肿瘤标志物检测与临床

1、肿瘤标志物检测与临床http:/www.bio-  应用实例  2004年8月19日在肿瘤的研究和临床实践中，早期发现、早期诊断、早期治疗是关键。肿瘤标志物（Tumor   Marker   TM）在肿瘤普查、诊断、判断预后和转归、评价治疗疗效和高危人群随访观察等方面都具有较大的实用价值。自80年代以来，随着应用B淋巴细胞杂交瘤制备肿瘤单克隆技术的不断成熟，出现了大量的抗肿瘤的单克隆抗体，并与同时出现且日新月异的免疫学检测技术（RIA、IRMA、ELISA、CLIA、IFA、TRFIA等）相结合，发展了众多的肿瘤标

2、志物检测项目并不断地应用于临床，已成为肿瘤患者的一个重要检查指标。1、   概述           1.1   一般而论，肿瘤标志物主要是指癌细胞分泌或脱落到体液或组织中的物质，或是缩主对体内新生物反应而产生并进入到体液或组织中的物质。这些物质有的不存在于正常人体内只见于胚胎中，有的在肿瘤病人体内含量超过正常人体内含量。通过测定其存在或含量可辅助诊断肿瘤、分析病程、指导治疗、监测复发或转移、判断预后，这类TM称为体液TM。随着分子生物学技术的发展，从分子水平发现基因结构或功

3、能的改变以及具有一定生物学功能的基因产物的非正常表达均与肿瘤的发生、发展密切相关，所以测定癌基因、抑癌基因及其产物也属TM之列。由于这些物质存在于细胞膜上或细胞内如激素受体、生长因子受体、白血病表型、分子基因等，故把这类物质称为细胞TM。由于肿瘤发生发展的原因至今不明，因此，TM的定义还有待于进一步的完善。           1.2   "理想"的肿瘤标志物的特点：所谓"理想"的肿瘤标志物，一般认为应具有下列特点：(1)敏感性高，能早期测出所有肿瘤患者；

4、(2)特异性好，鉴别肿瘤和非肿瘤患者应100准确；(3)有器官特异性，能对肿瘤定位；(4)血清中浓度与瘤体大小、临床分期相关，可用以判断预后；(5)半衰期短，能反映肿瘤的动态变化，监测治疗效果、复发和转移；(6)测定方法精密度、准确性高，操作简便，试剂盒价廉。但至今为止，尚无一种"理想"的TM。由于肿瘤基因的复杂性，没有一种肿瘤是单一类型的，故发现"理想"的TM就十分困难。2、   肿瘤标志物的分类及临床应用肿瘤标志物用于临床诊断的有许多种，粗粗分类有癌胚抗原类、酶类、激素类、糖蛋白类、癌基因类和细胞表面肿瘤抗原类等6大类。前4类称为

5、血清肿瘤标志物，后两类称细胞肿瘤标志物，目前大都已可用于临床检测。           2.1   血清肿瘤标志物           2.1.1   胚胎性蛋白           甲胎蛋白(AFP)：           

6、AFP在胚胎期是功能蛋白，合成于卵黄囊、肝和小肠，脐带血含量为10005000g/L，1年内降为成人水平40g/L，终生不变。AFP在临床上用于以下辅助诊断：(1)产前诊断胎儿宫内死亡、神经管畸形、无脑儿和脊柱裂。(2)急慢性肝炎，在1100例肝炎患者测定中发现167%AFP20-90g/L，8790-400g/L，28400-1000g/L，其中1例维持1000g/L以上达6周，后逐步下降。(3)原发性肝细胞癌约70以上AFP在400g/L以上，多逐渐升高，亦有不高于400g/L，甚至在正常水平的患者。          

7、 AFP异质体，是指肝细胞癌产生的AFP与新生肝合成的在糖基链的量上有区别，因此可用Con-A(刀豆凝集素-A)来区别，异质体亲和力大，胚胎AFP则亲和力小，可用电泳方法来区别肝细胞来源与肝癌细胞来源的AFP。           癌胚抗原(CEA)：           CEA是一种酸性糖蛋白，胚胎期在小肠、肝脏、胰腺合成，成人血清含量极低(<5g/L   ，29如吸烟者为15-20g

