蛋白质磷酸化ppt课件

1、蛋白质磷酸化在生物学蛋白质磷酸化在生物学中的作用中的作用张严2019-1-151. 定义2. 分类3. 功能4. 检测方法5. 实验方案设计及结果定义 定义：蛋白质的磷酸化反应是指通过酶促反应把磷酸基团从一个化合物转移到另一个化合物上的过程，是生物体内存在的一种普遍的调节方式，在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位。逆转过程是由蛋白质磷酸酶催化的，称为蛋白质脱磷酸化。 蛋白质的磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程。蛋白质磷酸化的作用蛋白质磷酸化的作用(1) 在胞内介导胞外信号时具有专一应答特点。与信号传递有关的蛋白激酶类主要受控于胞内信使

2、，如cAMP，Ca2+，DAG二酰甘油，diacyl glycerol等，这种共价修饰调节方式显然比变构调节较少受胞内代谢产物的影响。(2)蛋白质的磷酸化与脱磷酸化控制了细胞内已有的酶活性。与酶的重新合成及分解相比，这种方式能对外界刺激做出更迅速的反应。(3)对外界信号具有级联放大作用；(4)蛋白质的磷酸化与脱磷酸化保证了细胞对外界信号的持续反应。被磷酸化的主要氨基酸残基：丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。蛋白激酶的种类蛋白激酶的种类 根据底物蛋白质被磷酸化的氨基酸残基的种类可分为三大类：（1为丝氨酸/苏氨酸型。这类蛋白激酶使底物蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化；（2为酪氨酸型。被磷酸化的是底物的酪氨酸

3、残基；（3是双重底物特异性蛋白激酶dual-specificity protein kinase），既可使丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化又可使酪氨酸残基磷酸化。 根据是否有调节物来分又可分成两大类信使依赖性蛋白质激酶信使依赖性蛋白质激酶非信使依赖型蛋白激酶非信使依赖型蛋白激酶cAMP 依赖性蛋白激酶（PKA）酪蛋白激酶（CK，）cGMP依赖性蛋白激酶（PKA）组蛋白激酶Ca2+、CaM 依赖性蛋白激酶糖原合成酶激酶（GSK）视紫红质蛋白激酶肾上腺素受体蛋白激酶受受CAMPCAMP调控的调控的A A激酶激酶1. PKA全酶由4个亚基组成(R2C2包括两个相同的调节亚基R和两个相同的催化亚基C）。2.

4、C亚基具有催化活性，R亚基具有调节功能，有两个cAMP结合位点。R亚基对C亚基具有抑制作用，所以，R和C聚合后的全酶R2C2无催化活性。R亚基与cAMP的结合导致C亚基解离并表现出催化活性。激素与其受体在肌肉细胞外表面相结合，诱发细胞质cAMP的合成并活化A激酶，再将活化磷酸基团传递给无活性的磷酸化酶激酶，活化糖原磷酸化酶，最终将糖原磷酸化，进入糖酵解并提供ATP。C C激酶与激酶与PIP2PIP2、IP3IP3和和DAGDAG蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是G蛋白偶联受体系统中的效应物，在非活性状态下是水溶性的，蛋白激酶C的激活是脂依赖性的，需要膜脂DAG 的存在，同

5、时又是Ca2+依赖性的，当DAG在质膜中出现时，胞质溶胶中的蛋白激酶C 被结合到质膜上，然后在Ca2+的作用下被激活。PKCPKC的作用的作用在肝细胞中， 蛋白激酶C 与蛋白激酶A 协作磷酸化糖原合成酶，抑制葡萄糖聚合酶glucose-polymerizing enzyme的活性，促进糖原代谢。对糖代谢的控制PKCPKC的作用的作用参与基因表达调控参与基因表达调控PKC可通过两种途径参与基因表达的控制。一种途径是蛋白激酶激活一个磷酸化的级联系统，使MAP蛋白激酶磷酸化，进而将基因调节蛋白Elk-1磷酸化，使之激活。激活的Elk-1与血清反应元件SRE和血清反应因子SRF结合共同调节基因表达。另

6、一种途径是蛋白激酶磷酸化并激活抑制蛋白I-B，释放基因调节蛋白NF-B，使之进入细胞核激活特定基因的转录。CAMCAM激酶激酶钙调蛋白激酶CaM-kinase是一类丝氨酸/苏氨酸激酶。一个钙调蛋白可以结合4个Ca2+。Ca2+同钙调蛋白结合形成钙-钙调蛋白复合物calcium-calmodulin complex），就会引起钙调蛋白构型的变化，增强了钙调蛋白与许多效应物结合的亲和力。在不同的细胞中，Ca2+-钙调蛋白复合物可以同CaM-蛋白激酶、cAMP磷酸二酯酶、以及质膜中的Ca2+运输蛋白结合， 将它们激活，进行信号的放大。MAPMAP激酶激酶MAP激酶mitogen-activated

7、protein是存在于真核生物中的丝氨酸/苏氨酸激酶，是传递外界刺激的信号分子之一。MAPK的活化经历了以下的级联反应：MAP3KMAP2KMAPK转录因子激活。与细胞增殖、分化、基因表达、凋亡等相关。哺乳动物分为4个MAPK 家族分子：ERK1/2、ERK5、JNK、P38。酪氨酸蛋白激酶酪氨酸蛋白激酶 蛋白酪氨酸激酶protein tyrosine kinase,PTK是一类催化ATP上-磷酸转移到蛋白酪氨酸残基上的激酶，能催化多种底物蛋白质酪氨酸残基磷酸化，在细胞生长、增殖、分化中具有重要作用。具有受体功能的酪氨酸蛋白激酶 (receptor protein tyrosine kinas

8、e, RPTK)。包括三个结构域：胞外的配体结合区，细胞内部具有酪氨酸蛋白激酶活性的区域和连接这两个区域的跨膜结构。蛋白磷酸化水平的检测1. Western blot 2. 32 P放射性标记法3. 磷酸化蛋白质的荧光染料 Pro2Q Diamond4. 液相色谱法GSK-3糖原合成酶激酶-3(GSK-3)是一种丝苏氨酸蛋白激酶，其广泛存在于各种细胞中，参与多种信号转导通路调节，在胚胎发育、细胞分化、肿瘤形成等多方面发挥重要作用。PI3K/Akt/GSK-3 可以调控神经细胞的生长和发育，GSK-3抑制剂则被看作是糖尿病和阿尔茨海默氏症的可能治疗药物。实验设计细胞裂解免疫沉淀p-AKTGSK-3与p-AKT 激酶反应WB检测p-GSK-3 的量GSK-3 蛋白的荧光标记Elution buffer洗脱p-GSK-3蛋白MST 检测结果GSK-3 蛋白与phospho-GSK-3 的western 检测。GSK-3 蛋白与phospho-GSK-3 的热泳迁移率曲线图。GSK-3 和p-GSK-3 按1:2, 1:4, 1:8 稀释，在20, 40, 80%激发能量的热迁移率比较。下一步工作通过MST实验，比较磷酸化与非磷酸化的GSK-3 与AKT 之间的亲和力大小。在有无AT