酶类实验测定方法

1、实 验 方 法李菁华2016.6一叶片相对含水量（RWC）采用烘干称重法测定将叶片称鲜重（Fw）等量两份，然后一份浸入去离子水8h后称其饱和鲜重（Tw），将另一份材料于105烘箱中杀青30min，再在80下烘干48h至恒重记为干重（Dw），按如下公式计算 （Fw-Dw） 叶片相对含水量（%）=×100% （Tw-Dw）邹琦.植物生理学实验指导M .北京：中国农业出版社，2000二根系活力采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法测定一、原理氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化电位为80mV的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲腙，生成的三苯甲腙比较稳定，不会

2、被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛地用作酶试验的氢受体，植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。二、试剂 1）乙酸乙酯（分析纯）2）连二亚硫酸钠（Na2S2O4），分析纯，粉末，俗称保险粉。3）0.4%TTC（又名 红四氮唑、2,3,5-氯化三苯基四氮唑）溶液：准确称取TTC 0.4g，溶于少量水中，定容到100ml。4）磷酸缓冲液（1/15mol·L-1，pH7.0）:A液：称取纯Na2HPO4·2H2O 11.876g溶于蒸馏水中成1000ml。B液

3、：称取纯KH2PO4 9.078g溶于蒸馏水中成1000ml。用时取A液60ml，B液40ml混合即成。5）1mol·L-1硫酸：用量筒取比重1.84的浓硫酸5.5ml，边搅拌边加入盛有100ml蒸馏水的烧杯中，冷却定容至100ml。三、实验步骤 1）TTC标准曲线的制作：取0.4%TTC溶液0.2ml放入10ml容量瓶中，加少许Na2S2O4粉摇匀后立即产生红色的TTF。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTF25g、50g、100g、150g、200g的

4、标准比色系列，以乙酸乙酯作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。 2）取出大豆根系洗净，用滤纸吸干水分，称取1cm长的根尖样品0.2g，放入10ml烧杯中，加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液各5ml，把根充分浸没在溶液内，在37下暗保温13h（2h），此后加入1mol·L-1硫酸2ml，以停止反应。（与此同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品，10min后其他操作同上）。3）把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯3-4ml和少量石英砂一起在研钵内磨碎，以提出TTF。红色提取液移入试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤2-3次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光光度计在波

5、长485nm下比色，以空白实验作参比读出吸光度，查标准曲线，即可求出四氮唑还原量四、结果计算 四氮唑还原强度（mg·g-1根鲜重h-1）四氮唑还原量（mg）/根重（g）×时间（h）王晶英，敖红，张杰，曲桂琴.植物生理生化实验技术与原理M .哈尔滨：东北林业大学出版社，2003.7三氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物岐化酶（SOD）一、原理SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD：MnSOD和Cu.ZnSOD，它们都催化下列反应：由于超氧自由基（O2.）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能

6、产生超氧自由基负离子O2.，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲臜（ 黄 色 ），继而还原生成二甲臜，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲臜 生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比。反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低。二、试剂1. 0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12

7、H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。分别用蒸馏水定容到1000ml。0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。2. 14.5mM甲硫氨酸溶液：称取1.0818g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至500ml。3. 3mM EDTA-Na2溶液：称取0.1117g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。4. 60M核黄素溶液：称取0.0023g 核

8、黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。5. 2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：称取0.092g NBT用PBS定容至50ml，避光保存。三、实验步骤1. 酶液提取 称取0.5g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入10ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4、12000g下离心20min，上清夜即为SOD粗提液。2. 酶活性测定（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取配好的Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液6ml， NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后充分摇匀；（2）分别取2.9ml

9、反应混合液和0.1ml（可视情况调整）酶液于指形管中此即反应管；同时做两支对照管，其中1支试管加2.9ml反应混合液和0.1ml PBS（不加酶液）作为最大光还原管，另1支加2.9ml反应混合液和0.1ml PBS同时用锡箔纸包好遮光用于测定时调零。（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照25下反应20min；（4）反应结束后以不照光的对照管调零，分别测定各管在560nm下的吸光度（OD560）3. 计算结果已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50为一个酶活单位（U），按下式计算活性n=(ODmax-OD560)/ODmax/2SOD总活性 ( Ack-AE )×V/（

