差示热量分析

1、 微量热技术微量热技术(Microcalorimetry) 一、热分析技术及分类一、热分析技术及分类 热分析是在程序控制温度下，测量物质的物理性质随温度变化的一类技术。 程序控制温度：指用固定的速率加热或冷却。 物理性质：包括物质的质量、温度、 热焓、尺寸、机械、升学、电学及 磁学性质等。 热分析历史热分析历史 1780年英国的Higgins使用天平研究石灰粘结剂和生石灰受热重量变化。 1915年日本的本多光太郎提出“热天平” 概念。 二战以后，热分析技术飞快发展。 40年代末商业化电子管式差热分析仪问世。 1964年提出“差示扫描量热”的概念。 热分析已经形成一类拥有多种检测手段的仪器分析方

2、法。 热分析技术的分类热分析技术的分类: 等热分析 差热分析 示差扫描量热分析 热重分析 逸出气体分析 热膨胀仪 热力法 热光法 电磁热分析 放射热分析等 热分析技术分类热分析技术分类物理性质物理性质分析技术名称分析技术名称物理性质物理性质分析技术名称分析技术名称质量质量热重法热重法尺寸尺寸热膨胀法热膨胀法等压质量变化测定等压质量变化测定力学特性力学特性热机械分析热机械分析逸出气体分析逸出气体分析动态热机械分析动态热机械分析放射热分析放射热分析声学特性声学特性热发声法热发声法热微粒分析热微粒分析热声学法热声学法温度温度加热曲线测定加热曲线测定光学特性光学特性热光学法热光学法差热分析差热分析电学

3、特性电学特性热电学法热电学法焓焓差示扫描量热法差示扫描量热法磁学特性磁学特性热磁学法热磁学法 热分析四大支柱：热分析四大支柱： 等热分析、差热分析、 差示扫描量热分析、热机械分析 用于研究物质的晶型转变、融化、升华、吸附等物理现象以及脱水、分解、氧化、还原等化学现象。 快速提供被研究物质的热稳定性、热分解产物、热变化过程的焓变、各种类型的相变点、玻璃化温度、软化点、比热、纯度、爆破温度和高聚物的表征及结构性能等。 微量热法(包括等温滴定量热和差示扫描量热)是近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要结构生物学方法.它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续和准确地监测和记录一个变化过程

4、的量热曲线，原位(in situ)、在线(on-line)和无损伤地同时提供热力学和动力学信息 微量热法具有以下特点：微量热法具有以下特点： 它不干扰蛋白质和核酸的生理功能，具有非特异性的独特优势，即它不干扰蛋白质和核酸的生理功能，具有非特异性的独特优势，即对被研究蛋白质和核酸体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有对被研究蛋白质和核酸体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件。任何限制条件。 样品用量小样品用量小,方法灵敏度高，测量时不需要制成透明清澈的溶液。方法灵敏度高，测量时不需要制成透明清澈的溶液。 量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。量热实验完毕的样品未遭破

5、坏，还可以进行后续生化分析。 微量热法缺乏特异性。但由于蛋白质和核酸本身具有特异性，因此这微量热法缺乏特异性。但由于蛋白质和核酸本身具有特异性，因此这种非特异性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果，这有助于发种非特异性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果，这有助于发现新现象和新规律。现新现象和新规律。微量热法在生物大分子研究中的应用主有微量热法在生物大分子研究中的应用主有：酶促反应蛋白质去折叠/折叠抗原-抗体相互作用分子伴侣-底物相互作用药物-核酸相互作用物质的三个基本性质即能量、结构和动力学性质相互关联物质的三个基本性质即能量、结构和动力学性质相互关联例例. . 水分子中角水分子中角H-

6、O-HH-O-H为为105105 ，因为这样分子能量最小；，因为这样分子能量最小； 又如，多肽又如，多肽链在溶液中折叠成球蛋白，也是由于要使系统能量最小化。链在溶液中折叠成球蛋白，也是由于要使系统能量最小化。 波谱学方法可以探测不同能级之间的跃迁，即研究样品分子在波谱学方法可以探测不同能级之间的跃迁，即研究样品分子在光的作用下能量状态的变化；而热分析的方法可以直接量测样光的作用下能量状态的变化；而热分析的方法可以直接量测样品分子结构发生变化时能量的变化。品分子结构发生变化时能量的变化。原原 理理热分析技术热分析技术在升温或降温的过程中，物质的结构（如相态）和在升温或降温的过程中，物质的结构（如

7、相态）和化学性质会发生变化，其质量、尺寸及声、光、电化学性质会发生变化，其质量、尺寸及声、光、电、磁、热、力等物理性质也会发生相应的变化、磁、热、力等物理性质也会发生相应的变化热分析技术就是在温度程序控制的条件下测量物质热分析技术就是在温度程序控制的条件下测量物质的物理性质与温度关系的一类技术的物理性质与温度关系的一类技术在程序控制温度下，在程序控制温度下，测量物质质量的变化，产生了热重法、等压质量变化测测量物质质量的变化，产生了热重法、等压质量变化测定和逸出气检测等技术；定和逸出气检测等技术；测量样品几何尺寸的变化，则有了热膨胀法；测量样品几何尺寸的变化，则有了热膨胀法；测量样品的光学特性，

8、有热光学法；测量样品的光学特性，有热光学法；测量样品的电学特性，有热电学法；测量样品的电学特性，有热电学法；测量样品的磁学特性，有热磁学法；测量样品的磁学特性，有热磁学法；测量样品的力学特性，有热机械分析和动态热机械测量样品的力学特性，有热机械分析和动态热机械法；法；测量样品的热力学性质，则有等温滴定量热、差热测量样品的热力学性质，则有等温滴定量热、差热分析和差示扫描量热法分析和差示扫描量热法(DSC)(DSC)差热分析、等温滴定量热和差示扫描量热技术应用差热分析、等温滴定量热和差示扫描量热技术应用得最广泛。得最广泛。差热分析（差热分析（DTA）是在程序控温下测量样品和参比是在程序控温下测量样

