生物制药 ppt课件

1、第六章 核酸类药物 本章主要内容本章主要内容 核酸类物质的分别提取及其发酵消费核酸类物质的分别提取及其发酵消费 主要核酸类药物的消费工艺主要核酸类药物的消费工艺本章要求本章要求1 1掌握酶解法制备核苷酸的方法掌握酶解法制备核苷酸的方法2 2掌握发酵法消费肌苷酸的根本方法；掌握发酵法消费肌苷酸的根本方法；3 3了解叠氮胸苷、阿糖腺苷等的消费方法；了解叠氮胸苷、阿糖腺苷等的消费方法；4 4了解核酸类药物的分类以及主要临床用途了解核酸类药物的分类以及主要临床用途第一节第一节 核酸类物质的分别提取及其发核酸类物质的分别提取及其发酵消费酵消费一、核酸一、核酸DNA与与RNA)的提取与制备的提取与制备 了

2、解了解 1、工业用、工业用RNA的提取的提取1RNA及其工业来源及其工业来源 2高高RNA含量酵母菌株的挑选含量酵母菌株的挑选 1.从自然界挑选从自然界挑选 2.诱变育种诱变育种3用工业废水培育高含量用工业废水培育高含量RNA酵母酵母 菌体在味精废水中菌体在味精废水中 复原糖复原糖0.7 总糖总糖 1.2 总氮总氮0.2 总磷总磷0.5 无机盐无机盐 0.1-0.2 驯化培育，发驯化培育，发酵酵24小时，小时，RNA含量含量8-10酵母菌主要生长在偏酸性的潮湿的含酵母菌主要生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中，例如，在水果、蔬菜、蜜糖环境中，例如，在水果、蔬菜、蜜饯的内部和外表以及在果园土壤中最饯的

3、内部和外表以及在果园土壤中最为常见。为常见。 物理诱变：射线、离子束、微波、超声波物理诱变：射线、离子束、微波、超声波化学化学 诱变：硫酸二乙酯诱变：硫酸二乙酯DFS亚硝基胍亚硝基胍NTG等等 生物诱变：病原微生物诱变，转基因诱变生物诱变：病原微生物诱变，转基因诱变 4RNA提取实例提取实例 碱解碱解230ml1.3%NaOH碱解液碱解液100g压榨啤酒酵母6mol/LHCL，pH7,15min 20,30min清液清液沉淀沉淀10，Ph2.56mol/LHCL离心置冷过夜置冷过夜1.8gRNA纯度80中和，离心 二二DNA的提取与制备的提取与制备 1工业用工业用DNA的提取的提取 粉碎新颖冷

4、冻鱼精新颖冷冻鱼精水，10015min浆状浆状鱼精鱼精加热去杂蛋白，离心含热变性含热变性DNA溶液溶液乙醇，丙酮纤维状纤维状DNA沉淀，离心95乙醇洗涤，减压枯燥DNA粗品粗品含含50-60热变性热变性DNA)2、生物活性、生物活性DNA的制备的制备 肝、脾、胸腺4倍生理盐水捣碎，匀浆匀浆液离心2500r/pm,30min沉淀1洗涤3次，悬浮生理盐水悬浮液捣碎，离心3min, 5SDS,搅拌搅拌2-3h, 0,2500r/pm上清液冷95乙醇离心纤维状DNA洗涤冷乙醇、丙酮减压、低温枯燥DNA粗品粗品粗品DNA蒸馏水，5SDS搅拌1h离心5000r/pm清液NaCL，95冷乙醇沉淀DNA沉淀洗

5、涤、真空枯燥乙醇、丙酮活性DNA二、核苷酸的制备方法熟习二、核苷酸的制备方法熟习 水解法水解法DNA或或RNA经酶或碱水解经酶或碱水解发酵法发酵法半合成法半合成法一酶解法及碱水解法制备核苷酸一酶解法及碱水解法制备核苷酸1.酶解法制备脱氧核苷酸酶解法制备脱氧核苷酸桔青霉产生核酸酶桔青霉产生核酸酶P1核酸酶核酸酶P1 酶法消费酶法消费5核苷酸的主要工业用酶核苷酸的主要工业用酶 来源：桔青霉来源：桔青霉(Penicillium citrinum)发酵发酵 催化特性：催化特性：1水解单链水解单链RNA和和DNA中的中的3-5磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯酶活力强磷酸二酯酶活力强2水解单核苷酸和寡核苷酸中

