快速诊断技术

1、快速诊断技术. y# y5 y% H8 5 y) ( Y主要内容：  D, F/ ! 2 G(   P. 5 # E1免疫胶体金基本原理3 B7 0 h# B( D1 X) L1 2胶体金制备方法及标记技术分类' ?- 4 k! j4 b3胶体金标记实验步骤0 g, r0 j  n* Z* ( F4胶体金制备注意事项及应用1 C6 S  E+ l3 y3 5胶体金标记技术. X% C; O6 $ R/ i& F# F# T6制作胶体金试纸的硝酸纤维素膜选择及应用技巧7 C2 E: a9 d1 r+

2、A1 3 q, p7免疫荧光技术基本原理8 e* Z1 D6 G6 _: k2 l8免疫荧光实验方法及分类6 P, t9 M1 i6 z' t; i9免疫荧光实验步骤7 A& . i" Z- e% a10免疫荧光常见问题, u! M/ " I- g7 V3 H- m# y! Q11细胞因子检测原理+ S! H9 1 d:   n$ n12细胞因子检测方法分类- c$ o8 M/ l3 q9 o13细胞因子检测技术应用+ Z) X0 _/ ; T0 v; b9 h3 V14ELISPOT技术原理: S) Y- M. p  

3、;/ V/ Z* G3 w; " T15ELISPOT技术实验步骤4 d& T' 8 i( x7 E$ ' L16ELISPOT技术优势及应用' U8 F5 Q9 I9 T; B& U" _0 h4 w4 i  U7 j, s声明：% M8 M' |8 ( r( j& 1、本篇涉及的资源主要源于网络及相关书籍，由酷友搜集、分析、整理、审改，供大家学习参考用，如有转载、传播请注明源于基因酷及本篇的工作人员；若本篇侵犯了您的版权或有任何不妥，请Email genecool告知。0 E% Y) , L;

4、E0 P0 _2、由于我们的学识、经验有限，本篇难免会存在一些错误及缺陷，敬请不吝赐教：请到基因酷论坛（ genecool。6 ?7 R$ |" / j( w) 致谢：( P3 d& n" v. R$ y4 G整理者：microfox          审改者：wny+ I4 5 , I2 v; x# p/ & |. s7 t5 J! b! P主要参考资料：9 J* N2 T$ U) ; x8 V现代临床免疫学 赵武述  J0 2 f) D* U- E" b# w, t

5、1 G免疫胶体金技术基本原理及其在疾病检测中的应用进展  李忠秋 马红 郭镇华 吴赛辉 刘娣- j. Q3 _/ w+ i4 M; F免疫荧光基础实验新原理及其临床 德）斯托尔希（Storch，W.B.）主编，阮幼冰 主译( z% I  I! a9 H细胞因子检测技术进展  李梅 宋达琳 康维强0 R: " d0 w3 a) k8 t0 A6 快速诊断之免疫胶体金基本原理免疫胶体金基本原理& j& ) Y; P# ?# a1 D& K2 A' O5 V; T* z& Q' R2

6、 9 k% K       胶体金是一种常用的标记技术，是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，有其独特的优点。近年已在各种生物学研究中广泛使用。在临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。同时在流式、电镜、免疫、分子生物学以至生物芯片中都可能例用到。' 1 L( ?) s. |# Z0 N3 J       1971年Faulk 和Taytor将胶体金引入免疫化学，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。目前在医学检验中的应用主要是免疫层析法(

7、 immunochromatogra-phy)和快速免疫金渗滤法(Dot-immuogold filtration assay DIGFA)，用于检测 HBsAg、HCG 和抗双链抗体等，具有简单、快速、准确和无污染等优点。 * r/ N) N' h& x免疫胶体金技术的基本原理3 L/ M: q1 _, d; t% J$ W" k       胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成

8、为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。; " / - p* % m% m       胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。2 u4 e! Q# E, $ a4 I4 S      

9、 胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。 7 & b3 p8 w2 w  b# O       免疫金标记技术(Immunogold labelling tech

10、ique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。8 h0 W1 D0 N, e0 S/ Y5 P' c: G. a常用的免疫胶体金检测技术 * U" J2 D- |- G（1）免疫胶体金光镜染色法 ' E4 s) q, f' s4        细胞悬液涂片或组织切片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记

11、的基础上，以银显影液增强标记，使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。 # 8 I4 . w9 n( S$ l免疫胶体金电镜染色法 1 L"   U: L% o  i       可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组织超薄切片结合，然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。 ' $ b) D- B, ?（2）斑点免疫金渗滤法 - e8 c! & N8 % m( f       应用微孔滤膜（如膜）作载体，