9、品和参比物的物的温度差温度差与温度的关系的技术。与温度的关系的技术。等温滴定量热（等温滴定量热（ITC）通过滴定反应热放出或吸收通过滴定反应热放出或吸收的热力学分析，提供结合反应相关的能量过程的定的热力学分析，提供结合反应相关的能量过程的定量特征。量特征。差示扫描量热（差示扫描量热（DSC）技术是在程序控温下测量输技术是在程序控温下测量输入到位置与参比物的入到位置与参比物的功率差功率差与温度的关系的技术。与温度的关系的技术。热分析所测定的热力学参数主要是热焓的变化热分析所测定的热力学参数主要是热焓的变化（ H H）。由于在给定温度下每个体系总是趋向于）。由于在给定温度下每个体系总是趋向于达到自

10、由能最小的状态，所以样品升温或降温的达到自由能最小的状态，所以样品升温或降温的过程中，它可转变成具有不同自由能的另一种结过程中，它可转变成具有不同自由能的另一种结构状态。分析伴随着结构变化所发生的热焓变化，构状态。分析伴随着结构变化所发生的热焓变化，就可以得到样品结构变化的某些信息。这就是用就可以得到样品结构变化的某些信息。这就是用差示扫描量热法来分析生物大分子结构变化的基差示扫描量热法来分析生物大分子结构变化的基础。础。差示扫描量热法能精确、快速、方便地同时提供差示扫描量热法能精确、快速、方便地同时提供样品物理性质和能量性质相关信息，这是其它技样品物理性质和能量性质相关信息，这是其它技术难以

11、做到的。术难以做到的。热分析既可以用于研究物理性质的变化，也可研究化学变热分析既可以用于研究物理性质的变化，也可研究化学变化；不仅可测量热力学参数，也可提供一定的动力学信息。化；不仅可测量热力学参数，也可提供一定的动力学信息。因此热分析在物质组分和结构研究及热力学和动力学研究因此热分析在物质组分和结构研究及热力学和动力学研究上都是重要的分析手段。上都是重要的分析手段。热分析所研究的物质可以是无机物（包括金属、矿物、陶热分析所研究的物质可以是无机物（包括金属、矿物、陶瓷材料等），也可以是有机物；既可以是小分子物质，也瓷材料等），也可以是有机物；既可以是小分子物质，也可以研究生物大分子；因此，其研

12、究的对象遍及物理、化可以研究生物大分子；因此，其研究的对象遍及物理、化学、生物、医药、食品、化工、材料、地矿、航天、环保学、生物、医药、食品、化工、材料、地矿、航天、环保、考古等多个领域。在生物学研究中，研究比较早的是生、考古等多个领域。在生物学研究中，研究比较早的是生物膜、膜脂及模拟生物膜的模型膜；随着热分析仪器测量物膜、膜脂及模拟生物膜的模型膜；随着热分析仪器测量精度的提高，对生物大分子如蛋白质、核酸的研究也越来精度的提高，对生物大分子如蛋白质、核酸的研究也越来越普遍，越来越深入。越普遍，越来越深入。 热量的测量与量热仪热量的测量与量热仪热量是不能直接测量的，只能通过热效应间接测量。例如热

13、量是不能直接测量的，只能通过热效应间接测量。例如测量温差随时间的变化或温差随地点测量温差随时间的变化或温差随地点(位置位置) 的变化，即的变化，即 T=T(t1)-T(t2)或或 T=T(x1)T(x2)通过测量不同时间的温差间接测量热量的最古老的方法就通过测量不同时间的温差间接测量热量的最古老的方法就是测量一定质量的水的温度变化是测量一定质量的水的温度变化: Q = Ck T T=T(t1)T(t2)是水温在是水温在t1到到t2这段时间内的变化，这段时间内的变化， Q是是热量，热量，Ck是热容（假定它在测量范围内是不变的）。是热容（假定它在测量范围内是不变的）。通过测量不同地点的温差也可以测

14、量热量通过测量不同地点的温差也可以测量热量:QK(T)T(t)dt这里这里T表示温度，表示温度，t表示时间，表示时间， T是时间是时间t时地点时地点x1和和x2的的温差，温差， TT(x1，t)T(x2，t)， K是比例系数。是比例系数。 不同的量热仪所依据的测量热量的原理千差万别，不同的量热仪所依据的测量热量的原理千差万别，量热仪的分类也有各种方法。量热仪的分类也有各种方法。根据测量原理的不同，可以分为根据测量原理的不同，可以分为相变补偿型、相变补偿型、热电热电效应补偿型效应补偿型、测量温差随时间变化型、测量温差随、测量温差随时间变化型、测量温差随地点变化型等；地点变化型等；根据运行模式不同

15、，可分为等温静态运行、恒温环根据运行模式不同，可分为等温静态运行、恒温环境静态运行、绝热静态运行、绝热动态扫描运行、境静态运行、绝热静态运行、绝热动态扫描运行、恒温环境扫描动态运行等恒温环境扫描动态运行等；根据构造原理分类：如双量热仪、单量热仪等。根据构造原理分类：如双量热仪、单量热仪等。用人名命名，如用人名命名，如BunsenBunsen量热仪、量热仪、CalvetCalvet量热仪等。量热仪等。无论采用哪一种分类方法，都可能会有某些量热仪难无论采用哪一种分类方法，都可能会有某些量热仪难以明确归入某一类中去。例如，以明确归入某一类中去。例如，CalvetCalvet量热仪，可用量热仪，可用电