10、1/2Ack×W×Vt） SOD比活力SOD总活性/蛋白质含量SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml）；Vt为测定时的酶液用量（ml）；W为样品鲜重（g）；蛋白质含量单位为mg/g。四、注意事项1. 酶液提取须在4下进行，提取后立即进行测定，冰箱中放几小时活性也会下降；2. 植物中的酚类物质对测定有干扰，制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或pvpp等，尽可能除去植物组织中的酚类等次生物质。3. NBT反应液配好后过滤除去不溶物立即使用，若置于冰箱中要

11、避光保存，充分摇匀然后使用。4. 加反应液时最好在暗光下进行；5. 核黄素产生O2.，NBT还原为蓝甲臜都与光照密切相关，照光强度和时间要严格控制。光照培养箱内壁裱糊锡箔纸，使箱内均匀光照约达40molm-2s-1，同时使照光时间一样，选择试管尽量一致，照光结束后测一个拿一个（最好晚上做）（温度高时照光时间缩短，温度低时延长）；6. 测定活性时加入的酶量，以能抑制反应的50为佳。（一个酶单位相当于引起反应液达到半抑制时酶的用量，即以能抑制反应50的酶量为一个SOD酶活性单位。）（反应液中加酶液与PBS调零差异不大，反应液调零与其它两个则有一定差异。李合生方法：2支CK管均以缓冲液代替酶液。）五

12、、参考文献王晶英，敖红，张杰，曲桂琴.植物生理生化实验技术与原理M .哈尔滨：东北林业大学出版社，2003.7李合生.植物生理生化实验原理和技术M.高等教育出版社，2000：267268四愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）一、原理在过氧化物酶催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470nm处有最大光吸收，故可通过测470nm下吸光值变化测定过氧化物酶活性。二、试剂1. 0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4&

13、#183;2H2O（分子量156.01）31.2g。分别用蒸馏水定容到1000ml。0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)的配制：分别取A母液(Na2HPO4 )12.3ml和B母液(NaH2PO4 ) 87.7ml混匀即为100mlPBS(0.2M，pH6.0)。2. 30H2O23. 愈创木酚（2-甲氧基酚）三、步骤1. 酶液提取 称取0.5g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入10ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4、12000g下离心20min，上清夜即为酶粗提液。2. 酶活性测定（1）反应混合液

14、的配制：取50mlPBS（pH6.0，0.2M）缓冲液于烧杯中，加入28l愈创木酚（2-甲氧基酚）于磁力搅拌器上加热搅拌，直至溶解，待溶液冷却后加入19l 30的H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。（2）酶活性测定：取3ml反应液并加入40l酶液后测定OD470值每30s的变化，记4次数。以PBS代替酶液为对照调零，3. 计算结果以每min OD值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u）。，按下式计算活性POD活性=（A470×Vt）/（W×Vs×0.01×t） (u/g FW)A470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min

15、)；Vt为提取酶液总体积（ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml）。四、注意事项1. 反应液配制时由于愈创木酚难溶，应加热一段时间。加入H2O2前注意溶液冷却，防止H2O2的挥发。2. 由于该反应迅速，加入酶液要立即进行吸光值的测定。五、参考文献李合生.植物生理生化实验原理和技术M.高等教育出版社，2000：267268五过氧化氢酶（CAT）的测定一、原理过氧化氢酶(Catalase,CAT),是一种广泛存在于生物组织中的氧化还原酶，它能催化H2O2分解为水和氧气,清除组织中的过氧化氢。H2O2在240nm处有一个吸收高峰,其吸光度与H2O2的含量成正比,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液吸

16、光度(A240)随反应时间而降低。单位时间内吸收的差值就是过氧化氢酶的活性。二、试剂1 0.15mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）： 取A母液(Na2HPO4) 228.75 ml 和B母液(NaH2PO4) 146.25 ml混合后用蒸馏水定容至500ml。2. 30H2O2三、步骤1. 酶液提取 称取0.5g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入10ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4、12000g下离心20min，上清液即为CAT粗提液。2 酶活性测定（1）反应混合液的配制：取100ml PBS（0.1

17、5M，pH7.0），加入0.05ml 30%的H2O2摇匀即可。（2）取2.9 ml反应液加入0.1ml酶液，以PBS为对照调零，测定OD240值每30s的变化，记4次数。3 结果计算：酶活性计算：以每min OD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。CAT=A240×Vt /（W×Vs×0.01×t） (u/g FW)A240：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml）。四、注意事项H2O2易分解，应现用现配。五、参考文献李合生.植物生理生化实验原理和技术M.高等