12、先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应的抗原或抗体。 & a/ W$ e. C* B5 W（3）胶体金免疫层析法 - W) ' 5 x6 u- E7 w"        将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂（抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已

13、发展成为诊断试纸条，使用十分方便。+ c7 D4 S+ 2 Y& 胶体金制备方法及标记技术分类胶体金制备方法2 , d) b3 + t3 e( x; 4 |       胶体金的制备一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。根据不同的还原剂可以制备大小不同的胶体金颗粒。常用来制备胶体金颗粒的方法如下。5 S. p8 b  ?% k, w' r（1）枸橼酸三钠还原法1 Y! |5 O- e# 2 D- s4 f( U' D( z      

14、1）10nm胶体金粒的制备：取0.01HAuCl4水溶液100ml，加入1枸橼酸三钠水溶液3ml，加热煮沸30min，冷却至4，溶液呈红色。6 z, J! ?! t& B# t       2）15nm胶体金颗粒的制备：取0.01HAuCl4水溶液100ml，加入1枸橼酸三钠水溶液2ml，加热煮沸15min30min，直至颜色变红。冷却后加入0.1Mol/L K2CO30.5ml，混匀即可。/ O1 I- c& r' k& a$ x" T0 m&        3）

15、15nm、18nm20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备：取0.01HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入1枸橼酸三钠水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、1820nm、30nm和50nm。6 f3 v4 v: F2 b+ B* 6 X2 X（2）鞣酸枸橼酸钠还原法+ R9 E8 W5 ) M1 z6 % w1 t       A液：1HAuCl4水溶液1ml加入79ml双馏水中混匀。" E* r% 7 v5 M7 S% 1 f 

16、     B液：1枸橼酸三钠4ml，1鞣酸0.7ml，0.1Mol/L K2CO3液0.2ml，混合，加入双馏水至20ml。0 v' Z/ O' q3 V: Q       将A液、B液分别加热至60，在电磁搅拌下迅速将B液加入A液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变成亮红色。此法制得的金颗粒的直径为5nm。如需要制备其它直径的金颗粒，则按表15-1所列的数字调整鞣酸及K2CO3的用量。# v8 X, w* N- |/ b8 e6 J       表1鞣酸枸橼酸钠还原法试

17、剂配制表% g" k4 9 |' V# Z; K/ H# ?4 K1 Z8 l  J% L$ 5 O+ f金粒直径/ R' q! g/ K+ h" E& k# y( Y) |（nm）+   3 u! u# R1 - b& ; P9 J% A液% u) V( V' ?# R1 tB液. c2 d' N7 ! K  K2 N1 t+ r. . c5 p1HAuCl4  8 K7 w9 C0 8 O双馏水1 I( 3 S4 M+ f9 U& w*

18、 q1枸橼酸三钠$ N: e2 g! J& R7 p' F3 & S1 o0.1Mol/L5 V$ l8 F' . 9 v" UK2CO36 T1 m( / c' " 1鞣酸- |9 M6 t8 D7 E+ e, d; U% A双馏水( q0 p1 U& q# C8 A! M! j; 54 ?/ A2 o: p. & F" ( M7 z: g1( x0 y$ K7 k% W. 7 Q  |( l% _0 79& b4 N% D!   e46 I. c&

19、1 |4 1 D0.20+ c4 o$ |) f' o: W' ' A6 W0.70: O-   a$ A; b( W4 15.10& j7 a! c! 5 G3 10! |# n* ' y% n2 1 Y3 b1' e4 S3 |7 l3 0 _& D797 q% ?  k+ o0 ?5 L1 L- ' s' V' Z4, X$ h2 q* $ q/ q% 0.0259 s- g'   * k/ e6 F0.10% E6 O! W/ K7 A(

20、W: A15.875. F. , t" n: / l( I+ a0 w152 _$ d) ( g$ 7 & P$ _* % W; 14 M9 y) z9 I, X3 y9 Y79' 7 c" ?' S( c3 Y) / X0 m7 y43 b7 c' j0 D( : D0.00256 T, m# $ d# 1 x0.01) w8 H0 ) J6 u. h4 S! 7 |15.9875* ( V" G- . L! V/ t9 y+ * e0 a& . C& G+ f* 7 w（3）柠檬酸三钠还原法制备金溶胶： % m(