6、的水解单核苷酸和寡核苷酸中的3-磷酸单酯键磷酸单酯键2、酶解法制备、酶解法制备5单核苷酸单核苷酸 CMPCMPCMPCMP3、双酶法消费肌苷酸和鸟苷酸、双酶法消费肌苷酸和鸟苷酸IG I+G：呈味核苷酸：呈味核苷酸4菌体自溶法消费核苷酸菌体自溶法消费核苷酸 原理：磷酸二酯酶在适宜的条件下降解细胞内的原理：磷酸二酯酶在适宜的条件下降解细胞内的RNA可产生可产生5-核苷酸。核苷酸。1谷氨酸产生菌体自溶法消费谷氨酸产生菌体自溶法消费5-核苷酸工艺流程：核苷酸工艺流程：5碱水解法消费碱水解法消费2，3-混合核苷酸混合核苷酸 RNA水溶液水溶液33.5%碱解0.3mol/lNaoH保温38，16-20h水

7、解液中和6molL盐酸盐酸2，3-核苷酸核苷酸2,3环状磷酸酯分解RNA留意：酶法降解留意：酶法降解RNA得到的是得到的是5核苷酸核苷酸 碱水解法降解碱水解法降解RNA消费消费2，3混合核苷酸混合核苷酸二发酵法消费核苷酸二发酵法消费核苷酸 1发酵法消费肌苷酸发酵法消费肌苷酸IMP 菌种：产氨短杆菌菌种：产氨短杆菌 对菌种的要求：对菌种的要求： 1运用腺嘌呤缺陷型菌株解除腺嘌呤衍生物的反响运用腺嘌呤缺陷型菌株解除腺嘌呤衍生物的反响抑制抑制 2菌体本身的菌体本身的5核苷酸降解酶活力低核苷酸降解酶活力低 3选用选用Mn2+不敏感性变异株培育基中添加限量不敏感性变异株培育基中添加限量Mn2+，以添加细

8、胞膜的通透性，使肌苷酸在胞外大量，以添加细胞膜的通透性，使肌苷酸在胞外大量合成合成三半合成法制备核苷酸三半合成法制备核苷酸 工业消费的呈味核苷酸约有工业消费的呈味核苷酸约有40-50是由半合成法而制得是由半合成法而制得 半合成法制备核苷酸的根本道路：半合成法制备核苷酸的根本道路： 发酵法消费核苷发酵法消费核苷提取、精制提取、精制 磷酸化磷酸化 5-核苷酸核苷酸肌苷 氯化氧磷磷酸三乙酯，水磷酸化反响，2h5-IMP(产率91发酵三、核苷的制备三、核苷的制备 化学法化学法 发酵法发酵法 RNA化学水解法制备核苷化学水解法制备核苷1核苷消费工艺流程图核苷消费工艺流程图148 图图14.8 RNA经甲

9、酰胺化学水解制备核苷消费工艺流程图经甲酰胺化学水解制备核苷消费工艺流程图1.水解水解2.离子交换分别离子交换分别3.浓缩浓缩4.结晶结晶鸟苷腺苷尿苷胞苷磷酸鸟苷腺苷尿苷胞苷磷酸腺苷尿苷胞苷腺苷尿苷胞苷阳离子交换阳离子交换阴离子交换阴离子交换 阴离子交换阴离子交换二发酵法消费核苷二发酵法消费核苷 规模：规模： 千吨千吨/年年 优点：产量大，周期短，易控制。优点：产量大，周期短，易控制。 产核苷菌株的共同特点：产核苷菌株的共同特点： 选用磷酸单酯酶活力强的枯草芽孢杆菌或短小芽抱杆选用磷酸单酯酶活力强的枯草芽孢杆菌或短小芽抱杆菌的诱变出发菌株；菌的诱变出发菌株； 用物理或化学法挑选出诱变菌用物理或化