18、教育出版社，2000：267268六抗坏血酸过氧化物酶（APX）的测定一、原理AsA-POD是叶绿体内专一的清除H2O2的酶，催化抗坏血酸(AsA)与H2O2反应，使AsA氧化成单脱氢抗坏血酸（MDAsA）。随着AsA被氧化，溶液的OD290值下降，根据单位时间内OD290的减少值，计算AsA-POD活性。AsA氧化量按消光系数2.8/(mmol/L)·cm（2.8mM-1.cm-1）计算，酶活性用µmol AsA·g/FW·h 表示。二、试剂（按50个样计算）：1. 0.05 mol/L 磷酸缓冲液（pH7.0）的配制：母液的配制方法同前取A母液Na2

19、HPO4 61.0ml，加入B母液NaH2PO4 39.0ml，用去离子水定容到400ml。2. 0.1 mM EDTA-Na2：取0.0093g EDTA-Na2用PBS（pH7.0）缓冲液定容到250ml（372.24 g/M×0.1mM×500ml=0.01861 g）；3. 5 mM AsA：取0.044g抗坏血酸用PBS（pH7.0）缓冲液缓冲液定容到50ml（现用现配）；4. 20 mM H2O2：取0.2ml30% H2O2用去离子水稀释到100ml。三、步骤1. 酶液提取方法同SOD.2. 酶活性的测定以3 ml体系测定，则取0.10 ml 酶液（可视情况调

20、整），加入2.60 ml 含0.1mM EDTA-Na2的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.15ml 5 mM的AsA，最后加入0.15 ml 20mM H2O2，立即在20下测定OD290值每30s的变化（测定时间内变化大可测定的时间短点，否则长点），共计四次。3. 酶活性计算以1min内A290变0.01定义为一个酶活性单位u，酶活性以u/g(FW)表示APX活性（u/g）= A290.VT/0.01VS.t.WA290表示在290nm处吸光值的变化VT 提取液总体积；VS 酶液的体积；W叶片的鲜重 ；t反应时间VC-POD活性（umolVC.g-1FW.h-1）=（A

21、*Vt*v*60*1000)/(FW*Vs*2.8*t) 式中：Vt：酶液总体积（ml）；FW;样品鲜重（g）；Vs：测定时取酶液的量（ml）；v：反应液体积（ml）；A;A290 0-30s的差值；t：反应时间min；2.8：VC的毫摩尔消光系数（2.8mM-1.cm-1）四、注意事项加入H2O2后应混匀反应液然后快速进行比色测定。五、参考文献高俊凤.植物生理学实验指导M.高等教育出版社，2006：221223计算公式：    OD/t×Vr×VT     

22、60;A×d×Vt×W OD为反应时间内吸光度的变化（40秒吸光度0秒吸光度）；t为反应时间（40秒）；Vr为反应液体积（2mL）；VT提取液体积（1.6mL）；A为消光系数（2.8mM-1.cm-1）；d为比色杯厚度（1cm）；Vt测定液体积（0.1mL）；W为样品鲜重（0.2g）。七羟胺氧化法测定超氧阴离子产生速率一、原理O2-与羟胺反应产生NO2，NO2在对氨基苯磺酸和-萘胺作用下，生成粉红色的偶氮染料，该染料在530nm处有最大光吸收，根据OD530可计算出样品中的O2-的含量。二、试剂1. 0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A

23、母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。分别用蒸馏水定容到1000ml。0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。2. 10mM盐酸羟胺：称取0.05g盐酸羟胺用蒸馏水定容至100ml。3. 17mM对氨基苯磺酸(磺胺酸、4-苯胺磺酸) C6H7NO3S，173.20：称取0.2944g对氨

24、基苯磺酸用冰醋酸溶液（冰醋酸：水=1：3）定容至100ml4. 7mM -萘胺：称取0.1002g萘胺用冰醋酸溶液（冰醋酸：水=3：1）定容至100ml。5. 亚硝酸钠三、步骤1. 酶液提取 称取0.5g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入10ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4、12000g下离心20min，上清液即为酶粗提液。2. 亚硝酸根标准曲线的制作2.1系列浓度NaNO2溶液的配制取50nmol·ml1NaNO2母液，分别稀释成0、10、20、30、40和50、nmol·ml1