8、/L，65可达20-40g/L   )。   CEAl965年被发现时，认为是结肠癌的标志物(60%-90患者升高)，但以后发现胰腺癌(80%)、胃癌(60)、肺癌(75)和乳腺癌(60)也有较高表达。           2.1.2糖蛋白抗原           是由于细胞膜成分异常糖基化而形成的抗原。          &#

9、160;糖蛋白抗原CA50：           是一种唾液酸酯和唾液酸糖蛋白，正常组织中一般不存在，当细胞恶变时，糖基化酶被激活，造成细胞表面糖基结构改变而成为CA50标志物。正常血20g/L，许多恶性肿瘤患者血中皆可升高，如666的肺癌、882的肝癌、689的胃癌、885的卵巢或子宫颈癌、944胰或胆管癌，其他如直肠癌、膀脏癌等皆有70以上是升高的。           2   .1.2. 

10、0; 2   CA125：           最初认为是卵巢癌特异的，但深入研究，它也是一种广谱的标志物。正常值以35Uml为界，822卵巢癌、58胰腺癌、32肺癌，及其他非妇科肿瘤皆有不同程度的升高，但作为卵巢癌的辅助诊断是个重要的标志物，与病程有关。              CAl5-3：        

11、  是乳腺细胞上皮表面糖蛋白的变异体，近年推出作为乳腺癌标志物，正常40Uml哺乳期妇女或良性乳腺肿瘤皆低于此值。乳腺癌晚期100，其他   期75%此值明显升高。同样，该标志物也是广谱的，可见于50肝细胞癌、53肺癌、34卵巢癌患者。由于CEA在乳腺癌中也有诊断价值，如两者联合将可提高10阳性率。           CA19-9：           CAl9-9为唾液酸化的乳-

12、N-岩藻戊糖II，是一种类粘蛋白的糖蛋白成分，与Lewis血型成分有关。血清内正常值37UmL(95)，异常升高也是在多种肿瘤出现，如79%胰腺癌、58%结肠癌、49肝癌、67胃癌、67如胆囊癌、肺癌、乳腺癌皆有10左右是升高的。           CA549：           CA549也是乳腺癌的标志物，它是一种酸性糖   蛋白，大部分健康女性11Uml，异常升高者比例并不高，可见于50乳腺癌

13、、卵巢癌、40%前列腺癌、33肺癌患者。由此，作为乳腺癌的早期诊断，CA则还较欠缺，应联合应用其它TM。           CA72-4：           CA72-4是一种高分子量糖蛋白，正常人血清中含量6Uml，异常升高在各种消化道肿瘤、卵巢癌均可产生。对于胃癌的检测特异性较高，以6Uml为   临界值。良性胃病仅1者升高，而胃癌升高者比例可达426，如与CAl9-9同时检测，阳性率可达56。

14、              鳞状细胞相关抗原(SCC)           是由宫颈癌细胞中提纯的，是宫颈癌较好的肿瘤标志物。   SCC在正常鳞状上皮细胞内也存在，随着鳞状上皮细胞的增殖(恶性)而释放入血。正常人血清水平2g/L。异常升高可见于宫颈鳞癌，21宫颈腺癌也有升高。肺鳞癌有较高的阳性率，各家报告从40-100不等，而小细胞肺癌阳性率则较低(37)。食道鳞状上皮癌、口腔鳞状

15、上皮癌皆有较高的阳性率，且随肿瘤的分期呈现不同变化(20-80)。可见SCC是鳞状上皮癌的重要标志物。              CA242：           是一种粘蛋白型糖抗原，可作为胰腺癌和结肠癌校好的肿瘤标志物，其灵敏度与CA19-9相仿，但特异性、诊断效率则优于CA19-9。           

16、   NMP22：        系核基质蛋白（nuclear   matrix   protein）是膀胱癌的一种新的标志物，检测尿NMP22可鉴别良恶性膀胱疾病。        2.1.3   蛋白质抗原              细胞角蛋白19   （CYFR