16、补偿热效应方式工作在恒温模式下，也可用恒温环电补偿热效应方式工作在恒温模式下，也可用恒温环境方式测量不同地点的温差。境方式测量不同地点的温差。还有某些量热仪不在上述分类的范围以内。还有某些量热仪不在上述分类的范围以内。 一一、等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry，ITC） 等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)是近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息。

17、 等温滴定微量量热法（ITC）可以检测滴定反应过程中热量变化，用来表征生物分子间的相互作用，ITC 迅速成为研究生物大分子结合反应的有力工具。 通过滴定反应物到含有反应所必须的另一反应物的样品溶液中。每次滴定后，反应热放出或吸收，这些都可以被ITC所检测到。检测到的热效应的热力学分析提供了结合反应相关的能量过程的定量特征，可以直接测量与常温下发生的反应过程相关的能量学参数。 ITC的用途：的用途：获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数KB 、结合位点数（n） 、摩尔结合焓变（H） 、摩尔结合熵变（S） 、摩尔恒压热容，和动力学参数(如酶活力、酶促反应米氏常数和酶转换数)等化学热力学

18、参数描述一个结合反应ITC的应用范围：的应用范围：蛋白质-蛋白质相互作用(包括抗原-抗体相互作用和分子伴侣-底物相互作用)；蛋白质折叠/去折叠；蛋白质-小分子相互作用以及酶-抑制剂相互作用； 酶促反应动力学；药物-DNA/RNA相互作用；RNA折叠；蛋白质-核酸相互作用；核酸-小分子相互作用；核酸-核酸相互作用；生物分子-细胞相互作用； ITC的特点 ITC能测量到的热效应最低可达125 nJ， 最小可检测热功率2 nW， 生物样品最小用量0.4 g， 灵敏度得到提高，响应时间（小于10 s） ITC不需要固定或改变反应物，因为结合热的产生是自发的。获得物质相互作用完整的热力学数据包括结合常数

19、（Ka）、结合位点数（n），结合焓（H）、恒压热容（Cp）和动力学数据（如酶促反应的Km和kcat）ITC 结构原理示意图 ITC 获取的结果示意图 峰底与峰尖之间的峰面积为每次注射时释放或吸收的总热量峰底与峰尖之间的峰面积为每次注射时释放或吸收的总热量 以产生或吸收的总热量为纵坐标，以加入杯中的两反应物之摩尔比为坐标作图，以产生或吸收的总热量为纵坐标，以加入杯中的两反应物之摩尔比为坐标作图，可得整个反应过程的结合等温曲线可得整个反应过程的结合等温曲线 ITC的应用的应用 1）蛋白质）蛋白质-小分子和酶小分子和酶-抑制物相互作用；抑制物相互作用；2）蛋白质）蛋白质-糖类相互作用；糖类相互作用；

20、3）蛋白质）蛋白质-蛋白质相互作用：如蛋白质相互作用：如Jacobson等用等用ITC研究了人细胞研究了人细胞RNA聚合酶聚合酶转录因子转录因子TFIID的最大亚单位的最大亚单位TAFII250的组蛋白乙酰基转移酶活性的组蛋白乙酰基转移酶活性(Jacobson et al., 2000)。日本。日本Kanagawa科学技术研究所的科学技术研究所的Tahirov等利用等利用ITC、CD和和UV研究了研究了AML1/Runx-1小结构域识别的小结构域识别的DNA结构及结构及CBF控制的控制的构象调整，阐明了构象调整，阐明了CBF与与CBF间的相互作用模式及前者调控后者结合到间的相互作用模式及前者调

21、控后者结合到DNA上的机制上的机制(Tahirov, et al., 2001)。3）蛋白质）蛋白质-脂质相互作用；脂质相互作用；4）脂质间以及脂质）脂质间以及脂质-小分子相互作用；小分子相互作用；5）核酸）核酸-小分子相互作用；小分子相互作用；6）蛋白质）蛋白质-核酸相互作用；核酸相互作用；7）核酸）核酸-核酸相互作用；核酸相互作用； 8）抗体研究：美国）抗体研究：美国Johns Hopkins大学生物系的生物量热学中心是目大学生物系的生物量热学中心是目前世界上从事生物量热学最活跃和处于领先水平的实验室，该中心的前世界上从事生物量热学最活跃和处于领先水平的实验室，该中心的Freire小组小组

22、(Murphy et al., 1993, 1995)应用高灵敏度应用高灵敏度ITC分别研究了分别研究了血管紧缩素与其单克隆抗体和酸诱导去折叠细胞色素血管紧缩素与其单克隆抗体和酸诱导去折叠细胞色素c与其单克隆抗与其单克隆抗体的结合，发现上述结合过程均为焓和熵同时驱动的反应，实验结果体的结合，发现上述结合过程均为焓和熵同时驱动的反应，实验结果表明，这些过程中溶剂释放所导致的熵增过量补偿了因结合而引起的表明，这些过程中溶剂释放所导致的熵增过量补偿了因结合而引起的构象熵的损失。构象熵的损失。9）受体相互作用；）受体相互作用；10）蛋白质折叠和稳定性：如美国的）蛋白质折叠和稳定性：如美国的Wright

23、小组应用小组应用ITC和核磁共振和核磁共振(NMR)等技术研究了核激素受体蛋白的一个结构域与甲状腺素及类纤等技术研究了核激素受体蛋白的一个结构域与甲状腺素及类纤维素维素A受体相互作用的热力学，发现虽然分开的结构域本身很凌乱，受体相互作用的热力学，发现虽然分开的结构域本身很凌乱，但是它们之间有高的亲和力而且是焓驱动的，并以一种独特的协同折但是它们之间有高的亲和力而且是焓驱动的，并以一种独特的协同折叠的机制形成螺旋异二聚体。叠的机制形成螺旋异二聚体。 11）酶分析：应用等温滴定微量热法）酶分析：应用等温滴定微量热法(ITC)结合高灵敏度差示扫描量热法结合高灵敏度差示扫描量热法(DSC)和和分光光度