21、 ! D! _$ z7 2 j7 ?6 * w9        取0.01氯金酸水溶液100ml 加热至沸，搅动下准确加入柠檬酸三钠水溶液 0.7ml，金黄色的氯金酸水溶液在分钟内变为紫红色，继续煮沸15分钟，冷却后以蒸馏水恢复到原体积，如此制备的金溶胶其可见光区最高吸收峰在535nm，1cm / 535 = 1.12 。金溶胶的光散射性与溶胶颗粒的大小密切相关，一旦颗粒大小发生变化，光散射也随之发生变异，产生肉眼可见的显著的颜色变化，这就是金溶胶用于免疫沉淀或称免疫凝集试验的基础。2 g  S( G+ a3 Q, a* i&

22、 F6 f       金溶胶颗粒的直径和制备时加入的柠檬酸三钠量是密切相关的，保持其他条件恒定，仅改变加入的柠檬酸三钠量，可制得不同颜色的金溶胶，也就是不同粒径的金溶胶，见附表。 8 x, E( q4 d8 F附表 100 ml 氯金酸中柠檬酸三钠的加入量对金溶胶粒径的影响' N2 q2 d6 T0 h% * W6 n# L       柠檬酸三钠ml 0.30 0.45 0.70 1.00 1.50 2.00: X% 4 % K9 5 + O       金溶胶颜

23、色 蓝灰 紫灰 紫红 红  橙红 橙$ 0 G3 C" W1 m1 c  s       吸收峰(nm)  220  240  535 525  522  518, t* ! , h% o( B2 w       径粒(nm)    147  97.5  71.5 41  24.5

24、0; 15% Q5 s1 D& I. v! j1 j（4）柠檬酸三钠鞣酸混合还原剂：  t) g5 M$ p  Q/ l$ " R  y( Y       用此混合还原剂可以得到比较满意的金溶胶，操作方法如下：取 4ml柠檬酸三钠 (Na3C6H5O7.2H2O)，加入05ml鞣酸，05ml 25mmo/L K2CO3（体积与鞣酸加入量相等），以双蒸馏水补至溶液最终体积为20ml，加热至60取1ml的 HAuCl4，加于79ml双蒸馏水中，水浴加热至60，然后迅速将上

25、述柠檬酸鞣酸溶液加入，于此温度下保持一定时间，待溶液颜色变成深红色(约需0.51小时)后，将溶液加热至沸腾，保持沸腾5分钟即可。改变鞣酸的加入量，制得的胶体颗粒大小不同。# i* _- T  u4 Q% Y& z(5）白磷还原法：7 _' 9 w" S0 Z+ N       在120ml双蒸馏水中加入1.5ml氯金酸和1.4ml 0.1mol/L K2CO3，然后加入1ml五分之一饱和度的白磷乙醚溶液，混匀后室温放置15分钟，在回流下煮沸 直至红褐色转变为红色。此法制得的胶体金直径约 6nm，并有很好的均匀

26、度，但白磷和乙醚均易燃易爆，一般实验室不宜采用。5 F" c0 c* M9 U* A8 t       要得到大小更均匀的胶体金颗粒，可采用甘油或蔗糖密度梯度离心，经分级后制得胶体金颗粒直径的变异系数（）可小于。* u# s: f0 w0 _胶体金标记技术路线的选择8 u& F5 G& w/ m8 l       (1)包埋剂 根据抗原或标记底物性质决定包埋剂种类。7 S0 Z# f/ f7 G. O       蛋白类，推荐使用K4M；包埋后立即切

27、片标记。5 v2 W( S; U' v) X! m       外泌蛋白可选择spurr。可长期保存使用。! J. P, I  O6 F! D8 , z8 U7 S       细胞结构组分，如纤维素、b-1,3-葡聚糖、几丁质、多酚化合物等，可选择spurr。5 l' t! K# m, w+ r# t' D9 l2 P(2)胶体金体积6 Z7 X5 9 N; H! z       精细定位如病毒、细胞器定位等选用5 nm胶体金。!