25、的标准稀释液。2.2取7支试管，编06号，分别加10、15、20、30、40、50、nmol·ml1NaNO2标准稀释液1ml，0号管加蒸馏水1ml，然后各管再加50mmol·L1磷酸缓冲液1ml，17 mmol·L1对氨基苯磺酸1ml和7 mmol·L1-萘胺1ml，置于25显色20min后，以0号管作空白对照，在530nm波长处测定吸光度（A）值。方法二：标准曲线的制备：取亚硝酸钠6.9 g定容至1000ml，为0.1 mol/L亚硝酸钠溶液，分别取2.5、5、7.5、10、12.5 ml定容至50 ml，制成5、10、15、20、25 mmol/L

26、的标准溶液。取各标准溶液各1 mL，重复以上测定的步骤，于波长530 nm测定OD值，以OD值为纵坐标，亚硝酸钠浓度（mmol/L）为横坐标绘制标准曲线。高俊凤：称取NaNO2（AR级）0.1g蒸馏水定容至100ml，摇匀后取5ml用蒸馏水定容至1000ml即为5mg/l的标准液。2.3 标准曲线绘制以16号管亚硝酸根（NO2）浓度为横坐标，吸光度值作纵坐标，绘制标准曲线。3. O2-产生速率测定（1）取0.5ml提取液中加入0.5ml PBS(0.05M，pH7.8)，1ml 10mM盐酸羟胺溶液后摇匀，同时做一对照管以PBS代替样品提取液；（2）在25下保温1小时，若测定叶片保温后需加入2

27、ml乙醚萃取Chl；（3）依次先加入1ml 17mM对氨基苯磺酸，再加入1ml 7mM-萘胺，混合后涡旋；（4）在25下保温20min后在3000g离心3min，（或置于冰箱待测）；（5）以对照管调零,取粉红色水相液测定OD530。4. 计算结果根据测得的OD530，查NO2-标准曲线得到NO2-，依照羟胺与O2-的反应式：NH2OH2O2-H+NO2-H2O2 H2O 计算O2-，即NO2-×2=O2-。再根据样品与羟胺反应的时间和样品中的蛋白质含量，求得O2-产生速率（nmol min-1mg-1蛋白，也可用nmol min-1g-1鲜重）。根据所测得的A530值，从标准曲线上查

28、得样品中NO2浓度，按公式（1）即可计算出样品中NO2浓度。然后依据羟胺与O2的上述反应，从NO2对O2进行化学计量，按公式（2）计算，即将按公式（1）计算得到的NO2浓度乘2，得O2浓度。也可根据被测样品与羟胺反应的时间和样品中蛋白质含量，按公式（3）求得O2的生产率。 从标准曲线查得NO2（nmol）×提取液总量（ml）NO2含量（nmol·g1Fw）=（1） 样品重（g）×测定时提取液用量（ml） 将所得NO2含量代入下式计算，即求出O2含量。O2含量= NO2（nmol·g1Fw）×2 （2）将公式（2）所得的O2浓度及样品中蛋白质含量

29、，依下式计算出O2产生速率。 O2（nmol）O2产生速率（nmol·mg1蛋白·min1）= （3） 蛋白质（mg）× 反应时间（min） 四、注意事项1. 样品中若含有大量叶绿素将干扰测定，可在样品与羟胺温浴后，加入等体积的乙醚萃取叶绿素，再加入对氨基苯磺酸和-萘胺作NO2-的显色反应；2. 应用羟胺反应来检测生物材料的含量，必须严格控制反应系统的pH（8.0，并尽可能降低反应液中的溶解氧和Fe的含量。因为羟胺自动氧化随反应系统的pH值升高而加强，同时随反应液的溶解氧和Fe含量的增加而加强。3. 加样的顺序不能颠倒，25是它的反应温度。五、参考文献王爱国，罗广

30、华植物的超氧物自由基与羟胺的反应J植物生理学通讯，1990，(6)：55-57高俊凤.植物生理学实验指导M.高等教育出版社，2006：221223八考马斯亮蓝G-250染色法测定可溶性蛋白质含量一、原理考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465 nm，后者在595 nm。在一定蛋白质浓度范围内（1-1000 mg），蛋白质与色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。二、试剂1. 0.

