DC细胞制备标准操作程序

1、崇州医院细胞治疗中心 标准操作程序DC细胞制备标准操作程序1 目的和范围：1.1 目的：规范DC细胞培养操作流程，保证细胞产品制备的稳定性、均一性。1.2 范围：适用于实验室细胞培养技术人员DC细胞培养的全过程。2 原理：2.1 外周血PBMC经细胞因子诱导可分化为DC细胞。3 相关文件：3.1 CIK细胞制备标准操作规程4 记录4.1 DC-CIK细胞制备记录。5 物料：5.1 试剂：75%酒精，碘伏，生理盐水，淋巴细胞分离液（Ficoll），GT-T551培养基，自体血清，DC因子-1，DC因子-2，肿瘤蛋白等。5.2 仪器设备：生物安全柜，离心机，水浴锅，二氧化碳细胞培养箱，电动移液枪，

2、10ul移液枪，医用剪刀，医用止血钳，试管架。5.3 耗材：T25培养瓶（25cm2Flask），T75培养瓶（75cm2Flask）15ml离心管，50ml离心管，5ml移液管，10ml移液管， 200ul枪头。6 职责：6.1 细胞培养技术人员应严格按照本规程的规定进行DC细胞培养操作。6.2 QA负责监督细胞培养技术人员的操作全过程，确保DC细胞培养操作的规范性。6.3 审核人负责保证本规程的审核和全过程准确有效。7 工作程序：7.1 实验前准备：7.1.1 洁净区需经过紫外线照射，连续照射时间不得低于30min.，实验过程中风机始终保持开启状态。7.1.2 生物安全柜需经过开机紫外线照

3、射，连续照射时间不得低于30min。并且开启生物安全柜玻璃防护窗，待生物安全柜内部气流稳定后，才可使用。7.1.3 将实验所需器械放于物料传递窗进行紫外照射，（器械必须是经过高压灭菌锅消毒灭菌，并且在合格期以内）照射完毕后将器械盒用酒精进行擦拭消毒后，放入生物安全柜中备用。7.1.4 单核细胞分离液（Ficoll），培养基，应提前准备好放入生物安全柜中，以便其回复常温，否则将会影响实验效果。7.1.5 DC因子-1及DC因子-2在使用时置于冰块上方，即用即取，禁止在常温下长期放置。7.2 分离培养7.2.1 按照CIK细胞制备标准操作程序所述的方式分离提取PBMC。12345677.17.1.

4、1677.17.1.17.1.27.2.2 接种：7.2.2.1 用GT-T551培养基（加10%自体血清）调整细胞浓度为56´106/ml，铺入细胞培养瓶中，标记，水平放入37，5%CO2细胞培养箱内，若非透气孔培养瓶，应拧松瓶盖一圈。7.2.2.2 -3小时后（拧紧瓶盖），取出，（注意轻拿轻放）经消毒后放入生物安全柜中。7.2.2.3 沿培养瓶反面将细胞悬液全部倒入离心管中。7.2.2.4 用5mlGT-T551培养基（加10%自体血清）刷洗培养瓶，涮洗液也倒入离心管中。7.2.2.5 离心管中细胞悬液做CIK培养（详细步骤参照CIK细胞制备标准操作程序）。7.2.2.6 沿原培

5、养瓶反面加入10ml GT-T551培养基（加10%自体血清）。7.2.2.7 加入DC因子-1，分装量10ul/支 ，每10ml培养基可添加1支（培养基不足10ml时按比例添加）。7.2.2.8 标记，水平放入37，5%CO2细胞培养箱培养。7.3 换液：7.3.1 第一次直接加液5ml，换液方式如下：7.3.1.1 准备耗材至生物安全柜：15ml离心管1个，GT-T551培养基（加10%自体血清），DC因子-1；7.3.1.2 配制试剂：参考7.2.2.7步骤。7.3.1.3 从培养箱中取出培养瓶，将离心管中培养基沿反面倒入培养瓶。7.3.2 第二次开始半量换液，换液方式如下：7.3.2.

6、1 按7.3.1.17.3.1.2的方式配制预添加量培养基。7.3.2.2 从培养箱中取出培养瓶，用移液管取半量培养基至15ml离心管中。7.3.2.3 1200rpm，8min，去上清，加入已配制的培养基，重悬，混匀。7.3.2.4 沿培养瓶反面倒入培养瓶中，转移至CO2细胞培养箱。7.4 24h后添加DC因子-2：分装10ul/支，每20ml培养基可添加1支（培养基不足20ml时，可按体积比例进行添加）。7.5 DC成熟后（一般约24h），将DC细胞悬液转移至CIK细胞悬液中共培养。7.5.1 核对CIK细胞培养袋信息是否与DC细胞信息相符。7.5.2 按CIK细胞制备标准操作规程（SOP

7、-TC-001）7.5.1-7.5.3的步骤链接对应CIK细胞培养袋和注射器。7.5.3 轻拍DC细胞培养瓶，使DC细胞完全悬浮，悬液倒入注射器中或移液管转移至CIK细胞培养瓶中。7.5.4 用5-10ml培养基（含10%血清）涮洗培养瓶，并冲洗细胞培养面，涮洗液也倒入注射器中或CIK培养瓶中。7.5.5 移去注射器，拧紧盖子，标记，放入CO2细胞培养箱。7.5.6 填写相关记录，清场。7.6 DC细胞收集回输：当DC细胞直接用于回输时按以下步骤。7.6.1 复核DC细胞是否与回输计划信息相符。7.6.2 取样本，经酒精擦拭后放入生物安全柜。7.6.3 取50ml离心管，标记，打开离心管管盖。

8、7.6.4 轻拍DC细胞培养瓶，使DC细胞完全悬浮，悬液倒入离心管中。7.6.5 用5-10ml生理盐水涮洗培养瓶，并冲洗细胞培养面，涮洗液也倒入离心管中，1200rpm，8min。7.6.6 去上清，加入45ml生理盐水重悬，取0.5ml中间层细胞悬液计数及活率。7.6.7 1200rpm，8min，用15ml离心管取15ml上清做内毒素、革兰氏检测并留样，其余上清废弃。7.6.8 用生理盐水和自体血清重悬细胞至20ml（如无自体血清，用5ml 人血白蛋白和15ml生理盐水重悬细胞至20ml）。7.6.9 转袋。（参照CIK细胞制备标准操作程序）7.6.10 用10ml生理盐水涮洗离心管，涮洗液也转入转移袋或生理盐水瓶。7.6.11 填写相关记录，清场。7.7 微生物检测控制点与回输质量控制：7.7.1 细胞接种前取单核细胞最后一次清洗上清2ml液做微生物检测(细菌培养和真菌培养)7.7.2 细胞回输前3-4天取样在培养的细胞悬液2ml做微生物检测(细菌培养和真菌培养)7.7.3 每次回输当日，取细胞上清做内毒素检