28、 D8 $ j' i& k       细胞壁组分采用15-20 nm胶体金。/ G% D4 D7 o  w" P# _/ D       多标记时，胶体金直径推荐选用6 nm、10 nm、15 nm；$ n: V- _9 r* V' p! s7 a- ) Y       稳定抗原采用较大颗粒胶体金。一般蛋白标记采用10 nm。$ r+ y* B: a( 7 v(3)通用探针选择&   H9 S

29、/ ?,        IgG-gold：-20°C可保存1年；但定位时胶体金距离标记位点较远，不适于精细定位。. j4 S0 g5 t& X8 I6 I       Protein A/G：-20°C可保存3个月；但定位时胶体金距离标记位点较近，适于精细定位和多标记。2 ?2 ( m) z% E: U% f2 Q, c       Protein A和Protein G与不同抗体之间的亲和性3 L' l" R7 V+ Z6 H&

30、#39; ?* P; _9 p$ 抗体来源2 g3 Q! h- ( W$ d) R" IIgG类型. k* A8 R3 U. s& u2 v' B! S与Protein A的亲和性0 i, C3 S' b; r7 Z与Protein G的亲和性* ?9 R! |3 W& i1 人9 I! A9 q  I' F  pIgG(正常)0 K6 X, o( A" q+: s6 X/ 6 n' 1 P# H* S, q7 V2 B+% i$ w5 B, h/ oIgG12 H) n* . s4 k

31、; p+. 6 |: m4 X. . k( T& +* N& s: k- w7 D& c; 6 IgG2! + O/ L2 U9 x& l  j+ i+% m6 j# E- o% I' l. h+4 * D  c; A. S6 t  V! F$ r3 v7 VIgG31 Q  H: k7 B% p. m! 6 , z' i: |& e7 S' d( G+' q1 l) c. ! M2 H% Y  r: oIgG4- z$ I

32、: r: j, Z, 8 % i5 T7 O$ D+5 S2 ?( 3 K) q. R& Y5 A+  t0 a/ M3 s. l* j; ) N小鼠(mouse)6 i" g) X8 d" S8 y$ X. E4 C' G$ qIgG1: & h7 f; |4 E+  S! q3 J( x$ Z- z$ _& +4   W1 v0 Q  " n. g% IgG2a8 5 H. e; R$ +/ m. ?) P" N5 l' ?- q+

33、3 h9 N0 k2 e" t- U0 j' |IgG2b- m. E6 L& ; +/ s" X  5 T3 5 l! +' Z  P3 _9 " o  ?! ?0 SIgG3* s! k# ) m$ t5 a4 c6 / x+; v. w) c# * |# N0 G% T1 g( C3 j+( j# A4 I% 2 D0 r* S% K大鼠(rat)0 k& P" f& U/ 7 k$ $ XIgG1: M- N  0 x9 y$

34、u& k2 L: i2 a  U4 W# J# W& t. z8 ( J" G: M+/ , n5 N9 f  D* IgG2a; 8 A. f6 S) 7 j4 O* ' n% O( ; S2 H: S4 e+( E2 T' U4 x. e% lIgG2b8 e" R2 Q+ v0 y0 ( L3 j6 P9 h0 6 p( z& j- x+ m& r8 T+4 f& s0 z$ v+ l  t6 sIgG2c' ?& W4 g$ q. 3

35、x3 ?+. C. s3 M* C! Q& q+: r( a4 W/ k. i! V" k1 o山羊(goat)& V' Z( x: l* Y4 hIgG+ C, $ i% 3 z& R% x: H+ T( q, A& z  A7 D) F, I0 O& w2 % u+7 C3 N' R: L. v" S$ x: ) I8 R绵羊(sheep)7 f- N: s8 z% S% h. 0 X, wIgG9 J* q/ e* h( C2 P# _9 |0 e+' j9 S2  

36、0;q: c6 # M+8 F/ 1 ) K' D家兔, x; r$ B( ! ' B3 x  x# CIgG# t: o+ 1 m- B! f! P8 2 % W# J7 n2 M# H+( - K' ' v- * u# t, w+" K$ R; d. x0 O& i狗3 t! h' V5 K/ d$ ! , RIgG# F5 J* e) r. Z8 o) + C- i! B+/ Y1 V5 ! X6 # Q& P+2 u. A* ' " M4 V. v猪+ " m6 u. i-

37、 8 E% K7 Q' f& mIgG, T+ x; P( B3 J& q& N+( o& S9 o5 G1 : ?" f+' Z9 o4 M, D- ?# E. i' z2 ; $ K鸡5 I! z* E; N( f# ?& sIgG1 M; 7 L' T6 N6 p( . E  N# 1 d) ?5 z# d9 k; g" I+/ E' o" h. q1 y8 n5 b马) y/ z. G3 W  T% Y/ F& IgG 

