导流杂交基因芯片技术在人乳头瘤病毒基因分型的应用

1、导流杂交基因芯片技术在人乳头瘤病毒基因分型的应用【摘要】 目的探讨对人乳头瘤病毒(HPV)感染进行准确快速基因诊断和分型的方法。方法采用导流杂交基因芯片技术和实时荧光PCR对75例疑似HPV感染的标本进行基因诊断和分型。结果基因芯片阳性28例,其中单一感染21例,多重感染7例；实时荧光PCR阳性25例。二者在阳性结果中有很好的一致性。结论导流杂交基因芯片技术适合临床筛查HPV感染及对HPV进行基因分型。 【关键词】 乳头瘤病毒 人 基因型 寡核苷酸序列分析 原位杂交 人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是小分子双链DNA病毒,具有强烈嗜上皮性,高度组织和宿主特异性,

2、可致人类皮肤和黏膜异常增生,引起多种良、恶性病变。目前已经鉴定100多种亚型,其中近40种能感染生殖器官。根据其对生殖系统的致癌性不同,可将其分为低危型和高危型12。前者包括HPV 6,11,42,43等亚型,主要引发良性增生,如尖锐湿疣；后者包括HPV16,18,31,33,45等亚型,常引起恶性转化,如宫颈癌。由于HPV的致病性与其型别密切相关,所以对其进行检测和分型对宫颈癌的早期筛查、防治、预后判断等具有重要的临床意义。笔者对75例疑似HPV感染的标本同时进行导流杂交基因芯片技术(flowthrough hybridization and gene chip)即凯普导流杂交HPV DNA

3、检测(简称HybrMax)和荧光定量PCR检测,探讨HybrMax在HPV检测中的应用价值。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1标本来源、采集、保存75例标本取自2006年6-12月福建医科大学附属协和医院疑似HPV感染的门诊女性患者,年龄(26±10.6)岁(1839岁)。采集宫颈口棉拭子标本,将取样后的棉拭子放入备有无菌生理盐水1 mL的加盖微量离心管(1.5 mL)中,采集的样本在室温放置<2 h,4 保存24 h,-20 保存3个月,样本避免反复冻融。 1.1.2试剂及仪器HPV DNA抽提试剂盒(QIA Mini试剂盒,德国QIAGEN公司),HPV基因分型

4、检测试剂盒(中国凯普生物科技有限公司),可检测21种HPV亚型,包括13种高危亚型(16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59和68型)、5种低危亚型(6,11,42,43和44型)和3种中国人群常见亚型(53,66和CP8304型)。另外在膜上还包括用于质量控制的阴性对照点、内对照点(用于监测PCR反应)和Biotin对照点(用于监测显色系统)；HPV6/11、16、和18型实时荧光PCR检测试剂盒(深圳匹基生物有限公司)；扩增仪(PE9700，美国ABI公司)； 荧光定量PCR仪(LightCycler，瑞士Roche公司)；医用核酸分子快速杂分仪（中国凯普公司

5、）。 1.2方法 1.2.1标本DNA提取取上述液体0.5 mL,13 000 r/min离心1 min,弃上清液,利用QIA Mini试剂盒提取DNA,具体操作步骤按试剂盒说明书。 1.2.2HybrMax法检测21种HPV亚型 1.2.2.1标本DNA扩增将水、PCRMIX、Taq酶和DNA模板按要求混匀,反应体系为25 L。PCR反应条件为20 10 min,95 预变性9 min；95 20 s55 30 s72 30 s共40个循环,72 延伸5 min。 1.2.2.2导流杂交将扩增后的PCR产物加热变性后冰浴,同时将固定有核酸探针的膜固定在杂交仪上,进行预杂交。把PCR产物加到薄

6、膜上,让样品流入膜内进行导流杂交,清洗除去未结合的DNA,整个杂交过程保持在45 。 1.2.2.3芯片显色及结果判读用封阻液封闭膜,孵育5 min,重复2次。排出封阻液后加入酶标液,25 温育3.5 min。用冲洗缓冲液彻底冲洗膜,除去未结合的酶标液,后加入NBT/BCIP底物显色35 min。在显色后1 h内分析结果。 1.2.3实时荧光PCR测定HPV亚型按照试剂 说明书对每份标本检测HPV6/11、16和18等4种亚型。 1.3统计学处理2种方法检测结果比较用秩和检验,P0.05为差别有统计学意义。 2结果 2.1HybrMax法检测所有膜上阴性对照结果均为阴性,内对照点和Biotin

7、对照点均为阳性。75例样本共28例阳性,其中单一感染21例,复合感染7例。HPV单一感染时,在膜芯片上相应HPV亚型探针位点处可见一蓝紫色斑点,双重或多重感染时,在膜上可见两个或两个以上显色斑点(图1)。 2.2荧光定量PCR检测75例样本共检出25例阳性,其中单一HPV6/11亚型阳性15例,单一HPV16亚型阳性3例,单一HPV18亚型阳性2例,HPV6/11和HPV16均阳性1例,HPV6/11和HPV18均阳性4例。 2.3HybrMax法与荧光定量PCR比较75例标本HybrMax法28例阳性,荧光定量PCR 25例阳性,经统计分析显示其差别无统计学意义(P0.05),表明二者在阳性