31、05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。分别用蒸馏水定容到1000ml。0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。2. 标准蛋白质溶液：称取0.01g牛血清蛋白，溶于蒸馏水并定容至10ml，制成1000g/ml的原液（必须是牛血清蛋白向水中溶

32、解，不能颠倒）。3. 考马斯亮蓝G-250蛋白试剂：称取0.1g考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 95乙醇中，加入100 ml 85（W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容到1L。在黑暗中静置2小时后用漏斗过滤并贮于棕色瓶中，常温下可在暗中保存一个月。4. 95乙醇5. 85磷酸三、步骤1. 标准曲线制作（蛋白质含量为0100ug/ml）取6支具塞试管（10ml），编号后，按下表加入试剂。管号 1 2 3 4 5 61000ug/ml标准蛋白液：ml 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1蒸馏水：ml 1.00 0.98 0.96 0.94 0.92 0.90G-250试剂：ml 5 5

33、 5 5 5 5蛋白质含量：g 0 20 40 60 80 100A595nm盖上塞子，将各管中溶液纵向倒置混合，摇匀。放置5min后在595nm波长下比色测定（比色应在1h内完成）。记录各管测定的OD595 nm 光密度值，并以牛血清蛋白含量（ug）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线（或者计算回归方程）。2. 酶液提取 称取0.5g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入10ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4、12000g下离心20min，上清液即为蛋白粗提液。3. 酶活性测定取1ml酶液，加入5ml

34、考马斯亮蓝溶液，摇匀，反应2min后测OD595。3. 计算结果蛋白质含量（mg/g）=（查得的蛋白质含量/ug×提取液总体积/ml）/（样品鲜重/g×测定时所用提取液体积/ml）Protein content(mg/g)=(C/ug×VT/ml)/(W/g×Vs/ml×1000)C为可溶性蛋白质含量（mg/g ），VT为提取液总体积（ml）；Vs为测定时所用提取液体积（ml）；W为样品鲜重（g）。四、注意事项1.制作通过原点的标准曲线，以含0g蛋白质液调零。2.还原物质，其他酚类物质及柠檬酸对此反应有影响。3.此方法反应十分迅速，2分钟即达到

35、平衡，其结合物在室温下1小时内保持稳定。五、参考文献邹琦.植物生理学实验指导M .北京：中国农业出版社，2000九硫代巴比妥酸（TBA）法测定丙二醛（MDA）含量一、原理MDA在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸（TBA）反应，形成在532nm波长处有最大光吸收的有色三甲基复合物。二、试剂1.10%的三氯乙酸（TCA）溶液：称取10g三氯乙酸用少量蒸馏水溶解后定容于100ml容量瓶中；20.6%（w/v）硫代巴比妥酸（TBA）溶液：称取0.6g硫代巴比妥酸加少量1mol/LNAOH（0.6g-15ml）溶解或磁力搅拌器微热，再用10%三氯乙酸溶液溶解后定容于100ml容量瓶中。三、步骤1. 取0.

36、5g样品（叶片或根系）剪碎放入研钵中，加入10ml磷酸缓冲液 (0.05mM PBS,pH7.8)(或10%TCA作为提取液)研磨成匀浆后转入离心管中在6000r/min下离心20min；2. 取上清液1ml于离心管中，加入2ml 0.6%TBA（硫代巴比妥酸）混和后在100沸水浴中煮15min，用冷水迅速冷却后在4000 r/min下离心20min；3. 取上清液在450nm、532nm、600nm下测OD值（用不加上清液加1ml去离子水其余步骤相同取得的溶液调零）；4. 计算组织中MDA含量：反应混合液MDA浓度CMDA(mol/L)=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450

37、反应液体积（ml） CMDA × 1000 提取液中MDA浓度（mol·ml1）= 测定时提取液用量（ml） 提取液中MDA浓度（mol·ml1）×提取液总量（ml） MDA含量（mol·g1 Fw）= 植物组织鲜重（g）四、注意事项煮沸后要再进行一次离心五、参考文献中国科学院上海植物生理研究所，上海市植物生理学会. 现代植物生理学实验指南M. 北京：科学出版社， 1999. 127十蒽酮法测定可溶性糖含量一、原理在作物的碳素营养中，作为营养物质主要是指可溶性糖和淀粉。它们在营养中的作用主要有:合成纤维素组成细胞壁；转化并组成其他有机物如核苷酸