10、学法挑选出诱变菌 发酵培育时必需提供限量的生长要素，并且好氧，在发酵培育时必需提供限量的生长要素，并且好氧，在某一特定的范围内累积大量核苷。某一特定的范围内累积大量核苷。1发酵法消费肌苷发酵法消费肌苷 菌种：枯草杆菌菌种：枯草杆菌保藏斜面菌种32活化,20h消费斜面种32,15h一级种子液1%接种量32,8h二级种子液10%接种量1.2L发酵罐发酵液过滤，除菌体发酵清液阳离子交换树脂洗脱液活性炭吸附洗脱液减压浓缩、冷冻结晶肌苷粗品其它产肌苷菌种：产氨短杆菌第二节第二节 核酸类药物核酸类药物 核酸类药物的分类：核酸类药物的分类： 第一类：天然核酸类物质第一类：天然核酸类物质 与代谢妨碍疾病有关与

11、代谢妨碍疾病有关 第二类：自然构造碱基、核苷、核苷酸构造的类似物或第二类：自然构造碱基、核苷、核苷酸构造的类似物或聚合物聚合物 抗病毒、肿瘤、艾滋病药物，产生干扰素、免疫抑制抗病毒、肿瘤、艾滋病药物，产生干扰素、免疫抑制一、叠氮胸苷一、叠氮胸苷Azidothymidine，AZT一构造与性质一构造与性质 AZT是是1987美国美国FDA赞同的治疗艾滋病药赞同的治疗艾滋病药 二消费工艺二消费工艺 以胸苷为起始原料进展化学合成以胸苷为起始原料进展化学合成 工艺特点：原料来源少，合成道路复杂，本钱高。工艺特点：原料来源少，合成道路复杂，本钱高。叠氮胸苷的合成工艺道路叠氮胸苷的合成工艺道路 起始原料胸

12、苷的制备方法：起始原料胸苷的制备方法： DNA水解法水解法 主要方法主要方法 2-脱氧胞苷脱氧胞苷2-脱氧鸟苷脱氧鸟苷2-脱氧腺苷+胸腺嘧啶胸腺嘧啶大肠杆菌磷酸化酶胸苷鸟苷 胸腺嘧啶胸腺嘧啶嘌呤核苷磷酸化酶嘌呤核苷磷酸化酶嘧啶核苷磷酸化酶嘧啶核苷磷酸化酶5-甲基尿苷甲基尿苷胸苷化学法二、阿糖腺苷二、阿糖腺苷Adenine arabinoside一构造与性质一构造与性质 化学名：化学名：9-D-阿拉伯呋喃糖腺嘌呤，或称腺嘌呤阿拉阿拉伯呋喃糖腺嘌呤，或称腺嘌呤阿拉伯糖苷。伯糖苷。 已有合成方法：已有合成方法： 发酵法发酵法 酶转化法酶转化法 阿糖脲苷阿糖脲苷尿嘧啶磷酸化酶尿嘧啶磷酸化酶嘌呤核苷磷酸

13、化酶嘌呤核苷磷酸化酶阿糖腺苷阿糖腺苷二消费工艺二消费工艺1、酶、酶-化学合成法化学合成法 原料：尿苷原料：尿苷 过程：氧氯化磷和二甲基甲酰胺反响、水解反响、酶过程：氧氯化磷和二甲基甲酰胺反响、水解反响、酶法转化。法转化。 氧氯化磷氧氯化磷二甲基甲酰胺二甲基甲酰胺氧桥化合物氧桥化合物水解水解原料原料1原料原料2酶酶-化学合成法制备阿糖尿苷工艺道路化学合成法制备阿糖尿苷工艺道路化学催化化学催化酶催化酶催化酶催化酶催化三作用与用途三作用与用途 作用：广谱作用：广谱DNA病毒抑制剂，对单纯疱疹病毒抑制剂，对单纯疱疹、型，型，带状疱疹，巨细，牛痘等带状疱疹，巨细，牛痘等DNA病毒，在体内外都有明病毒，在