38、 V7 F# J) w; B  Z+, h. R: N. T: E) V) G+- C+ z% * P0 k9 X豚鼠(guinea-pig)  N* Q/ V  r( mIgG+ 4 % " 3 k& z: 0 N: g+& F' P1 Q/ Y( b& - f& + u, h- w9 P1 l' R# i仓鼠(hamster) _' n& m: 1 D4 SIgG6 V: & N% m# |+" w, b3 R1 ! Q+. I+

39、 " J: J. y* Z. j4 n猫; v+ f6 R- S# s5 3 EIgG2 o' F- A, ?! B; p  T3 O7 B! Y+- f2 / I1 ) Y: ?7 ?; R* R5 C  I2 U/ L& N5 I) o; f/ r小牛' M' j  r1 K3 s4 Q  i2 r  l# IIgG  p0 i( M; L' r% . S+" x- o: C: - a: s: l( G+'

40、; m' P& J2 v! m9 J+ K( j快速诊断之胶体金标记实验步骤胶体金标记实验步骤/ s. " b/ t0 g' O- b/ r6 9 q3 ) 0 L7 y4 _（1）蛋白质的处理：胶体金标记蛋白的制备  # - b# T: h' Q3 L* a# U, J7 j5 c胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。! S0 G

41、7 E- u4 S" q; S! _7 V1）待标记蛋白溶液的制备  将待标记蛋白预先对0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100 000g4离心1h，去除聚合物。8 w/ O7 F$ 1 l6 m! r2 c. K2）待标胶体金溶液的准备  以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl调胶体金液的pH值。标记IgG时，调至9.0；标记McAb时,调至8.2；标记亲和层析抗体时，调至7.6；标记SPA时，调至5.96.2；标记ConA时，调至8.0；标记亲和素时，调至910。8 b,

42、B" T1 h! _- k- S% o5 h由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板，因此，在调节pH时，采用精密pH试纸测定为宜。! y& n5 G5 A5 x0 P由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附，并可使溶胶聚沉，故致敏前应先对低离子强度的水透析。必须注意，蛋白质溶液应绝对澄清无细小微粒，否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。 9 4 o9 ( S: / % e2 J6 N4 q一般情况下应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在，因为它们都可吸附于颗粒表面而减弱胶体金对蛋白质的吸附。( X, a5 s. W9 f% G8 D, （2）蛋白质最适用量的选择：胶体金与标记蛋白用量之比的

43、确定! z3 W( r0 T2 ?: f: a7 C2 L6 h1）根据待标记蛋白的要求，将胶体金调好pH之后，分装10管，每管1ml。2 _( h3 |- F! Z. i1 E5 p2）将标记蛋白（以IgG为例）以0.005Mol/L pH9.0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5µg/ml50µg/ml，分别取1ml，加入上列金胶溶液中，混匀。对照管只加1ml稀释液。) Y7 S8 x, U2 A. r3）5min后，在上述各管中加入0.1ml 10NaCl溶液，混匀后静置2h，观察结果。& h* J8 d6 d, W, V4）结果观察，对照管（未加蛋白质）和加入蛋白质的

44、量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量，即为该标记蛋白质的最低用量，在实际工作中，可适当增加1020。& l# Y: a) W: t4 o将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后，分别取0.1ml(含蛋白质540ug)加到 1ml胶体金溶液中，另设一管不加蛋白质的对照管，分钟后加入0.1ml 10NaCl溶液，混匀后静置小时，不稳定的金溶胶将发生聚沉，能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10即为最佳标记蛋白量。4 w% J  p) T# d( d（3）标记：胶体金

45、与蛋白质（IgG）的结合  : % R. g1 ! j. 6 B8 B将胶体金和IgG溶液分别以0.1Mol/L K2CO3调pH至9.0，电磁搅拌IgG溶液，加入胶体金溶液，继续搅拌10min，加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀。常用稳定剂是5胎牛血清（BSA）和1聚乙二醇（分子量20KD）。加入的量：5BSA使溶液终浓度为1；1聚乙二醇加至总溶液的110。% E6 ?# q+ W( k% V" 在接近并略为高于蛋白质等电点的条件下标记是比较合适的，在此情况下蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。6 K" s% t6 t& J1

46、 ( O6 z4 z7 d下述标记步骤最为常见： 1 n) N# C+ h" / y4 p用0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl调节金溶胶至所需pH(标记时调到pH6.0)。: _$ ( H" S' T3 y& q: i8 F于100ml 金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液（体积为ml），搅拌分钟。. N/ M6 I1 i* L. E0 / M6 C  a; G; c加入5mlPEG20000溶液。; W% G, W) g8 o% l/ G于10000100000g离心3060分钟（根据粒径大小选择不同离心条件），小心吸