17、A21-1）:     细胞角蛋白是细胞体的中间丝，根据其分子量和等电点不同可分为20种不同类型，其中细胞角蛋白19在肺癌诊断中有很大价值，是小细胞肺癌的重要标志物。在肺癌的血清浓度阈值为22g/L，其敏感性、特异性及准确性分别为577、919和649。从组织学角度看，鳞癌的敏感性   (765)较腺癌(478)为高，也高于SCC对两者的诊断率。细胞角蛋白19与CEA联合应用，诊断非小细胞肺癌符合率已可达到78。           

18、60; 2-microglobulin：           表达在大多数有核细胞表面，是HLA-A、B和-C抗原的一分子量为11800链。临床上多用于证实淋巴增殖性疾病，如白血病、淋巴瘤及多发性骨髓瘤。其水平与肿瘤细胞数量、生长速率、预后及疾病活动性有关。例如骨髓瘤2-microglobulin水平高于4O   mgL时，预示生存时间短，高于60mgL时，对化疗反应不敏感。此外，根据此水平还可为骨髓瘤患者分期。        

19、;      Ferritin：           是一种铁结合蛋白，存在于各种组织，病理状态下，释放到血液增加，不是肿瘤特异的标志，在多种癌症患者血中均有不同程度的阳性率，肝癌患者的阳性率在70以上，所以可辅助肝癌诊断。此外，在进展性乳腺癌思考Ferritin水平也有显著升高，且与病程有关。              前列腺特异性抗原(PSA)：

20、        PSA是目前诊断前列腺癌最敏感的指标，可用于前列腺癌的早期诊断、监测治疗及预测复发。PSA是由前列腺上皮细胞产生的一种大分子糖蛋白，它具有极高的组织器官特异性。正常人体血清内PSA   4g/L，这个正常值有随年龄增长的趋势。50岁者一般低于40g/L，50-55岁为44g/L，60-69岁为68g/L，70岁可达77g/L，异常升高预示有患前列腺癌的可能。以   4g/L为临界值，早期前列腺癌63-70阳性，总阳性率可达69-925。有报告，PSA值如为40-100g/L，特异

21、性相对较低，只有25确诊前列腺癌；但10Og/L者，往往又是晚期前列腺癌，失去早期治疗时机，这是个急待解决的问题。PSA在血清中以多种形式存在，它主要与蛋白酶抑制物形成复合物。然而，另一种PSA即游离PSA(f-PSA)，不与蛋白酶抑制物结合。由于未知的原因，前列腺癌患者血清f-PSA百分比比正常人和前列腺良性疾患为低。因此，测定PSA的类型和百分比有利于鉴定前列腺良性和恶性疾患，f-PSA百分比较低可能是前列腺癌恶性度较高。而f-PSA百分比受年龄、前列腺大小和总PSA(tPSA)水平影响，据报告，50-55岁   f-PSA临界值应20，60-69岁应20，70-75岁

22、28，固定临界值应是25(占PSA的量).有报告773例经组织学证实的患者(379例前列腺癌，394例良性前列腺病)f-PSA在02-50g/L，百分比从20-52，而前列腺癌组为12%，良性组为18。   国内报告，如以t-PSA42g/L为诊断标准，其敏感性   为   l00%，特异性仅   68%，符合率为74；如以fPSAtPSA(FT)值O11为诊断标准，其敏感性为85%，特异性98，符合率96；如以tPSA42g/L，同时FT011为诊断标准，其敏感性为86%，特异性为99，符合率97%。可见，最后一

23、个指标为最佳。           2.1.4   酶类           神经原特异性烯醇化酶(NSE)：           血清NSE是神经内分泌肿瘤的特异性标志，如神经母细胞瘤、甲状腺髓质癌和小细胞肺癌(70升高)。正常人血清NSE水平125Uml目前，NSE已作为小细胞肺癌重要标志物之一。  

24、            前列腺酸性磷酸酶（PACP）：           主要用于诊断前列腺癌，但诊断价值不及PSA。           2.1.5   激素类              -HCG： 