8、结果中有较好的一致性,但实时荧光PCR有一定的漏检率,漏检标本包括2例53亚型及58亚型的单一感染和1例35和58亚型的复合感染。另外4例复合型感染除了有常见的6，11，16，18亚型外,还检出31，53,58,66及CP8304亚型(表1,2)。在以上检测到的亚型中33，58，66亚型都为HPV的高危亚型,说明HybrMax法在检测HPV复合感染以及高危型HPV检出方面具有优势。 3讨论 宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,临床证明95.099.7宫颈癌和高危型HPV感染有关3。 而且不同亚型HPV对子宫颈癌致癌性有不同影响,因此,准确诊断HPV感染及其分型对宫颈癌筛查、早期确诊及治疗效果监测有

9、着重大意义。 HPV分型检测研究一直受到国内外学者的高度重视4。目前,对HPV感染的分型诊断主要方法有斑点杂交、Southern印迹及实时荧光PCR等。传统的斑点杂交、Southern印迹由于杂交过程操作复杂,耗时长(杂交需十几个小时甚至1 d),检测低拷贝基因的敏感性不足,可能需要使用同位素等,表1基因芯片结果与荧光定量PCR结果的比较:由于匹基实时荧光PCR的试剂不能对HPV6和11两种亚型分别进行检测,因此,当患者感染其中任何一种亚型时,其检测结果表示为HPV6/11亚型阳性.表2荧光定量PCR和基因芯片结果的2检验不适合临床常规检测。实时荧光PCR检测HPV DNA已经应用于临床,其灵

10、敏度和可靠性已得到认可,但目前能检测的HPV亚型十分有限,主要包括常见的HPV6,11,16,18四种亚型5,易漏诊其他HPV亚型的感染,不利于流行病学和病因学的进一步深入研究。 基因芯片是近年来发展起来的可对病原体核酸进行高通量快速检测的技术6。HybrMax法是导流杂交技术结合低密度基因芯片技术,利用PCR扩增提高检测的灵敏度,分子杂交特异性高,是HPV基因型分型检测的新方法7。运用其高通量检测的特点, 达到对21种常见高危型和低危型HPV亚型在同一样品中进行分型检测。与现有的实时荧光PCR相比,具有很多优点:(1)利用芯片高通量的特点可一次性检测21种亚型,增加了HPV感染的检出率及不同

11、亚型复合感染的检测率3,尤其是高危型的检出；(2)芯片设计考虑了中国人感染HPV的特点,包含了中国人常见的3个亚型(53，66和CP8304亚型),有利于在我国筛查HPV感染；(3)有良好的质量控制体系。基因芯片上包括了阴性对照点、内对照点和biotin对照点,对基因扩增和杂交实行了全程控制；(4)整个检测过程仅需3.5 h就可出具检验报告,检测时间短,能满足临床需要；(5)结果可靠。本实验通过与实时荧光PCR的结果对比,说明HybrMax法的检测结果具有与荧光定量PCR相当的灵敏度和可靠性。 本研究中,HybrMax法共检出10种HPV基因型,其中高危型的检出率为18.7,混合型9.3；而实

12、时荧光PCR技术检出高危型13.3,混合型6.7。HybrMax法检出的高危型别包括HPV16，18，31，35，53，58，66型,其中HPV16，18型与泌尿生殖道肿瘤关系密切,尤其是宫颈癌。所以对尖锐湿疣患者进行HPV DNA的基因分型,对于判定预后,指导临床对高危型及多重型HPV感染患者长期随访,采取针对治疗措施,降低与HPV相关肿瘤的发生率有重要意义。 HybrMax法检测HPV亚型包含了PCR技术的高敏感性、导流杂交技术的快速性和基因芯片的高通量性,是一种适合目前临床筛查HPV感染同时对HPV进行基因分型的有效方法。虽然目前基因芯片技术成本昂贵,检测的可靠性、实用性还有待于进一步验

13、证,但基因芯片技术用于HPV的分型检测有广阔的前景。【参考文献】 1Dunne E F,Markowitz L E. Genital human papillomavirus infectionJ. Clin Infect Dis, 2006, 43(5):624629.2Trottier H,Franco E L. The epidemiology of genital human papillomavirus infectionJ. Vaccine, 2006, 24(Suppl 1):115.3乌兰娜,吴瑞芳,周艳秋,等. 人乳头瘤病毒基因亚型与宫颈病变的关系J. 中华妇产科临床杂志, 2005,6(5):346350.4Wright J D,Herzog T J. Human papillomavirus: emerging trends in detection and managementJCurr