47、去上清液（切忌倾倒）。! Q( - S2 B8 将沉淀悬浮于一定体积含0.20.5mg/ml PEG20000的缓冲液中，离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，浓度以 1cm/540nm=1.5左右为宜，以 0.5mg/ml叠氮钠防腐，置4保存。  W: 3 R/ D9 S2 B  w包被后的金溶胶也可浓缩后于Sephadex G-200柱进行凝胶层析分离纯化，以含 0.1的缓冲溶液洗脱。通常用IgG包被的金溶胶洗脱液pH为8.2，以蛋白包被的金溶胶洗脱液为pH7.0。$ |$ h3 r  r9 c% n2 j: 以上操作中应注意，一切溶液

48、中不应含杂质微粒，可用高速离心或微孔滤膜预处理。- A, _3 V6 |+   ! G, J6 h8 p* M（4）胶体金标记蛋白的纯化$ o- T; V* j% q8 G5 t% E& e) _1）超速离心法：根据胶体金颗粒的大小，标记蛋白的种类及稳定剂的不同选用不同的离心速度和离心时间。) 7 l4 S5 - 7 E, D用BSA做稳定剂的胶体金羊抗兔IgG结合物可先低速离心（20nm金胶粒用1 200r/min，5nm金胶粒用1 800r/min）20min，弃去凝聚的沉淀。然后将5nm胶体金结合物用6 000g，4离心1h；20nm40nm胶体金结合物，14

49、 000g，4离心1h。仔细吸出上清，沉淀物用含1BSA的PB液（含0.02NaN3），将沉淀重悬为原体积的110，4保存。如在结合物内加50甘油可贮存于-18保存一年以上。/ q" 9 M1 E3 Q4 2 r3 A, B0 L为了得到颗粒均一的免疫金试剂，可将上述初步纯化的结合物再进一步用1030蔗糖或甘油进行密度梯度离心,分带收集不同梯度的胶体金与蛋白的结合物。! U% o) E: s5 J& K5 I2）凝胶过滤法：此法只适用于以BSA作稳定剂的胶体金蛋白结合物的纯化。将胶体金蛋白结合物装入透析袋，在硅胶中脱水浓缩至原体积的15110。再经1 500r/min离心20

50、min。取上清加至Sephacryl S-400（丙烯葡聚糖凝胶S-400）层析柱分别纯化。层析柱为0.8 cm×20cm，加样量为床体积的110，以0.02Mol/L PBS液洗脱（内含0.1BSA，0.05NaN3，pH8.2者用IgG标记物），流速为8ml/h。按红色深浅分管收集洗脱液。一般先滤出的液体为微黄色，有时略混浊，内含大颗粒聚合物等杂质。继之为纯化的胶体金蛋白结合物，随浓度的增加而红色逐渐加深，清亮透明，最后洗脱出略带黄色的为标记的蛋白组分。将纯化的胶体金蛋白结合物过滤除菌、分装,4保存。最终可得到7080的产量。( F1 $ C8 q3 N8 W" n(

51、9 W+ W% L3 g* B+ d7 7 Y胶体金蛋白结合物的质量鉴定- 4 q3 H5 n9 L2 C3 O+ |+ r0 S5 m3 h（1）胶体金颗粒平均直径的测量：用支持膜的镍网（铜网也可）蘸取金标蛋白试剂，自然干燥后直接在透射电镜下观察。或用醋酸铀复染后观察。计算100个金颗粒的平均直径。! 3 P- u3 a! B8 r* & Z（2）胶体金溶液的OD520nm值测定：胶体金颗粒在波长510nm550nm之间出现最大吸收值峰。用0.02Mol/L pH8.2 PBS液（含1BSA，0.02NaN3）将胶体金蛋白试剂作120稀释，OD5200.25左右。一般应用液的OD52

52、0应为0.20.4。- R, P  k0 D$ k/ W  k* f2 p% V（3）金标记蛋白的特异性与敏感性测定：采用微孔滤膜免疫金银染色法（MFIGSSA）。将可溶性抗原（或抗体）吸附于载体上（滤纸、硝酸纤维膜、微孔滤膜），用胶体金标记的抗体（或抗原）以直接或间接染色法并经银显影来检测相应的抗原或抗体，对金标记蛋白的特异性和敏感性进行鉴定。9 t9 a* E8 J' G; g$ W9 P快速诊断之胶体金制备注意事项及应用 i7&   v+ p, V- K( Y+ Z$ 胶体金的稳定性及免疫胶体金的贮存. _5 w