24、法研究酵母细胞色素分光光度法研究酵母细胞色素C氧化酶催化氧化其生理底物氧化酶催化氧化其生理底物亚铁细胞色素亚铁细胞色素c的的热力学和动力学，并分析原盐效应对该酶活性的影响。应用等温微量热法研究热力学和动力学，并分析原盐效应对该酶活性的影响。应用等温微量热法研究了超氧化物歧化酶催化歧化超氧阴离子等反应体系，获得了这些酶促反应的各了超氧化物歧化酶催化歧化超氧阴离子等反应体系，获得了这些酶促反应的各种热力学和动力学信息种热力学和动力学信息,探讨了相关催化机理，同时用该法研究了博莱霉素催化探讨了相关催化机理，同时用该法研究了博莱霉素催化切割切割DNA的反应，从热力学和动力学的角度严格地证明了博莱霉素在

25、催化机制的反应，从热力学和动力学的角度严格地证明了博莱霉素在催化机制上类似于上类似于DNA切割酶，但其催化效率低于切割酶，但其催化效率低于DNA切割酶，并用等温滴定微量热法切割酶，并用等温滴定微量热法研究了不同浓度盐酸胍存在时肌酸激酶催化研究了不同浓度盐酸胍存在时肌酸激酶催化ATP与肌酸间转磷酸化反应的热力与肌酸间转磷酸化反应的热力学，从热力学的观点确定了该酶促反应为快速平衡的随机顺序反应，还建立了学，从热力学的观点确定了该酶促反应为快速平衡的随机顺序反应，还建立了新的肌酸激酶和超氧化物歧化酶活力测定方法新的肌酸激酶和超氧化物歧化酶活力测定方法微量热测活法。微量热测活法。值得指出的是，值得指出

26、的是，ITC不仅被应用于研究蛋白质折叠不仅被应用于研究蛋白质折叠/去折叠，而且被应用于核酸去折叠，而且被应用于核酸折叠，英国的折叠，英国的Hammann等人利用等人利用ITC研究了镁离子诱导锤头状核酶折叠的热力研究了镁离子诱导锤头状核酶折叠的热力学，发现镁离子与天然序列核酶的结合是一个强烈的放热反应，和镁离子与锤学，发现镁离子与天然序列核酶的结合是一个强烈的放热反应，和镁离子与锤头状核酶不同序列变异体的结合有很大的区别，这些工作对于核酸折叠的热力头状核酶不同序列变异体的结合有很大的区别，这些工作对于核酸折叠的热力学研究是良好的开端。学研究是良好的开端。ITC 应用示例应用示例ITC法测量结合法

27、测量结合/解离常数解离常数:Christian Herrmann等运用等运用ITC研究了研究了Ras与效应物和与效应物和Cdc42与效应物的相互与效应物的相互作用。作用。Ras是一种在信号转导过程中起重要作用的蛋白质。可以向其下游的许多信是一种在信号转导过程中起重要作用的蛋白质。可以向其下游的许多信号转导途径输送细胞内调控信号。号转导途径输送细胞内调控信号。Ras在非激活态，与在非激活态，与GDP结合，当结合，当GDP被被GTP取代时被激活，与其效应物（取代时被激活，与其效应物（Raf，RalGDS，3-磷脂酰肌醇激酶）呈现磷脂酰肌醇激酶）呈现更紧密的结合。更紧密的结合。Cdc42是一种是一种

28、GTPase，也是信号转导相关的蛋白。它参与细，也是信号转导相关的蛋白。它参与细胞增殖调控和肌动蛋白细胞骨架的调控。胞增殖调控和肌动蛋白细胞骨架的调控。Cdc42在参与细胞骨架调控的过程在参与细胞骨架调控的过程中，很重要的一步是与中，很重要的一步是与WASP蛋白的相互作用。蛋白的相互作用。Ras及其效应物（及其效应物（Raf，RalGDS）的结合方式都很类似，包括富含亲水氨基）的结合方式都很类似，包括富含亲水氨基酸侧链的反平行酸侧链的反平行折叠。折叠。Cdc42及其效应物及其效应物(WASP)的结合区则富含疏水氨的结合区则富含疏水氨基酸，其复合物也比基酸，其复合物也比Ras/效应物复合物大得多

29、。效应物复合物大得多。浓度依赖的浓度依赖的Ras/RalGDS相互作用相互作用 利用基于荧光的利用基于荧光的GDI法测得法测得Kd2.4 M()和和1.2 M() 利用利用ITC测得测得Kd1.73 M()和和0.83 M(） ITC可以直接测量焓变可以直接测量焓变H，结合常数，结合常数Ka，而不对反应体系产生影响，也不引入修饰而不对反应体系产生影响，也不引入修饰基团，因此测得的结果更加可信基团，因此测得的结果更加可信 ITC探测生物分子结构信息探测生物分子结构信息: 运用运用ITC研究了研究了DNA结合蛋白的分子识别结合蛋白的分子识别一般认为：形成二聚体是酵母转录因子一般认为：形成二聚体是酵

30、母转录因子GCN4特异性识别其特异性识别其DNA结合位点的前提。结合位点的前提。以天然以天然GCN4的碱性区（的碱性区（226252）作为单体肽）作为单体肽GCN4M，以二硫键，以二硫键SS连连接的肽作为二聚体肽接的肽作为二聚体肽GCN4D，研究他们与天然蛋白，研究他们与天然蛋白GCN4的结合位点的结合位点AP1和和CRE的相互识别作用。发现：单体肽的相互识别作用。发现：单体肽GCN4M与与DNA的结合力较弱，但的结合力较弱，但是能够特异性识别是能够特异性识别DNA结合位点结合位点AP1和和CRE。 CCN4bZIP：天然肽：天然肽226281的一段序列；的一段序列； CCN4M：合成的从：合