25、;          是一存在于胎盘中的糖蛋白激素，分于量为45000，当怀孕时血与尿中水平上升，正常血中只含微量。以特殊的免疫试验可测定HCG的亚单位。由于60以上的非精原细胞瘤患者体内HCG上升，所以-HCG的测定可监视非精原细胞瘤的治疗反应及复发状况，甚至有些肿瘤复发可在临床体征出现前几周或几个月通过测定HCG查出。对于妇科恶性肿瘤，除了测定完整的HCG、游离的亚单位外，还可测定尿与血中的促性腺激素的片段，称之为核心(-core)。联合测定尿中-core与血中CAl25可对临床卵巢癌的诊断提供有意义的信息。 

26、             人胎盘催乳素(HPL)           促肾上腺皮质激素(ACTH)           生长激素(GH)           甲状旁腺激素(PTH)   

27、0;    2.2组织肿瘤标志物        检测细胞与组织内的肿瘤标志对于认识肿瘤的类型及形成治疗的生物靶位均有帮助。组织肿瘤标志可粗略分为以下4类：(1)分化标志：激素受体，如：唯二醇受体(ER)、孕酮受体(PR)等。(2)增殖标志：细胞周期相关抗原(Ki67)、PCNA、生长因子及其受体，周期素(cyclin)，周期素依赖的蛋白激酶(CDKs)及CDKs的抑制蛋白(CKIs)等。(3)转移潜在性标志：蛋白酶-脲激酶血纤维蛋白溶酶原激活剂与组织蛋白酶D，nm23基因产物-一种核苷酸二磷酸激酶，以及细

28、胞粘附因子等。(4)癌基因及抗癌基因：癌基因如：myc、H-ras、erbB2等，抗癌基因如：p53、bcl-2、视网膜母细胞瘤克隆出的基因(Rb)及结肠癌抑癌基因(DCC)等   。虽然，这些组织肿瘤标志将来有希望在肿瘤临床中成为诊断、预后判断及调整治疗的工具，但绝大多数在目前还仅处于研究观察阶段。目前，正式用于临床的只有乳腺激素受体的测定。对决定乳腺癌的治疗方案具有重要意义。80年代初就有报道：ER(-)PR(-)采用   内分泌治疗有效率为9，ER(十)PR(-)为32，ER(-)PR(十)为53，ER(十)PR(十)为71，因此，测定乳腺组织中的

29、ER与PR对于预示内分泌治疗的效果、决定治疗方案是极其重要的。        2.3   肿瘤标志物的临床应用价值        2.3.1普查：        如果一种TM能满足上述"理想TM"标准的第1、2点，则   该标志物可用于普查，但实际上没有一种TM的特异性和灵敏度均能达到   lOO，从而使TM用于普查受到限制。以癌胚抗原(

30、CEA)普查一组结肠癌为例，发病率为3710万，假阳性数高达4998人，而检出的结肠癌患者只有26人。因此，这一类TM一般不适宜对无症状的人群进行普查。但某些TM用于高危人群的普查。如在乙型肝炎表面抗原(HBsAg)携带者和肝硬化患者中检测甲胎蛋白。           用IM进行普查应考虑下列原则：(1)应十分清楚该肿瘤的发病率，(2)该肿瘤标志物应能检测早期肿瘤，(3)该肿瘤的早期治疗应比晚期治疗更经济有效，(4)测定方法的灵敏度、特异性和重复性良好，(5)普查所需费用能被接受。  

31、60;       2.3.2定位：        TM基本上不能对肿瘤定位，因为绝大多数TM无器官特异性，只有极少数的TM如前列腺特异抗原(PSA)，前列腺酸性磷酸酶(PAP)，具有器官特异性，只可惜这些指标虽能进行器官定位，但不具肿瘤特异性。           2.3.3确诊：           由于TM无足够的灵敏度，