38、、核酸等；分解产物是其他许多有机物合成的原料，如糖在呼吸过程中形成的有机酸，可作为NH 3的受体而转化为氨基酸；糖类作为呼吸基质，为作物的各种合成过程和各种生命活动提供了所需的能量。由于碳水化合物具有这些重要的作用，所以是营养中最基本的物质，也是需要量最多的一类。原理：糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量测定。该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖含量，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等(因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解

39、成单糖而发生反应)，所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。 糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为620 nm

40、，故在此波长下进行比色。二、试剂1. 葡萄糖标准溶液( 100 g/mL ):准确称取 100mg 分析纯无水葡萄糖，溶于蒸馏水并定容至100mL，使用时再稀释 10 倍( 100 g/mL )。 2 .蒽酮试剂:称取1.0g 蒽酮，溶于 80% 浓硫酸(将 98% 浓硫酸稀释，把浓硫酸缓缓加入到蒸馏水中) 1000mL中，冷却至室温，贮于具塞棕色瓶内，冰箱保存，可使用2-3周。三、步骤1、 样品中可溶性糖的提取称取剪碎混匀的新鲜样品0.5-1.0g (或干样粉末 5-100mg )，放入大试管中，加入15mL蒸馏水，在沸水浴中煮沸20min ，取出冷却，过滤入100mL容量瓶中，用蒸馏水冲洗

41、残渣数次，定容至刻度。2. 标准曲线制作取6支大试管，从1-6分别编号，按下表加入各试剂。 蒽酮法测可溶性糖制作标准曲线的试剂量 。管号 1 2 3 4 5 6100 g/ml葡萄糖标准溶液:ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0蒸馏水：ml 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0蒽酮试剂：ml 5 5 5 5 5 5葡萄糖含量：g 0 20 40 60 80 100A620nm将各管快速摇动混匀后，在沸水浴中煮 10min ，取出冷却，在620nm波长下，用空白调零测定光密度，以光密度为纵坐标，含葡萄糖量( g )为横坐标绘制标准曲线。 3. 样品测定 取待测样品提取液 1.0

42、mL 加蒽酮试剂5mL，同以上操作显色测定光密度。重复3次。 4. 结果计算 溶性糖含量(%)=从标准曲线查得糖的量(g)×提取液体积(ml)×稀释倍数/测定用样品液的体积(ml)×样品重量(g)×106×100 四、文献1. Fairbairn N J. A modified anthrone reagent J.Chem.and Ind., 1953(4):862. 中国科学院上海植物生理研究所，上海市植物生理学会. 现代植物生理学实验指南M. 北京：科学出版社， 1999. 127十一磺基水杨酸法测定游离脯氨酸含量一、目的在逆境条件下（旱

43、、热、冷、冻），植物体内脯氨酸的含量显著增加，植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种积累的脯氨酸多。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。二、原理磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸溶液中。然后用酸性茚三酮加热处理后，茚三酮与脯氨酸反应，生成稳定的红色化合物，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的

44、高低。在520nm波长下测定吸光度，即可从标准曲线上查出脯氨酸的含量。三、试剂1.2.5酸性茚三酮溶液配制：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol·L1磷酸（37.7ml磷酸加入水定容至100ml）（浓度为85%的磷酸大约是14mol/l,如果要配置6M的磷酸大约稀释到原来体积的2.3倍即可）中，搅拌加热（70）溶解，贮于冰箱中，此液在4下2-3d有效。2.3磺基水杨酸配配制：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。3.10g·ml-1脯氨酸标准母液配制：精确称取20mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，再倒入200ml容量瓶中，加蒸馏水定容至

45、刻度（为100g·ml1脯氨酸母液），再吸取该溶液10ml, 加蒸馏水稀释定容至100ml, 即为10g·ml-1脯氨酸标准液。4.冰醋酸。5.甲苯。四、实验步骤1. 脯氨酸标准曲线的制作1.1取6支试管，编号，按下表配制每管含量为012g的脯氨酸标准液。加入表中试剂后，置于沸水浴中加热30min。取出冷却，各试管再加入4ml甲苯，振荡30秒钟，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。试 剂管 号01234510g·ml-1脯氨酸标准液（ml）蒸馏水（ml）冰醋酸（ml）2.5酸性茚三酮（ml）0222or3or40.21.8220.41.6220.61.4220.81

46、.2221.01.022每管脯氨酸含量（g）02468101.2用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。1.3标准曲线的绘制以15号管脯氨酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。2. 样品的测定2.1脯氨酸的提取称取不同处理的植物叶片各0.5g，分别置大试管中，然后向各管分别加入5ml 3的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。2.2测定吸取2ml提取液于带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml或3ml或4ml 2.5酸性茚三酮试剂，在沸水浴