31、成的从226252的一段序列，单体肽；的一段序列，单体肽； CCN4D：合成的从：合成的从226252的一段序列，二聚体肽；的一段序列，二聚体肽； AP1与与CRE：GCN4的两个主要识别位点；的两个主要识别位点； CONT：非特异性识别，作为参照的寡聚核苷酸序列。：非特异性识别，作为参照的寡聚核苷酸序列。 20时时GCN4-D和和GCN4-M与与AP-1的滴定反应和拟合曲线的滴定反应和拟合曲线 (a) GCN4-D滴定滴定AP-1； (b) GCN-M滴定滴定AP-1 ITC测定的反应热既包含结合反应又包含折测定的反应热既包含结合反应又包含折叠反应。肽与叠反应。肽与DNA结合过程伴随着肽的构

32、结合过程伴随着肽的构象折叠和疏水表面包埋。肽的构象中熵的损象折叠和疏水表面包埋。肽的构象中熵的损失对熵变的不利贡献大于溶剂效应产生的有失对熵变的不利贡献大于溶剂效应产生的有利贡献，由于包埋疏水表面时所引起的结合利贡献，由于包埋疏水表面时所引起的结合水的损失对熵变产生有利贡献，因此肽与水的损失对熵变产生有利贡献，因此肽与DNA结合过程中总的熵变对结合是不利的结合过程中总的熵变对结合是不利的 产生熵变的因素有：产生熵变的因素有：1）疏水作用产生的有利贡献；）疏水作用产生的有利贡献；2）肽与）肽与DNA形成复合物由于转动和平移自由度形成复合物由于转动和平移自由度 的减小引起的熵损失；的减小引起的熵损

33、失；3）结合过程中肽与）结合过程中肽与DNA的折叠或其他构象变化的折叠或其他构象变化 产生的不利贡献产生的不利贡献 GCN4和和GCN4M与与AP1和和CRE反应是焓驱动。反应是焓驱动。熵变对反应不利，而负的焓变补偿了不利的熵变。熵变对反应不利，而负的焓变补偿了不利的熵变。与熵的变化类似，反应自由能也包含肽链折叠所引与熵的变化类似，反应自由能也包含肽链折叠所引起的总的自由能的变化和结合反应自由能的变化。起的总的自由能的变化和结合反应自由能的变化。结合作用对自由能变化的贡献主要来自于肽与结合作用对自由能变化的贡献主要来自于肽与DNA间形成的氢键作用、间形成的氢键作用、van der waals作

34、用以及作用以及静电作用等静电作用等 其它应用其它应用 美国的Todd小组提出了用功率补偿型ITC测定酶动力学参数的两种新技术：(1) 将底物溶液不断滴入酶溶液中，以将底物溶液不断滴入酶溶液中，以维持准一级反应的条件；维持准一级反应的条件；(2) 将底物溶液一次滴入酶溶液将底物溶液一次滴入酶溶液中，连续监测底物被消耗时的热功率变化。这两种技术均中，连续监测底物被消耗时的热功率变化。这两种技术均基于反应速率和反应热功率成正比的原理，而且只需一次基于反应速率和反应热功率成正比的原理，而且只需一次实验即可获得高度精确的动力学参数实验即可获得高度精确的动力学参数(如米氏常数、酶转如米氏常数、酶转换数和抑

35、制常数换数和抑制常数)。这些技术被成功应用于测定二氢叶酸还原酶的氧化还原活力、己糖激酶的转换酶活力、幽门螺杆菌脲酶、胰蛋白酶和HIV-1蛋白酶的水解活力、肝素酶的裂解酶活力、丙酮酸羧化酶的连接酶活力 DSC &ITC 在药物研发中的应用在药物研发中的应用 药物研究开发周期简单划分为初筛、分析、设计、药物研究开发周期简单划分为初筛、分析、设计、合成和复筛，一个成功的新药上市平均需要合成和复筛，一个成功的新药上市平均需要15 年年的时间和巨额资金投入，约为的时间和巨额资金投入，约为8.8 亿美元。在开亿美元。在开发过程中，许多药物在临床发过程中，许多药物在临床II 期和期和III 期惨遭淘

36、汰，期惨遭淘汰，其主要原因是药物没有到达预期的靶点，从而产其主要原因是药物没有到达预期的靶点，从而产生毒副作用。生毒副作用。 在药物设计过程中在药物设计过程中,提前对药物的热力学性质进行提前对药物的热力学性质进行合理的评估和筛选合理的评估和筛选,避免在开发过程中、后期才发避免在开发过程中、后期才发现问题现问题,以减少药物开发成本。以减少药物开发成本。DSC 和和ITC 在新药在新药的研发过程中许多环节发挥筛选功能的研发过程中许多环节发挥筛选功能差示扫描量热技术（Differential Scanning Calorimetry） 差示扫描量热法是六十年代以后研制出的一种差示扫描量热法是六十年代

37、以后研制出的一种分析方法分析方法 年，美国的年，美国的WastonWaston和和ONeillONeill在分析化学在分析化学杂志上提出了差示扫描量热法（杂志上提出了差示扫描量热法（DSCDSC）的概念，并）的概念，并自制了自制了DSCDSC仪器不久，仪器不久， 美国美国Perkin-ElmerPerkin-Elmer公司公司生产了生产了DSCDSC商品仪器目前，商品仪器目前， DSCDSC堪称热分析三大堪称热分析三大技术中的主要技术之一技术中的主要技术之一差示扫描量热技术差示扫描量热技术: :在样品和参比同时程序升温度或降在样品和参比同时程序升温度或降温且保持两者温度相等的条件下，测量流入或