14、体内外都有明显抑制造用显抑制造用 用途：治疗单纯疱疹脑炎最好的抗病毒药物。用途：治疗单纯疱疹脑炎最好的抗病毒药物。 三、三氮唑核苷熟习三、三氮唑核苷熟习一构造与性质一构造与性质 商品名病毒唑，对商品名病毒唑，对DNA病毒、病毒、RNA病毒均有广泛作用。病毒均有广泛作用。 性质：白色结晶，熔点性质：白色结晶，熔点174176，易溶于水。，易溶于水。 特点：毒副作用小于特点：毒副作用小于AZT叠氮胸苷，价钱低廉，叠氮胸苷，价钱低廉， 不易产生抗药性不易产生抗药性二消费工艺二消费工艺 1.酶合成法酶合成法 微生物：产气肠杆菌微生物：产气肠杆菌底物：肌苷尿苷、鸟苷和三叠氮羧基酰胺底物：肌苷尿苷、鸟苷和

15、三叠氮羧基酰胺TCAN N尿苷尿苷核糖核糖1-磷酸磷酸嘧啶核苷嘧啶核苷磷酸化酶磷酸化酶嘌呤核苷磷酸化酶嘌呤核苷磷酸化酶尿尿苷苷 酶促法直接消费三氮唑核苷的方法：酶促法直接消费三氮唑核苷的方法： 1. 1. 双酶法：双酶法： 采用前段与后段由两个不同的酶催化，即前段采用前段与后段由两个不同的酶催化，即前段运用嘧啶核苷磷酸化酶运用嘧啶核苷磷酸化酶urose)urose)，后段运用嘌呤，后段运用嘌呤核苷磷酸化酶核苷磷酸化酶pynpasepynpase两种酶可同时由产气两种酶可同时由产气肠杆菌培育获得肠杆菌培育获得 2. 2.单酶法：单酶法： 前段及后段反响都利用嘌呤核苷磷酸化酶由前段及后段反响都利用

16、嘌呤核苷磷酸化酶由乙酰短杆菌培育获得乙酰短杆菌培育获得2. 化学合成法目前国内工业消费多采用化学合成法目前国内工业消费多采用肌苷法肌苷法三步：三步： 1.乙酰化醋酐冰醋酸乙酰化醋酐冰醋酸 2. 融熔缩合融熔缩合160-165，减压，减压 3.氨解甲醇溶液氨解甲醇溶液三废处置：三废处置： 催化剂、氨气、甲醇和副产物催化剂、氨气、甲醇和副产物 肌苷肌苷四乙酰核糖四乙酰核糖TCA双磷酸酯催化双磷酸酯催化三氮唑核苷三氮唑核苷鸟苷法：鸟苷法：三氮唑核苷收率三氮唑核苷收率50%3-3.5kg1kg水解鸟苷醋酐与冰醋酸水解核糖1-磷酸+TCA双磷酸酯缩合80%缩合物氨解鸟苷酸 3.发酵法日本报导发酵法日本报

17、导 培育基：培育基：1，2，4-三唑三唑-3-羧酰胺羧酰胺TCA、D-葡萄糖葡萄糖菌种：短杆菌、棒状杆菌、节核杆菌、微球菌或杆菌菌种：短杆菌、棒状杆菌、节核杆菌、微球菌或杆菌培育条件：室温培育培育条件：室温培育2-8天天 转化率为转化率为40-60%。 优点：直接从优点：直接从D-葡萄糖制备，三废易于治理。葡萄糖制备，三废易于治理。 缺陷：原资料单耗较大，葡萄糖用量为缺陷：原资料单耗较大，葡萄糖用量为1:560，TCA为为1:19。三作用与用途三作用与用途 广谱抗病毒广谱抗病毒DNA和和RNA病毒和抗肿瘤作用病毒和抗肿瘤作用 临床用于治疗流感、疱疹、肿瘤和肝炎临床用于治疗流感、疱疹、肿瘤和肝炎