53、- % |+ R2 B0 ' D胶体金具有很高的动力学稳定性，在稳定因素不受破坏时自身凝聚极慢，可放置数年不发生凝聚。影响稳定的因素主要有电解质、溶胶浓度、温度、非电解质等。 ; g" |$ Z- W) B- C1 h$ h/ 8 n2 I金溶胶必须有少量电解质作稳定剂，但浓度不宜过高。高浓度亲水性非电解质能剥去胶粒外面的水化膜使其凝聚。少量的高分子物质促使溶胶凝聚，但一定量的高分子物质反而可增加溶胶稳定性，如蛋白质、葡萄糖、PEG20000等的加入有良好的稳定效果。: x# m. F; A$ Y. - s2 当金溶胶吸附蛋白质后，溶胶的稳定性随溶液pH而变化，而这种变化又取

54、决于吸附蛋白质的等电点，如ConA，过氧化物酶等，当pH较低时保持稳定，提高pH则显得不稳定，接近等电点或略高时又变得稳定了。标记后的胶体金溶液可用0.20.5mg/ml PEG20000 作为稳定剂。在410贮存数月有效，不宜冰冻。贮存中可能会发生程度不同的凝聚，可离心除去。5 R4 S* I' Z- j7 n- " n4 v" r: d$ f' G2 z* l8 J制备高质量胶体金的注意事项" t3 O  L7 ( X（1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲

55、洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。0 k$ r; V5 H& t9 w（2）试剂、水质和环境：剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的试剂经超滤或微孔滤膜（0.45µm）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。氯金酸极易吸潮，对金属有强烈的腐蚀性，不能使用金属药匙，避免接触天平称盘。其水溶液在可稳定数月不变。实验用水一般用双蒸馏水。实验室中的尘粒要尽量减少，否则实验的结果将缺乏重复性。: B: _# b. 0 w+ P金颗粒容易吸附于电极上使之堵塞，故不能用pH

56、电极测定金溶液的pH值。为了使溶液pH值不发生改变，应选用缓冲容量足够大的缓冲系统，一般采用柠檬酸磷酸盐(pH35.8)、Tris-HCL (pH5.88.3)和硼酸氢氧化钠(pH8.510.3)等缓冲系统。但应注意不应使缓冲液浓度过高而使金溶胶自凝。& T1 o7 G: _2 y- x（3）配制胶体金溶液的pH以中性（pH7.2）较好。& v/ x3 u7 T( r) B（4）氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最好是进口的。/ ?0 y% K8 ; w/ J5 W* o. O" A（5）氯金酸配成1水溶液在4可保持数月稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配制时，最好将整个小包

57、装一次性溶解。/ G+ k- 3 r% D+ t# A: V+ b- 5 n' P$ i( l( I' Q胶体金技术的应用3 G8 H" t: u' s1免疫学中的应用4 p: g3 T* U3 w1 5 Q6 K6 w# （1）胶体金在电镜水平的应用% k2 z& O+ x# Y* p3 胶体金应用电镜水平的研究最早，发展最快，应用最广泛。其最大优点是可以通过应用不同大小的颗粒或结合酶标进行双重或多重标记。直径为315nm 胶体金均可用作电镜水平的标记物。315nm 的胶体金多用于单一抗原颗粒的检测，而直径15nm 多用于检测量较多的感染细胞。( y

58、+ R% v- w3 m- D0 u胶体金用于电镜水平的研究，主要包括：. i9 T6 Q; d' c9 i. S) w 细胞悬液或单层培养中细胞表面抗原的观察。! D' a. a7 m$ _0 t1 | 单层培养中细胞内抗原的检测。; , W: h. T9 m 组织抗原的检测。. ' Y  / U6 X6 ?" H, o0 ) F金标记在电镜水平的应用，主要方法包括：包埋前染色、包埋后染色、免疫负染色、双标记技术和原位杂交技术等。 & x* k$ _) y: : U4 M( Y1 8 j实验证明，该法样本用量少、检测速度快、对比明