38、流出样品温且保持两者温度相等的条件下，测量流入或流出样品和参比物的热量差与温度关系的一种技术和参比物的热量差与温度关系的一种技术通过对试样因热效应而发生的能量变化进行及时补偿，通过对试样因热效应而发生的能量变化进行及时补偿，保持试样与参比物之间温度始终保持相同，无温差、无保持试样与参比物之间温度始终保持相同，无温差、无热传递，使热损失小，检测信号大。灵敏度和精度大有热传递，使热损失小，检测信号大。灵敏度和精度大有提高，可进行定量分析提高，可进行定量分析DSC仪器结构：仪器结构：1. 温度程序控制系统；2. 测量系统，用于样品物理量转换成电信号并放大；3. 数据记录、处理和显示系统；4. 样品室

39、，提供适当环境 DSC分析生物大分子结构变化的基础：分析生物大分子结构变化的基础： 在给定温度下每个体系总是趋向于达到自由能最小的状态，样品升温或降温的过程中，它可以转变成具有不同自由能的另一种结构状态。分析伴随着结构变化所发生的焓变化，就可以得到样品结构变化的某些信息两种主要类型两种主要类型(根据测量方法根据测量方法)：热流型（热流型（heat flow) DSC功率补偿型功率补偿型(power compensation)DSC用炉子控制环境温度，测量用炉子控制环境温度，测量通过康铜片流向试样和参比通过康铜片流向试样和参比物的热流之差。物的热流之差。热流型热流型DSC是属于热交换型是属于热交

40、换型的量热计，与环境的热量交的量热计，与环境的热量交换是通过热阻进行测量，测换是通过热阻进行测量，测量的信号是温差，其值表示量的信号是温差，其值表示交换的强度，并与热流速率交换的强度，并与热流速率 (=dQ/dt) 成正比。成正比。热流式差示扫描量热仪热流式差示扫描量热仪(heat flow DSC)：将试样焓变的将试样焓变的热通量几乎没热通量几乎没有什么损失地有什么损失地被多重热电偶被多重热电偶所测得所测得热通量式差示扫描量热仪热通量式差示扫描量热仪(heat flux DSC)Calvet热通量热通量DSC在试样支架和参比物支架附近的薄壁氧化铝管壁上安在试样支架和参比物支架附近的薄壁氧化铝

41、管壁上安放几十对乃至几百对互相串联着的热电偶，一端紧贴着管壁，另一端则放几十对乃至几百对互相串联着的热电偶，一端紧贴着管壁，另一端则紧贴着银均热块，将试样侧多重热电偶与参比物侧多重热电偶反接串联紧贴着银均热块，将试样侧多重热电偶与参比物侧多重热电偶反接串联在普通在普通DSC的程序控制加热的基础上，是在线性升、降温的程序控制加热的基础上，是在线性升、降温的基础上叠加一个正弦振荡温度程序，产生与之相应的循的基础上叠加一个正弦振荡温度程序，产生与之相应的循环热流。按此种方式，不仅可以测定总热流，并可将其分环热流。按此种方式，不仅可以测定总热流，并可将其分解成可逆成分与不可逆成分两部分。总热流是传统解

42、成可逆成分与不可逆成分两部分。总热流是传统DSC的的热流信号，可逆热流是热流的热容成分热流信号，可逆热流是热流的热容成分温度调制型差示扫描量热仪温度调制型差示扫描量热仪(Temperature Modulated DSC, TMDSC)：按试样相变按试样相变(或反应或反应)而形成的试样和参比物间温差的方而形成的试样和参比物间温差的方向来提供电功率，以使温差低于额定值，通常是小于向来提供电功率，以使温差低于额定值，通常是小于0.01 K功率补偿型功率补偿型DSC是属热补偿型量热计，待测的热量几乎是属热补偿型量热计，待测的热量几乎全部是由电能来补偿的全部是由电能来补偿的功率补偿型差示扫描量热仪功率

43、补偿型差示扫描量热仪(power compensation DSC)：热流型热流型DSCDSC热流型量热仪的起源可以追溯到热流型量热仪的起源可以追溯到18991899年年Roberts-Roberts-AustenAusten开发的开发的DTADTA。DTADTA技术是将样品和一种热惰性参技术是将样品和一种热惰性参比物一起承受同样的温度变化，在温度变化的时间范比物一起承受同样的温度变化，在温度变化的时间范围内连续测量样品和参比物的温度差。围内连续测量样品和参比物的温度差。19551955年，年，BoersmaBoersma将热电偶装在仪器中将热电偶装在仪器中( (而不是样品中而不是样品中) )

44、，得到了，得到了可重复的定量结果。样品产生的热通过一个仪器内部可重复的定量结果。样品产生的热通过一个仪器内部的固定的热通路流动，热量通过温度差来计算得到。的固定的热通路流动，热量通过温度差来计算得到。 杜邦杜邦910热流型热流型DSC杜邦杜邦910910热流型热流型DSCDSC是以是以BoersmaBoersma的设计原理为基础的的设计原理为基础的热流型热流型DSCDSC。该仪器的特点是样品和参比物平台都在一个完整的康该仪器的特点是样品和参比物平台都在一个完整的康铜盘上，在相同的功率下由一个热源加热，利用康铜铜盘上，在相同的功率下由一个热源加热，利用康铜盘把热量传输到样品和参比物，康铜盘同时还

45、作为测盘把热量传输到样品和参比物，康铜盘同时还作为测量温度的热电偶结点的一部分（一极）。量温度的热电偶结点的一部分（一极）。传输到样品和参比物的热流差通过样品和参比物平台传输到样品和参比物的热流差通过样品和参比物平台下的镍铬板与康铜板的结点所构成的镍铬下的镍铬板与康铜板的结点所构成的镍铬- -康铜热电康铜热电偶进行监控记录样品和参比物的温差。偶进行监控记录样品和参比物的温差。样品温度由镍铬板下方的镍铬样品温度由镍铬板下方的镍铬- -镍铝热电偶直接监控。镍铝热电偶直接监控。 这样热流型DSC实际上测定的量是样品与参比物的温差（T=TS-TR），然后根据热流方程，将T换算成dH/dt （热功率差）