32、不能排除假阴性结果，同时还有假阳性的可能，因此，通常不能单凭TM进行确诊。但本周蛋白、AFP、-HCG)和降钙素等有助于确诊。           2.3.4分期：           大多数TM与疾病分期有关，且浓度与肿瘤大小(如结肠癌CEA浓度与肿瘤大小有关)或分期(如几乎所有的TM在肿瘤晚期时呈现较高的浓度)之间通常存在着关联，但这只是总体而言。由于各期TM的浓度范围极广，且互相重叠，因此，并不能根据个体测得值来判断肿瘤大小，也不

33、能以TM的浓度来精确地指示各期肿瘤。           2.3.5疗效监测：        TM最重要的价值，是能明确手术、放疗或药物治疗是否有效。有的TM可反映肿瘤残存量，这种定量关系十分重要，如用-HCG监测绒毛膜癌的疗效、检测抗药性和推断"零肿瘤细胞"(检测极限以下)，以决定何时停止治疗的报道就是最好的例子。           任何标志物半寿期显著

34、超过"正常"半寿期，均与残留肿瘤不断产生TM有关，表示手术切除得不完全，或肿瘤抗药，或肿瘤复发。虽然目前尚无一种能被普遍认可的、用TM浓度来评价治疗有效性的标准，但Beastall提出的方案是值得重视的，即：无效：则浓度与治疗前相比下降50；改善：TM浓度与治疗前相比下降50如；有效：TM浓度与治疗前相比下降90；显效：TM浓度下降至非恶性肿瘤的参考值内。           治疗中或治疗后TM浓度变化有3种基本类型：(1)浓度下降到正常水平，提示肿瘤全部除去或病情缓解；(2)浓度明显下降但仍持

35、续在正常水平以上，或短期下降到正常水平后又重新增高，提示有肿瘤残留和(或)肿瘤转移；(3)浓度下降到正常水平一段时间(约数月)后，又重新增加，提示复发或转移。应注意，如化疗、放疗或手术后立即测定TM浓度，可能会有短暂的升高，这是由于肿瘤坏死所致。另外，化疗、放疗或手术后TM浓度重新恒定升高，可能表示治疗无效，应尽可能改用其他治疗方式。并不是同一器官的肿瘤均表达相同的TM，为了确定何种TM适宜监测疗效，最好在手术前检测一组TM，然后选择升高的TM作为监测指标。但是，即使某些TM在手术前浓度并不增加，也可能可以作为预示复发和转移的指标。少数肿瘤也可采用组合TM来进行监测，如AFP和HCG监测睾九癌

36、。           2.3.6预后：           术前TM浓度增加，术后浓度降低，表示这些TM对此肿瘤具有预后价值。特别在病程监测中，TM的浓度增加或降低与疾病的预后密切相关。如睾九癌时以   HCG和AFP作为预后指标，HCG50KUL或AFP500   ng/ml的4年生存率为96，HCG50KUL或AFP500ng/ml的4年生存率为56。另外，结肠癌时CEA浓度、非何杰金淋巴瘤

37、(特别是多发性骨髓瘤)时微球蛋白、卵巢癌时CA125等都有预后的价值。           2.3.7预测：           TM另一重要的特性就是预测价值，其依据是Bayes法则。可用阳性预期值(PPV)和阴性预期值(NPV)来表示。PPV与NPV不仅与灵敏度与特异性有关，还与人群的患病率有关。某一TM的灵敏度、特异性、PPV、NPV不是固定不变的，而是依赖于选定的临界值。将临界值提高，可增加特异性，但灵敏度随之降低；反之，将临界

38、值降低，则灵敏度提高，但特异性下降。对TM而言，以正常参考值表示已基本无意义，通常以临界值来表示。因为，在实际应用中考虑的是最佳临界值，即区分"正常的分界限。它不同于正常参考值的运用，正常参考值来自一组对照人群，而临界值是根据金标准确诊为患者和正常对照组两组人群所确定的。3、   肿瘤标志物测定方法及影响因素           3.1   TM的测定方法           3.1.1

39、   血清TM的测定方法：           RIA、IRMA、ELISA、CLIA、IFA、TRFIA。特别是CLIA的应用，使TM的测定更加准确、快速、结果稳定。           3.1.2   细胞TM的测定方法：           免疫组织细胞化学法、流式细胞术、放射免疫显像。特别是流式细胞术的应用，使