18、四、阿糖胞苷四、阿糖胞苷 一构造与性质一构造与性质 别名：胞嘧啶阿拉伯糖苷，糖的组成部分是阿拉伯糖。别名：胞嘧啶阿拉伯糖苷，糖的组成部分是阿拉伯糖。 白色或类自色结晶性粉末，无臭，易溶于水，略溶于白色或类自色结晶性粉末，无臭，易溶于水，略溶于甲醇、乙醇中，乙醚中极微溶。甲醇、乙醇中，乙醚中极微溶。二消费工艺二消费工艺 1以以5CMP为原料的合成法为原料的合成法1工艺道路：工艺道路：2、工艺过程：、工艺过程： 水解：参与处置好的水解：参与处置好的6.5L 氢氧化镧凝胶，总体积为氢氧化镧凝胶，总体积为7.5L，升温至，升温至90，在不断搅拌下，于，在不断搅拌下，于pH9下进展水下进展水解。解。氧桥

19、化：冰盐浴中进展氧桥化：冰盐浴中进展 氨解：使氧桥断裂氨解：使氧桥断裂3，5-乙酰基零落乙酰基零落 。成盐：成盐： 2盐酸盐酸-甲醇甲醇 2、以葡萄糖酸钙为原料的合成道路、以葡萄糖酸钙为原料的合成道路 略略五、聚肌胞苷酸聚肌胞五、聚肌胞苷酸聚肌胞Poyinosinic，Polycytidylic Acid，Poly1：C一构造与性质一构造与性质干扰素诱导剂，由多聚肌苷酸和多聚胞苷酸组成的双干扰素诱导剂，由多聚肌苷酸和多聚胞苷酸组成的双股多聚核苷酸。具有广谱抗病毒作用股多聚核苷酸。具有广谱抗病毒作用 可溶于可溶于0.85氯化钠溶液。氯化钠溶液。二消费工艺二消费工艺1、底物、底物5-核苷二磷酸吡啶

20、盐的制备核苷二磷酸吡啶盐的制备5核苷酸核苷酸 5肌苷酸或肌苷酸或5胞苷酸吗啡啉双环胞苷酸吗啡啉双环己基碳二亚胺己基碳二亚胺 5核苷酸吗啡啉盐核苷酸吗啡啉盐三正丁胺磷酸盐无水吡啶三正丁胺磷酸盐无水吡啶5核苷酸二磷酸吡啶核苷酸二磷酸吡啶盐即盐即CDP吡啶盐，吡啶盐，IDP吡啶盐吡啶盐乙醇83回流2.固定化多核苷酸磷酸化酶的制备固定化多核苷酸磷酸化酶的制备 3将分别纯化的酶液滴参与冰浴中的载体，得到共价结合的固定化多核苷酸磷酸化。3、Poly I：C制备制备1底物预处置：底物预处置：CDP吡啶盐转成锂盐，吡啶盐转成锂盐，IDP转成钠盐。转成钠盐。2酶促反响：酶促反响： 每毫升反响液含每毫升反响液含m

21、olL数数IDP或或CDP 15；Tris 150；MgC126； EDTA 1；聚合；聚合酶酶5单位，单位，pH9.0，37，34小时。小时。用盐酸调用盐酸调pH1.52.0，使，使PolyI或或Poly C沉淀，立沉淀，立刻离心。以后在磷酸液冲液中溶解，等摩尔刻离心。以后在磷酸液冲液中溶解，等摩尔Poly I与与Poly C混合，生成产品混合，生成产品 。六、胞二磷胆碱六、胞二磷胆碱CDP-胆碱胆碱 Citico line，CDPcholine，Cytidine diphosphocholine 一构造与性质一构造与性质 化学名：胞嘧啶核苷化学名：胞嘧啶核苷-5-二磷酸胆碱钠盐二磷酸胆碱钠盐性质：白色无定形粉末，易吸湿，易溶于水，几不溶性质：白色无定形粉末，易吸湿，易溶于水，几不溶于乙醇、氯仿、丙酮等多数有机溶剂。于乙醇、氯仿、丙酮等多数有机溶剂。二消费工艺二消费工艺1、酶合成法、酶合成法 反响体系为：反响体系为： 产酶菌体：酵母泥产酶菌体：酵母泥 550mgm1底物：底物：CMP 20molml， 磷酰胆碱磷酰胆碱 30molml，KH2PO4NaOH缓冲液缓冲液pH8.0200molml，葡萄糖葡萄糖 1000