47、中加热30min，溶液即呈红色。冷却后加入4ml甲苯，摇荡30秒钟，静置片刻，待分层（取上层液至10ml离心管中，在3000r/min离心5min），用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。五、计算结果从标准曲线上查出样品测定液中脯氨酸的含量，按下公式计算样品中脯氨酸含量： X × 提取液总量（ml）脯氨酸含量（g·g1Fw） 样品鲜重（g）× 测定时提取液用量（ml）公式中：X 从标准曲线中查得的脯氨酸含量（g）六、文献王晶英，敖红，张杰，曲桂琴.植物生理生化实验技术与原理M .哈尔滨：东北林业

48、大学出版社，2003.7十二抗坏血酸（ASA）一、原理维生素C（抗坏血酸）具有较强的还原力，可以把铁离子（Fe3+）还原成亚铁离子（Fe2+），亚铁离子与红菲啰啉（4,7-二苯基-1,10-菲啰啉，BP）反应形成红色螯合物。此化合物在波长534nm（有的指导525nm）处具有强的吸收峰，且吸光度与反应液中抗坏血酸含量呈正相关。因此，可用比色法来测定抗坏血酸含量。二、试剂1100g/ml标准抗坏血酸溶液：称取1mg抗坏血酸（应为洁白色，如变为黄色则不能用），用5%偏磷酸溶液溶解，定容至10ml，即1ml溶液含100g抗坏血酸。现用现配，保存于棕色瓶中，低温冷藏。2. 无水乙醇3. 5% TCA（

49、50g/L TCA）：称取5g三氯乙酸，用蒸馏水定容于100ml容量瓶中。40.4%磷酸-乙醇溶液：量取0.47ml 85%磷酸溶液加入到无水乙醇中，并用无水乙醇稀释至100ml。50.5%BP-乙醇：称取0.5g红菲罗啉（BP，纯度>97%），用无水乙醇定容于100ml容量瓶中。60.3g/L 0.03%FeCl3-乙醇溶液：称取0.03g FeCl3加入到100ml无水乙醇中，摇匀。7. 5% 偏磷酸：称取5g偏磷酸（HPO3），定容于100ml蒸馏水（需加热溶解，温度在50-60）偏磷酸有剧毒。（或者偏磷酸难溶解，先得用研钵提前研碎，后用磁力搅拌器溶解一到两天后再定容）三、步骤1.

50、 制作标准曲线配制浓度为2mg/L（0.02ml标准液+0.98ml 5%偏磷酸），4mg/L（0.04ml标准液+0.96ml 5%偏磷酸），6mg/L（0.06ml标准液+0.94ml 5%偏磷酸），8mg/L（0.08ml标准液+0.92ml 5%偏磷酸），10mg/L（0.10ml标准液+0.90ml 5%偏磷酸），12mg/L（0.12ml标准液+0.88ml 5%偏磷酸），14mg/L（0.14ml标准液+0.86ml 5%偏磷酸）的AsA系列标准液。取各浓度标准液1.0ml于试管中，加入1.0ml 5%TCA、1.0ml乙醇，摇匀。再依次加入0.5ml 0.4%H3PO4乙醇、1

51、.0ml 0.5%BP乙醇、0.5ml 0.03%FeCl3乙醇，总体积5.0ml。将溶液置于30下反应90min，然后测定OD525。以AsA浓度为横坐标，以OD525为纵坐标绘制标准曲线，求出线性方程。2. 提取取植物叶片1.0g，加5ml的5%偏磷酸溶液，在4下研磨，20000r/min离心15min，上清液供测定，5保存。（偏磷酸可显著沉淀蛋白质和保护ASA）3. 测定AsA测定取1.0ml样品提取液于试管中，按上述相同的方法进行测定，并根据标准曲线计算AsA含量。4. 计算根据吸光度值，在标准曲线上查出响应的混合液中抗坏血酸质量，按下式计算植物组织中抗坏血酸含量。植物组织中抗坏血酸含量以100g样品（鲜重）中含有的抗坏血酸的质量表示，即mg/100g。  V×m抗坏血酸含量= ×100 (mg/100g) Vs×M×1000式中，m为由标准曲线求得的抗坏血酸的质量（g）；Vs为