40、定量检测细胞TM方面发挥了较大的优势。           3   .2   TM测定的影响因素        3.2.1体内因素：           肝、肾功能异常和胆汁淤滞等均可造成TM浓度增高，如CEA、AFP。风湿病时CAl9-9浓度可增高，强烈的治疗作用(手术、放疗、化疗)和连续的细胞死亡、肿瘤部位供血障碍等均可导致TM浓度变

41、化。某些药物会影响TM的浓度，如前列腺癌抗雄激素治疗可抑制PSA产生。另外，已发现屡次进行直肠检查后，PSA和PAP值可升高，因此采血前不应进行直肠检查。           3.2.2体外因素：        血清是测定肿瘤标志物最常用的样品，但由于血液的稀释作用，检测的阳性率有一定的局限性，若能直接收集肿瘤组织或其附近组织分泌的体液进行测定，可提高检测灵敏度和特异性。例如，经内窥镜采集胰液测定以19-9、CA72-4含量，可明显提高胰腺癌的检出率。同样

42、，如用乳汁作为CA15-3和CEA的测定样品，则乳腺癌的阳性检出率也比用血样品大大提高。   汗液、唾液和其他体液中均含有鳞状上皮细胞癌抗原(SCC)，因此，检测SCC抗原时，如污染上述体液可造成假性升高结果。红细胞、浆细胞和血小板中存在神经特异性烯醇化酶(NSE)，因此样本在离心前放置一段时间(60-90min)，血液中NSE浓度可能增高。另外，血清保存于室温中，PAP可因抗原不稳定而在几小时内降解。有些TM如CAl5-3对蛋白酶和神经酰胺酶很敏感，因此，血清样本应避免微生物污染，以免影响测定结果。        

43、;   引起假阳性的因素（1）在良性疾病时，如炎症性疾病会使一些肿瘤标志表达增加。肝脏良性疾病时，   AFP、CA19-9，   CEA和肿瘤多肽抗原及肾功能衰竭的2-微球蛋白及CAl5-3、19-9、CEA和PSA水平均会升高。（2）有一些生理变化，如妊娠时   AFP、CAl25、人绒毛膜促性腺激素和月经时CAl25也会升高。（3）在肿瘤手术治疗、化疗和放疗过程中，由于肿瘤组织受到破坏或肿瘤坏死时某些肿瘤标志产生增加，从而影响肿瘤标志的测定，造成假阳性。引起假阴性的因素（1）产生肿瘤标志的肿瘤细胞数目少。（2

44、）细胞或细胞表面被封闭。（3）机体体液中一些抗体与肿瘤标志(肿瘤抗原)形成免疫复合物。（4）肿瘤组织本身血循环差，其所产生肿瘤标志物不能分泌到外周血中。此外，血标本的采集，贮存不当也会影响肿瘤标志测定的结果。4、   肿瘤标志物的合理应用及注意事项           4.1动态记录IM的浓度变化：           TM测定的临床价值在于动态观察，有时即使在参考值范围内的浓度变化，可能也是有价值的。某些肿瘤如术后

45、CEA浓度快速增高(每6个月4g/L)表示骨和肝转移，而术后CEA浓度缓慢增加(每6个月2-4g/L)表示脑、软组织和皮肤转移。因此，每个患者总是最佳的自身对照。但为了保证结果的可靠性，当测得的TM浓度增加时，应在短期内(14-30d)进行重复测定。           4.2定期测定TM浓度：           应根据不同的患者，不同的肿瘤制定不同的测定时间表。一般而言，治疗前应测定每个患者TM的原始值，治疗后第1-2年，应每月测定(测定时间应根据TM的半衰期，通常在2-14d完成)，至则浓度明显下降后，每3个月测定1次。第3-5年，应每年测定1-2次。第6年起，每年1次。但每次改变治疗之前、TM浓度增加或怀疑复发和转移时，均应及时测定TM浓度。           4.3合理选用TM：           同一肿瘤可含有一种或多种TM，而不同或同种肿瘤的不同组织类型既可有共