46、作为信号的输出 热流型DSC特点：基线稳定；高灵敏度 图图 杜邦杜邦910910型型DSCDSC的原理图的原理图1.1.康铜板；康铜板； 2.2.热电偶结点；热电偶结点；3.3.镍铬合金板；镍铬合金板；4.4.镍铝丝；镍铝丝；5.5.镍铬丝；镍铬丝；6.6.加热块。加热块。 这种热流型这种热流型DSCDSC的等效热路示于下图。的等效热路示于下图。R R为样品和参比物的为样品和参比物的臂热阻，臂热阻，R Rb b为桥式热阻，为桥式热阻，R Rg g为通过净化气体的泄漏热阻，为通过净化气体的泄漏热阻，i iS S和和i iR R分别为样品和参比物的热流分别为样品和参比物的热流 杜邦杜邦910910

47、型型DSCDSC的等效热路的等效热路 根据根据Kirchoff定律，可得下列方程式定律，可得下列方程式:式中，式中，T T为炉温，为炉温，T TS S、T TR R分别为样品和参比物的温度。分别为样品和参比物的温度。 SbSRgSSiRTTRTTRTTRbRSgRRiRTTRTTRTT由上面两个式子可推出：由上面两个式子可推出： 其中其中 T=TT=TR R-T-TS S 从上式可以看出，样品和参比物的温度差从上式可以看出，样品和参比物的温度差 T T与热流差与热流差成正比。这样，经过适当的标定，即可从测量到的温差成正比。这样，经过适当的标定，即可从测量到的温差推算出热流差。推算出热流差。bg

48、RsRRRiiT211Calvet DSC也是一类有代表性的热流型也是一类有代表性的热流型DSC。在在Calvet DSC中，样品和参比样品室均由温差电堆环中，样品和参比样品室均由温差电堆环绕，这两个温差电堆连接在一起，方向相反，即可直接绕，这两个温差电堆连接在一起，方向相反，即可直接测量热流。测量热流。特点：样品与参照物之间的热通路及样品和环境之间的特点：样品与参照物之间的热通路及样品和环境之间的通路都是由测量温度的传感器热电堆构成的。环境和样通路都是由测量温度的传感器热电堆构成的。环境和样品及环境和参照样品间的热流由热电堆分别测量。品及环境和参照样品间的热流由热电堆分别测量。这两个等同的系

49、统放在一个均热块中，按照差热成对原这两个等同的系统放在一个均热块中，按照差热成对原则来使用位于测量系统和块之间的温差电堆，以此来抵则来使用位于测量系统和块之间的温差电堆，以此来抵销均热块的温度波动，并通过降低基线的波动来提高仪销均热块的温度波动，并通过降低基线的波动来提高仪器的灵敏度。器的灵敏度。 温差电堆本身既可以作为系统和环境之间的热传导通道，温差电堆本身既可以作为系统和环境之间的热传导通道，又可以从其接点的温差电势得到产生沿线圈的热流的温又可以从其接点的温差电势得到产生沿线圈的热流的温度差，由温度差求出热流。度差，由温度差求出热流。实际仪器中使用了大量的实际仪器中使用了大量的( (上千的

50、上千的) )温差电堆，这样不温差电堆，这样不仅可以减少热阻，而且可以从一系列温差电堆热流的总仅可以减少热阻，而且可以从一系列温差电堆热流的总和得到总热流，提高信号强度。和得到总热流，提高信号强度。在新型的在新型的Calvet DSCCalvet DSC中，大量的半导体温差电偶均匀中，大量的半导体温差电偶均匀分布在样品和参比样品室周围，半导体温差电偶同时起分布在样品和参比样品室周围，半导体温差电偶同时起温度测量和温度控制的作用。温度测量和温度控制的作用。CalvetCalvet量热仪的分辨率高量热仪的分辨率高( (对应于对应于1010 5 5K K的的 T T ，分辨率，分辨率为为1010 5

51、5W W或或1010 2 2J J以上以上) )，其缺点是时间常数比较大。其详，其缺点是时间常数比较大。其详细的测量原理这里就不再介绍了。细的测量原理这里就不再介绍了。功率补偿型功率补偿型DSC功率补偿型功率补偿型DSC的主要特点是分别用独立的加热器的主要特点是分别用独立的加热器和传感器来测量和控制样品和参比物的温度并使之相和传感器来测量和控制样品和参比物的温度并使之相等。或者说，根据样品和参比的温度差对流入或流出等。或者说，根据样品和参比的温度差对流入或流出样品和参比的热量进行功率补偿使之相等。样品和参比的热量进行功率补偿使之相等。它所测量的参数是两个加热器它所测量的参数是两个加热器输入功率

52、之差输入功率之差d(Q)/dt或或dH/dt。功率补偿型功率补偿型DSCDSC的结构的结构 功率补偿式差示扫描量热仪示意图功率补偿式差示扫描量热仪示意图零点平衡原理： Dynamic Sample ChamberReference PanSample PanLidGas Purge InletChromel DiscHeating BlockChromel DiscAlumel WireChromel WireThermocouple JunctionThermoelectric Disc (Constantan) 功率补偿型功率补偿型DSC 工作基于工作基于 “零位平衡零位平衡”原原理理 零

53、位平衡的原理零位平衡的原理: DSC 热系统可分为两个控制环路，其中一个环路作为平均温度控制，以保证按照一定的速率去升高样品和参比物的温度；第二个环路是用来保证当样品和参比物之间一旦出现温度差时能够调 节功率输入以消除 这种温度差 试样在加热的过程中，由于热效应与参比物之间出现温差时，通过差试样在加热的过程中，由于热效应与参比物之间出现温差时，通过差热放大电路和差热补偿放大器，使得流入补偿电热丝的电流发生变化：热放大电路和差热补偿放大器，使得流入补偿电热丝的电流发生变化： 当试样吸热时，补偿放大器使得试样一边的电流立即增大；当试样吸热时，补偿放大器使得试样一边的电流立即增大；反之则是反之则是参