59、显、操作简单、敏感性和特异性高，既可用于抗原检测，也可用于抗体检测，因此，可同时适用于科研和诊断。) l: y# B1 z+ D: & r) D7 O（2）胶体金在光镜水平的应用: S4 _" u3 3 t* N  m胶体金同样可用做光镜水平的标记物，取代传统的荧光素、酶等。各种细胞涂片、切片均可应用。主要用于：- X& ?. P* O7 g! A% |( c8 G 用单克窿抗体或抗血清检测细胞悬液或培养的单层细胞的膜表面抗原。* H& ?* 0 ?0 S$ N, j 检测培养的单层细胞胞内抗原，0 s9 j8 y0 b3 U9 c 组织中

60、或亚薄切片中抗原的检测。 & p' s1 T: O6 C# d" V+ O" o胶体金用于光镜水平的研究，可以弥补其它标记物不可避免的本底过高和内部酶活性干扰等缺点。   _) J. z7 U* q) I& V（3）胶体金在流式细胞仪中的应用：, / M, Y, v6 t5 E应用荧光素标记的抗体，通过流式细胞仪计数分析细胞表面抗原，是免疫学研究中的重要技术之一。但由于不同荧光素的光谱相互重叠，区分不同的标记困难，因此必须寻找一种非荧光素标记物，用于流式细胞计数。这样可以同时进行几种标记。该标记物必须能够改变散射角，胶体金可以明显

61、地改变红激光散射角，因而可以作为流式细胞仪的标记物之一。% D3 W4 L- N$ a! i（4）凝集试验：单分散的免疫金溶胶呈清澈透明的溶液，其颜色随溶胶颗粒大小而变化，当与相应抗原或抗体发生专一性反应后出现凝聚，溶胶颗粒极度增大，光散射随之发生变化，颗粒也会沉降，溶液的颜色变淡甚至变成无色，这一原理可定性或定量地应用于免疫反应。+ M% y* g/ : z- 5 v（5）免疫印迹技术(immunoblotting)：免疫印迹是一种较新的免疫化学技术。用聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质分离，得到的区带转移至硝酸纤维素膜，然后用酶免疫法（或免疫荧光、）进行定量。( * P1 S: U3 X! X(

62、  _免疫胶体金也可用于该法的定量。转移后的硝酸纤维素膜与某特异性的抗体保温后，再与经葡萄球菌蛋白致敏的胶体金温育，彻底洗去多余的胶体金，根据膜上胶体金颗粒颜色深浅可测知样品中的特异性抗原。 , Q- Q1 ?: d" w/ t) Z; k+ M利用金颗粒可催化银离子还原成金属银这一原理，采用银显影剂增强金颗粒的可见性，更可大大提高测定灵敏度，检测下限可低至 0.1ng，这种免疫金银染色法应用已日趋广泛。1 . k5 A8 x7 k1 a6 K由于胶体金免疫印迹技术简便、快速，且有相当的高的灵敏度，在临床免疫诊断上有很大的应用潜力。: " o# _2 o

63、9 E0 ( N& ; g7 Y（6）胶体金在肉眼水平的应用5 4 I$ ?+ s( L0 E% u胶体金取代传统三大标记物，用于肉眼水平的免疫检测中。除了胶体金本身具有的特点外，还有以下优点：5 z2 Y" A$ w3 l/ 9 s试剂和样本用量极小，样本量可低至12ul；6 N( " # C4 d" z  T5 不需计数器、荧光显微镜、酶标检测仪等贵重仪器，更适于现场应用； ) d, * k# F" r没有诸如放射性同位素、邻苯二胺等有害物质参与；" B" g9 j+ + G实验结果可以长期保存；4 f

64、' T- h( v4 : y时间大大缩短，提高了检测速度。# j2 L/ Z3 D( A金标过程中，无共价键形成，是一定离子浓度下的物理吸附。因此几乎所有的大分子物质都可被金标记，标记后大分子物质活性不发生改变。实验结果表明，胶体金的敏感性可达到 ELISA的水平。而结合银染色时，检测的敏感性更大大提高。9 : r9 C/ J* b" e5 U7 Z; S; A& w# w( G5 h7 , p: U2 R( T2免疫诊断技术中的应用4 P) h( j0 k) P8 Y胶体金标记技术由于标记物的制备简便，方法敏感、特异，不需要使用放射性同位素，或有潜在致癌物质的酶显色底物，也不要荧光显微镜，它的应用范围广，除应用于光镜或电镜的免疫组化法外，更广泛地应用于各种液相免疫测定和固相免疫分析以及流式细胞术等。6 M9 D. t6 G. d（1）液相免疫测定：: g; o- V' |9 z6 y- J8 S将胶体金与抗体结合，建立微量凝集试验检测相应的抗原，如间接血凝一