51页/共76页第五十二页，共77页。网过滤网过滤单细胞悬液一、免疫检测样品一、免疫检测样品(yngpn)制备制备第52页/共76页第五十三页，共77页。第53页/共76页第五十四页，共77页。二、常用二、常用(chn yn)的荧光染料与标记染色的荧光染料与标记染色第54页/共76页第五十五页，共77页。FITCTexas redPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光(jgung)细胞(xbo)悬液异硫氰酸荧光(ynggung)素得州红能量传递复合

14、染料藻胆蛋白类（一）几种常见的荧光染料第55页/共76页第五十六页，共77页。名称名称染料染料激发激发波长波长荧光颜荧光颜色色溶解性溶解性对对PHPH敏感敏感性性特点特点异硫氰酸荧异硫氰酸荧光素光素FITCFITC488488绿绿 525525易易敏感敏感易溶于水，与抗体结易溶于水，与抗体结合不影响特异性合不影响特异性得州红得州红Texas Texas redred568568红红 615615不易不易不敏感不敏感稳定，偶联后量子产稳定，偶联后量子产额低额低藻红蛋白藻红蛋白PEPE488488橙橙575575易易不敏感不敏感具较多发光基团，消具较多发光基团，消光系数和量子产额高光系数和量子产额

15、高藻青蛋白藻青蛋白PCPC488488别藻青蛋白别藻青蛋白APCAPC633633红红670670能量传递复能量传递复合染料合染料PEcy5PEcy5488488红红670670易易不敏感不敏感减少交叉，成本高减少交叉，成本高常用的几类荧光(ynggung)染料第56页/共76页第五十七页，共77页。信号。信号。能量传递复合(fh)染料第57页/共76页第五十八页，共77页。PECY5CY5CY5488nm575nm670nm红色(hngs)荧光花青(hu qn)苷5藻红蛋白(dnbi)能量传递复合染料机制第58页/共76页第五十九页，共77页。（二）免疫荧光标记（二）免疫荧光标记(bioj)

16、第59页/共76页第六十页，共77页。三、免疫胶乳颗粒(kl)技术的应用第60页/共76页第六十一页，共77页。微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色（固相芯片是用探针在芯片上的坐标位置给基因(jyn)的特异性编码；而液相芯片则是用颜色来编码）第61页/共76页第六十二页，共77页。第62页/共76页第六十三页，共77页。通过对标记不同荧光素分子的检测，实现(shxin)FCM对可溶性物质的定量分析第63页/共76页第六十四页，共77页。（一）单细胞悬液制备（一）单细胞悬液制备(zhbi)(zhbi)的的质控质控第64页/共76页第六十五页，共77页。（二）免疫荧光染色（二）免疫荧光染色(r

17、ns)(rns)的质控的质控第65页/共76页第六十六页，共77页。n绝对计数校准绝对计数校准: : 保证计数的保证计数的准确性。准确性。（三）仪器（三）仪器(yq)(yq)操作的质操作的质控控第66页/共76页第六十七页，共77页。（四）免疫检测的质控（四）免疫检测的质控第67页/共76页第六十八页，共77页。第68页/共76页第六十九页，共77页。一、淋巴细胞及其亚群的分析一、淋巴细胞及其亚群的分析(fnx)(fnx)第69页/共76页第七十页，共77页。三、淋巴造血三、淋巴造血(zo xu)系统及白血病免疫分系统及白血病免疫分型型对淋巴瘤和白血病进行多色免疫(miny)分型用于选择化疗方

18、案、判断预后及检出微小残留病变第70页/共76页第七十一页，共77页。CD4+Th细胞(xbo)、CD4+/CD8+比例MDR(+)表示(biosh)对化疗药物耐药五、五、AIDS病检测中的应用病检测中的应用第71页/共76页第七十二页，共77页。HLA-B27可出现(chxin)在58%97%的强直性脊椎炎(As) 患者第72页/共76页第七十三页，共77页。FCXMFCXM）和群体反应性抗体）和群体反应性抗体（Panel reactive antibody, Panel reactive antibody, PRAPRA）检测。）检测。第73页/共76页第七十四页，共77页。思考题流式细胞仪的分析(fnx)检测原理是什么？流式细胞仪分析(fnx)中前向散射光、侧向散射光和荧光的检测意义。何谓荧光补偿？何谓“液相芯片”技术？细胞分选的基本原理。FCM分析(fnx)中有哪些数据显示方式，如何解读结果及其设门分析(fnx)的意义？如何进行FCM分析(fnx)检测样品的制备？流式细胞分析(fnx)前如何验证仪器工作状态，采用何种校正物？流式细