54、比物一边的电流增大，直到两边的热量平衡，试样与参比物的温差参比物一边的电流增大，直到两边的热量平衡，试样与参比物的温差消失为止。消失为止。 这样通过连续不断地自动调节加热器的功率，总是可以使这样通过连续不断地自动调节加热器的功率，总是可以使样品托架的温度与参比托架的温度保持相同。样品托架的温度与参比托架的温度保持相同。 这时，有一个与输入到样品池的热流和输入到参比池的热流之间的差这时，有一个与输入到样品池的热流和输入到参比池的热流之间的差值成正比的信号值成正比的信号dH/dt 被馈送到记录仪中，同时记录样品和参比物的被馈送到记录仪中，同时记录样品和参比物的平均温度，将信号平均温度，将信号dH/

55、dt 对时间或平均温度作图就得到了功率补偿型对时间或平均温度作图就得到了功率补偿型DSC 曲线。曲线。 功率补偿型功率补偿型DSC特点：特点：精确的温度控制和测量；更快的响应时间和冷却速度；精确的温度控制和测量；更快的响应时间和冷却速度；高分辨率高分辨率 整个仪器由两个控制系统进行监控。整个仪器由两个控制系统进行监控。（1）控制温度，使样品和参比物在预定的速率下升）控制温度，使样品和参比物在预定的速率下升温或降温。温或降温。（2）用于补偿样品和参比物之间所产生的温差，这）用于补偿样品和参比物之间所产生的温差，这个温差是由样品的放热或吸热效应产生的。个温差是由样品的放热或吸热效应产生的。通过功率

56、补偿使样品和参比物的温度保持相同通过功率补偿使样品和参比物的温度保持相同 W=dQs/dt dQR/dt=dH/dt其中，其中， W为所补偿的功率为所补偿的功率; Qs为样品的热量；为样品的热量；QR 为为参比物的热量参比物的热量; dH/dt为单位时间内的焓变，即热流率，为单位时间内的焓变，即热流率，单位一般为单位一般为mJ/s。 仪器样品和参比物的加热器电阻相等，仪器样品和参比物的加热器电阻相等，RS=RR，当样，当样品没有任何热效应时品没有任何热效应时IS2 RSIR2 RR如果样品产生热效应，样品和参比物之间产生温差，如果样品产生热效应，样品和参比物之间产生温差，仪器立即进行功率补偿。

57、所补偿的功率为仪器立即进行功率补偿。所补偿的功率为: W=IS2RS IR2RR令令RS=RR=R，即得，即得: W=R(IS + IR)( IS IR)定义定义IS + IR = IT上式化为上式化为 W= IT(ISR IRR) W= IT(VS VR)=IT V式中，式中， IT为总电流，为总电流， V为电压差。为电压差。如果如果IT为常数，则为常数，则 W与与 V成正比。因此用成正比。因此用 V可直接表示可直接表示dH/dt。热量变化与曲线峰面积的关系热量变化与曲线峰面积的关系 考虑到样品发生热量变化（吸热或放热）时，此种变化除考虑到样品发生热量变化（吸热或放热）时，此种变化除传导到温

58、度传感装置（热电偶、热敏电阻等）以实现样品传导到温度传感装置（热电偶、热敏电阻等）以实现样品（或参比物）的热量补偿外，尚有一部分传导到温度传感（或参比物）的热量补偿外，尚有一部分传导到温度传感装置以外的地方，装置以外的地方，因而差示扫描量热曲线上吸热峰或放热因而差示扫描量热曲线上吸热峰或放热峰面积实际上仅代表样品传导到温度传感器装置的那部分峰面积实际上仅代表样品传导到温度传感器装置的那部分热量变化。热量变化。 样品真实的热量变化与曲线峰面积的关系为mH=KA m样品质量； H单位质量样品的焓变； A与H相应的曲线峰面积； K修正系数，称仪器常数。 典型的差示扫描量典型的差示扫描量热（热（DSC

59、）曲线以热）曲线以热流率（流率（dH/dt）为纵坐）为纵坐标、以时间（标、以时间（t）或温）或温度（度（T）为横坐标，）为横坐标，dH/dt-t（或（或T）曲线。）曲线。 曲线离开基线的位曲线离开基线的位移即代表样品吸热或移即代表样品吸热或放热的速率（放热的速率（mJs-1），而曲线中峰或），而曲线中峰或谷包围的面积即代表谷包围的面积即代表热量的变化。热量的变化。 因而因而差示扫描量热差示扫描量热法可以直接测量样品法可以直接测量样品在发生物理或化学变在发生物理或化学变化时的热效应化时的热效应。典典型型的的DSC曲曲线线在在DSC 分析中蛋分析中蛋白质变性过程的白质变性过程的基本参数有基本参数有

60、: 蛋白质的变性温度Tm ,蛋白质变性的热容Cp,蛋白质变性的焓H（见右图）。 此外,曲线上峰面积与峰高的比值可用于表示蛋白质结构中间态的情况 DSC曲线图 差示扫描量热仪结构差示扫描量热仪结构热分析仪大致由下列几部分组成：热分析仪大致由下列几部分组成：温度程序控制系统：整个实验过程中温度变化的顺温度程序控制系统：整个实验过程中温度变化的顺序、变温的起始温度和终止温度、变温速率、恒温序、变温的起始温度和终止温度、变温速率、恒温温度及恒温时间等的控制温度及恒温时间等的控制测量系统测量系统( (物理性能的测量物理性能的测量) )：将样品的某种物理量：将样品的某种物理量转换成电信号，进行放大，用来进一步处理